Текст очень длинный, поэтому разбит на части. Часть 1 из 4.
3 2. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ 4 2.1. МЕТОДЫ АНАЛИЗА 5 201040037-2023 2.1.4.37. МЕТАНОЛ И 2-ПРОПАНОЛ Требования общей фармакопейной статьи рас- пространяются на лекарственные средства – фар- мацевтические субстанции (настойки, настойки гомеопатические матричные, экстракты жидкие) и лекарственные препараты в жидких лекарствен- ных формах (настойки, экстракты, растворы спир- товые и др.), содержащие в своем составе этанол. Предельно допустимое содержание метано- ла в лекарственных средствах должно состав- лять не более 0,05 % и 2-пропанола – не более 0,05 %, при отсутствии других указаний в част- ной фармакопейной статье. Испытания на содержание метанола и 2-про- панола могут быть проведены методами паро- фазной газовой хроматографии (метод 1) и газо- вой хроматографии (метод 2). МЕТОД 1. ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола Р1 доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученно- го раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Испытуемый раствор. К 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта прибавляют 4,0 мл испытуе- мого образца, доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают, при необходимости фильтру- ют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор сравнения (а). К 1,0 мл метанола Р2 прибавляют 1,0 мл 2-пропанола Р2, доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (б). 5,0 мл этанола без- водного Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 25,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 100,0 мл и переме- шивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта, 2,0 мл раствора сравне- ния (а) и 2,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Условия хроматографирования: – колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покры- тая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диме- тил]силоксана Р толщиной 3 мкм; – газ-носитель: гелий для хроматографии Р; – скорость газа-носителя: 3 мл/мин; – деление потока: 1:50; – условия парофазной хроматографии: – температура уравновешивания: 85 °C; – время уравновешивания: 20 мин; – режим изменения температуры: Время (мин) Температура (°С) колонка 0 – 1,6 40 1,6 – 9,9 40 → 65 9,9 – 13,6 65 →175 13,6 – 20,0 175 блок ввода проб 200 детектор 200 – детектор: пламенно-ионизационный; – объем вводимой пробы: по 1 мл газовой фазы испытуемого раствора и раствора сравнения (в). Порядок элюирования веществ (раствор срав- нения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол. Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол – около 0,8; 2-пропанол – около 1,2; пропанол – около 1,6. Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)): – разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола. Содержание метанола в объемных процен- тах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S1 · S'2 S2 · S'1 · 40 где: S1 — площадь пика метанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S2 — площадь пика метанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); 2.1.4. ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ 6 S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).
Содержание 2-пропанола в объемных про- центах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S3 · S'2 S4· S'1 · 40 где: S3 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S4 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). МЕТОД 2. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. Испытуемый раствор. 4,0 мл испытуемого образца и 1,0 мл раствора внутреннего стандар- та доводят водой Р до объема 20,0 мл и переме- шивают, при необходимости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор сравнения (а). 1,0 мл метанола Р и 1,0 мл 2-пропанола Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного рас- твора доводят водой Р до объема 20,0 мл и переме- шивают. Раствор сравнения (б). 1,0 мл этанола без- водного Р доводят водой Р до объема 50,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта, 2,0 мл раствора сравнения (а) и 1,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Условия хроматографирования: – колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покры- тая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диме- тил]силоксана Р толщиной 3 мкм; – газ-носитель: гелий для хроматографии Р; – скорость газа-носителя: 3 мл/мин; – деление потока: 1:50; – режим изменения температуры: Время (мин) Температура (°С) колонка 0 – 1,6 40 1,6 – 9,9 40 → 65 9,9 – 13,6 65 →175 13,6 – 20,0 175 блок ввода проб 200 детектор 200 – детектор: пламенно-ионизационный; – объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуе- мого раствора и раствора сравнения (в). Порядок элюирования веществ (раствор сравнения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол. Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол – около 0,8; 2-пропанол – около 1,2; пропанол – около 1,6. Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)): – разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола. Содержание метанола в объемных процен- тах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S1 · S'2 S2 · S'1 · 40 где: S1 — площадь пика метанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S2 — площадь пика метанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). Содержание 2-пропанола в объемных про- центах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S3 · S'2 S4· S'1 · 40 где: S3 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S4 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). 7 201060011-2023 2.1.6.11. ИСПЫТАНИЕ ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ Общая фармакопейная статья описывает метод испытания на нейровирулентность живых вирусных вакцин. В каждом испытании используют не менее десяти обезьян (нечеловекообразных прима- тов), клинически здоровых и серонегативных по отношению к испытуемому вирусу. Каждой из обезьян в таламический отдел каждого полу- шария головного мозга вводят не менее 0,5 мл испытуемого образца при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.
Доза вакцины, введенной обезьяне, не должна быть меньше, чем разовая доза вакцины, рекомендо- ванная для человека. Для обнаружения возможной контамина- ции дикими нейровирулентными вирусами кон- трольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян, содержат совместно с группой иммунизированных обезьян или в непосред- ственной близости от них. Иммунизированных обезьян наблюдают 17 – 30 сут при отсутствии других указаний в частной фармакопейной ста- тье, а обезьян из контрольной группы – в тече- ние того же периода и дополнительно 10 сут. Во время наблюдения в группах отмечают возник- новение неврологических и других клинически важных симптомов. Гибель животных в первые 48 ч после инъекции считают неспецифического характера, а сами животные могут быть замене- ны другими. Результаты испытания являются достовер- ными, если: – не более 20 % иммунизированных обезьян погибают по неспецифическим причинам; – образцы сыворотки крови обезьян кон- трольной группы, отобранные во время имму- низации испытуемых животных и через 10 сут после эвтаназии последних, не имеют признаков инфекции, вызванной диким вирусом испытуе- мого типа или вирусом кори. По окончании периода наблюдения выпол- няют аутопсию и гистологическое изучение со- ответствующих отделов мозга для выявления признаков поражения центральной нервной системы. Испытуемый образец выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидае- мых клинических и гистологических признаков поражения центральной нервной системы, кото- рые могут быть вызваны введенным вирусом. 201060012-2023 2.1.6.12. ИСПЫТАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА С Испытание на бактериальные эндотокси- ны с использованием рекомбинантного фак- тора С (recombinant factor C, rFC) применяют для количественного определения эндоток- синов грамотрицательных бактерий. Испы- тания с использованием rFC, основанные на последовательности гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda), выпол- няют с использованием метода флуориметрии. Испытание осуществляют таким образом, чтобы избежать контаминации бактериальны- ми эндотоксинами. Рекомендации по применению испытания на бактериальные эндотоксины представлены в общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Приме- нение испытания на бактериальные эндотоксины. ОБОРУДОВАНИЕ Cтеклянную посуду и другое термостойкое оборудование депирогенизируют методом сухо- жаровой стерилизации, используя валидирован- ный процесс. Как правило, минимальное время и температура стерилизации составляют 30 мин при 250 °C. Если используют оборудование из полимерных материалов (например, микроти- тровальные планшеты и наконечники для авто- матических пипеток), необходимо подтвердить отсутствие на них поддающихся обнаружению эндотоксинов и других мешающих факторов. 2.1.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ 8 РЕАКТИВЫ Реактивы Рекомбинантный фактор С кодируется по- следовательностью гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda). Все ре- активы, включая флуорогенный субстрат и бу- ферный раствор для анализа, не должны содер- жать эндотоксины выше предела обнаружения. Растворы реактивов При необходимости реактивы готовят в соответствии с инструкцией производителя набора для испытания. Реактивы хранят охлаж- денными или замороженными в соответствии с инструкцией производителя. Вода для испытания на бактериальные эндотоксины Вода для инъекций Р или иная подходящая вода, не реагирующая с реактивом rFC на его пределе чувствительности.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСХОДНОГО РАСТВОРА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Исходный раствор стандартного образца эндотоксина готовят из стандартного образца эндотоксина, например, СО ФЕАЭС эндоток- сина, калиброванного относительно междуна- родного стандартного образца. Содержание бактериальных эндотоксинов в международном стандартном образце уста- навливается Всемирной организацией здраво- охранения и выражается в международных еди- ницах (МЕ). 1 МЕ эндотоксина эквивалентна 1 ЕЭ (единица эндотоксина). ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Исходный раствор стандартного образца эн- дотоксина энергично перемешивают и готовят подходящую серию разведений, используя воду для испытания на бактериальные эндотоксины. Во избежание потери активности вслед- ствие адсорбции растворы используют по воз- можности быстрее. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМЫХ РАСТВОРОВ Испытуемые растворы готовят путем растворе- ния или разведения испытуемого образца субстан- ции для фармацевтического применения или лекар- ственного препарата с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины. Для не- которых из них может быть более подходящим рас- творение или разведение в других водных раство- рах. При необходимости доводят рН испытуемого раствора так, чтобы после смешивания реактивов и испытуемого раствора значение рН полученной смеси находилось в диапазоне, указанном произ- водителем набора реактивов (обычно от 6,0 до 8,0). Значение рН доводят кислотой, основанием или подходящим буферным раствором в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов. Кислота или основание могут быть приготовлены из концентратов или твердых веществ с исполь- зованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины в контейнерах, не контаминирован- ных эндотоксинами. Буферные растворы не долж- ны содержать эндотоксины выше предела обнару- жения и другие мешающие факторы. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОГО РАЗВЕДЕНИЯ Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, позволяющее определить предельное содержание эндотоксина. МДР рас- считывают по формуле: МДР = ПСЭ · С λ где: ПСЭ — предельное содержание эндотоксинов; С — концентрация испытуемого раствора; λ — чувствительность лизата амебоцитов в международных единицах в миллилитре. Предельное содержание эндотоксинов для действующего вещества рассчитывают на осно- ве дозы лекарственного препарата для паренте- рального применения по формуле: ПСЭ = K M 9 где: K — предельная пирогенная доза эндоток- сина на килограмм массы тела; M — максимальная разовая доза лекар- ственного препарата на килограмм массы тела. Если лекарственный препарат вводится с ча- стыми интервалами или инфузионно, величина М соответствует общей максимальной дозе, вво- димой в течение 1 ч. Предельное содержание эндотоксинов выра- жают в единицах: МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/ЕД и др. Концентрацию испытуемого раствора выражают в единицах: – мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в массовых единицах (МЕ/мг); – ЕД/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/ЕД); – мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в объемных единицах (МЕ/мл). КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ФЛУОРИМЕТРИИ Метод используют для измерения флуорес- ценции (относительные единицы флуоресцен- ции, OEΦ), излучаемой флуоресцентным суб- стратом (реактивом) после его расщепления rFC, активируемым эндотоксином.
Используют метод определения флуоресцен- ции в конечной точке, основанный на количе- ственной зависимости концентрации эндотокси- на от флуоресценции смеси реактивов в конце инкубационного периода, выражаемой, напри- мер, как ΔOEΦ: ΔOEΦ = OEΦti – OEΦt0 где: OEΦti — флуоресценция смеси реактивов в конце инкубационного периода; OEΦt0 — флуоресценция смеси реактивов в начале инкубационного периода. Испытание выполняют при температуре ин- кубации в соответствии с инструкцией произво- дителя набора реактивов (обычно (37 ± 1) °C). ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ В ходе предварительных испытаний под- тверждают правильность выполнения метода. При этом должны выдерживаться требова- ния, предъявляемые к калибровочной кривой (см. раздел Критерии приемлемости калибро- вочной кривой стандартного образца эндо- токсина данной общей фармакопейной статьи), а испытуемый раствор не должен оказывать вли- яния на проведение испытания (см. раздел Ме- шающие факторы данной общей фармакопей- ной статьи). При внесении в условия испытания измене- ний, способных повлиять на его результаты, необ- ходимо провести валидацию методики испытания. КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Испытание должно быть выполнено для каждой серии реактива rFC. Чувствительность прибора должна быть настроена в соответствии с инструкцией произ- водителя набора реактивов для испытания. Для построения калибровочной кривой используют исходный раствор стандартного об- разца эндотоксина, из которого готовят не менее трех растворов с концентрациями эндотоксина в диапазоне, указанном производителем набора реактивов. Если требуемый для испытания ди- апазон превышает 2 lg диапазона, указанного производителем, необходимо использовать до- полнительные растворы эндотоксина с шагом lg. Выполняют испытание, используя не менее трех повторностей растворов каждой концентрации эндотоксина в соответствии с инструкцией про- изводителя (соотношение объемов, время инку- бации, температура, рН и др.). Абсолютное значение коэффициента корре- ляции | r | для диапазона приготовленных концен- траций эндотоксина должно быть не менее 0,980. МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Поскольку при проведении испытания c реактивом rFC фактор G не используется, то получения ложноположительных резуль- татов вследствие его активации β-глюканом не ожидается, что требует учета при сравнении 10 метода с другими методами количественной оценки бактериальных эндотоксинов. Концентрацию эндотоксинов выбирают око- ло центра калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с таблицей 2.1.6.12.-1. Выполняют испытание не менее чем на двух повторностях этих растворов в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов для испытания (объемы испы- туемого раствора и смеси реактивов, объемное соотношение испытуемого раствора и смеси ре- активов, время инкубации и др.). Результаты испытания считают достоверны- ми, если выполняются следующие условия: – абсолютное значение коэффициента кор- реляции калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина не менее 0,980; – результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC. Рассчитывают среднее значение открыва- емости добавленного эндотоксина, вычитая из среднего значения концентрации эндотокси- на в растворе B (содержащего добавленный эн- дотоксин, таблица 2.1.6.12.-1) среднее значение концентрации эндотоксина в растворе A (если эндотоксин обнаружен, таблица 2.1.6.12.-1).
Считают, что испытуемый раствор не содер- жит мешающих факторов, если в условиях ис- пытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор, находится в пределах 50 – 200 % от известной концентра- ции добавленного эндотоксина после вычитания любого эндотоксина, обнаруженного в растворе без добавления эндотоксина. Если значение открываемости эндотоксина выходит за пределы указанного диапазона, счи- тают, что испытуемый раствор содержит меша- ющие факторы. Повторяют испытание, исполь- зуя большее разведение, не превышающее МДР. Кроме того, влияние испытуемого раствора (в разведении, не превышающем МДР) можно устранить обработкой с помощью валидирован- ных методов, таких как фильтрация, нейтрали- зация, диализ, термическая обработка или эта- пы связывания, специфичные для эндотоксина (обогащение эндотоксина из испытуемого рас- твора до обнаружения при отсутствии мешаю- щей матрицы). Для установления эффективно- Таблица 2.1.6.12.-1. – Приготовление растворов для испытания Раствор Концентрация эндотоксинов Раствор, к которому прибавляют эндотоксины Количество повторностей A отсутствует испытуемый раствор ≥ 2 B средняя концентрация на калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина испытуемый раствор ≥ 2 C минимум 3 концентрации (наименьшую концентрацию обозначают λ) вода для испытания на бактериальные эндотоксины каждой концентрации ≥ 2 D отсутствует вода для испытания на бактериальные эндотоксины ≥ 2 Примечание. Раствор A – испытуемый раствор, разведение которого не превышает МДР. Раствор B (положительный контроль) – испытуемый раствор в таком же разведении, как и раствор A, содержащий добавленный эндотоксин в концентрации, близкой к центру калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Раствор C – раствор стандартного образца эндотоксина в концентрациях, используемых при валидации методики, как описано в разделе Критерии приемлемости калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина данной общей фармакопейной статьи. Раствор D (отрицательный контроль) – вода для испытания на бактериальные эндотоксины. 11 сти устранения мешающего влияния выбранным методом обработки без потери эндотоксинов повторяют испытание на мешающие факторы, добавляя к испытуемому раствору стандартный раствор эндотоксина, с последующей его обра- боткой выбранным методом. ИСПЫТАНИЕ МЕТОДИКА Проводят испытание по методике, описан- ной в разделе Мешающие факторы данной общей фармакопейной статьи. РАСЧЕТЫ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Рассчитывают концентрацию эндотоксинов для каждой повторности раствора A, используя калибровочную кривую стандартного образца эндотоксина, полученную на основании рас- твора C стандартного образца эндотоксина. Результаты испытания считаются достовер- ными, если выполняются следующие условия: – результаты, полученные для раствора C, соответствуют требованиям к валидации, указан- ным в разделе Критерии приемлемости калибро- вочной кривой стандартного образца эндоток- сина данной общей фармакопейной статьи; – открываемость эндотоксина, рассчитан- ная из концентрации эндотоксина, обнаружен- ной в растворе B, после вычитания концентра- ции эндотоксина, обнаруженного в растворе A, находится в диапазоне 50 – 200 %; – результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ Испытуемый образец выдерживает испытание, если средняя концентрация эндотоксинов в повторностях раствора A с учетом разведений и концентраций ниже предельного содержания эндотоксинов.
201060013-2023 2.1.6.13. ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ Настоящая фармакопейная статья представ- ляет методы для обнаружения или количествен- ного определения бактериальных эндотоксинов и пирогенов неэндотоксиновой природы с ис- пользованием моноцитов или моноцитарных клеток человека в испытаниях in vitro. Испытание на активацию моноцитов подхо- дит для замены испытания Пирогенность после валидации методики для конкретного лекар- ственного средства. Дополнительную информацию о практиче- ских аспектах испытаний можно найти в разде- ле Рекомендации по применению данной общей фармакопейной статьи. 1. ВВЕДЕНИЕ В основу методов на активацию моноцитов положена способность моноцитов или моно- цитарных клеток человека в присутствии пи- рогенных веществ продуцировать эндогенные медиаторы, в частности, провоспалительные цитокины (фактор некроза опухолей (ФНО-α), интерлейкин-1β (ИЛ-1β) и интерлейкин-6 (ИЛ-6) и др.). Провоспалительные цитокины принимают участие в патогенезе лихорадки, по- этому испытание на активацию моноцитов мо- жет выявлять весь спектр пирогенов в испытуе- мом образце. При испытании лекарственных средств, содержащих неэндотоксиновые пирогены (напри- мер, пептидогликаны, дрожжи, грибы, вирусы) или провоспалительные цитокины, часто получают очень крутые или нелинейные кривые зависимо- сти «доза – ответ», в сравнении с кривыми зависи- мости «доза – ответ» эндотоксинов. Лекарствен- ные средства, которые могут содержать пирогены, отличные от бактериальных эндотоксинов, необ- ходимо испытывать в диапазоне концентраций, включающих минимальное разведение. В данной общей фармакопейной статье пред- ставлены три метода. Метод 1. Количественное испытание. Метод 2. Полуколичественное испытание. Метод 3. Сравнительное испытание с кон- трольной серией (серия, утвержденная в каче- стве контрольной). Испытания проводит таким образом, чтобы избежать контаминации пирогенами. 2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Максимально допустимое разведение представляет собой наибольшее разведение 12 испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое содержание пирогена. Максимально допустимое разведение рассчитывают по формуле: МДР = ПСП · С Предел обнаружения где: ПСП — предельное содержание пирогенов; С — концентрация испытуемого раствора. Поскольку предел обнаружения не всегда известен заранее, для расчета максимально до- пустимого разведения могут быть использова ны архивные данные. Критерием приемлемости для принятия положительного или отрицательного решения является предельное содержание пирогенов, которое выражают в эквиваленте единиц эн- дотоксина на миллиграмм или миллилитр, или на единицу биологической активности лекар- ственного средства. Предельное содержание пирогенов рассчи- тывают по формуле: ПСП = K M где: K — предельная пирогенная доза бактери- ального эндотоксина из расчета на ки- лограмм массы тела; М — максимальная разовая доза испы- туемого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела. В случае введения лекарственного препа- рата через частые интервалы или инфузионно, в качестве «М» используют общую максималь- ную дозу, введенную в течение одного часа. В случае, когда для лекарственного средства установлено предельное содержание эндоток- сина, предельное содержание пирогенов будет равно предельному содержанию эндотоксинов, при отсутствии других указаний в частной фар- макопейной статье.
В этом случае концентрация испытуемого раствора выражается: ‒ в мг/мл, если предельное содержание эндоток- синов установлено в массовых единицах (МЕ/мг); ‒ в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед); ‒ в мл/мл, если предельное содержание эндо- токсинов выражено в объемных единицах (МЕ/мл). Эквиваленты эндотоксина ‒ значения кон- центрации пирогенного вещества, вычисленные по кривой «доза – ответ» стандартного образца эндотоксина (метод 1) или значения, рассчиты- ваемые путем сравнения реакций с растворами стандартного образца эндотоксина (метод 2). Исходный раствор готовят из стандартного об- разца эндотоксина, калиброванного относитель- но Международного стандарта эндотоксина, например СО ФЕАЭС эндотоксина. Предел обнаружения определяют с исполь- зованием калибровочной кривой стандартно- го образца эндотоксина. Предел обнаружения представляет собой концентрацию эндотоксина, равную предельному значению, выраженному в единицах, соответствующих показаниям де- тектирующих приборов (например, для им- муноферментного анализа используют погло- щение (оптическую плотность). Для целей данногоиспытанияпределобнаружениявыражают как эквивалент эндотоксина на миллилитр. Предельное значение рассчитывают по фор- муле: X _ + 3s где: X _ — среднее значение четырех повтор- ностей реакций на отрицательный контроль (R0); s — стандартное отклонение четырех повторностей реакций на отрица- тельный контроль (R0). 3. ОБЩАЯ ПРОЦЕДУРА Испытуемый раствор инкубируют с источни- ком моноцитов человека или с линией моноци- тарных клеток человека. Источником моноцитов человека могут быть: гепаринизированная пери- ферическая кровь человека, отобранная не более, чем за 4 ч до испытания; моноцитсодержащая фракция крови, например, мононуклеарные клет- ки периферической крови человека, выделенные центрифугированием в градиенте плотности. Гепаринизированную периферическую кровь человека обычно разводят культуральной сре- дой или физиологическим раствором, например, до концентрации от 2 % до 50 % (об/об). Монону- клеарные клетки периферической крови человека или линии моноцитарных клеток в культуральной среде с добавлением плазмы донора или сыво- 13 ротки АВ (IV группа крови) обычно используют при окончательной плотности клеток 0,1 – 1,0×106 клеток на лунку, пробирку или другую емкость. При использовании линий моноцитарных клеток сыворотку АВ можно заменить на фетальную бы- чью сыворотку, инактивированную нагреванием. Культура клеток готовится при температуре (37 ± 1) °С в подходящей атмосфере для культу- ральной среды, например, увлажненном воздухе с 5 % СО2. Продолжительность культивирования должна быть достаточной для накопления мар- керов пирогена. Реакцию выбранного маркера, например, провоспалительного цитокина, срав- нивают с реакциями на стандартный образец эндотоксина или контрольную серию испытуе- мого препарата. 4. ОБОРУДОВАНИЕ Всю стеклянную посуду и другой расход- ный материал, устойчивую к нагреванию, депи- рогенизируют в стерилизационном воздушном шкафу с использованием валидированной про- цедуры. Общепринятым минимальным режи- мом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °С не менее 30 минут. Если используют пластиковый материал, в частно- сти микропланшеты и наконечники для автома- тических пипеток, необходимо убедиться, что данное оборудование не содержит пирогенов и не влияет на испытание. 5. ИСТОЧНИКИ КЛЕТОК И КВАЛИФИКАЦИЯ 5.1.
ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ Цельную кровь получают от доноров или от пулов цельной крови, которые квалифициру- ют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 5.2. МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Мононуклеарные клетки перифериче- ской крови выделяют из крови, полученной от доноров или из пулов цельной крови, которые квалифицируют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фарма- копейной статьи. 5.3. КВАЛИФИКАЦИЯ ДОНОРОВ Доноры крови должны соответствовать при- веденным квалификационным критериям на- ряду с другими действующими требованиями в отношении согласия на процедуру, здоровья, безопасности и этических принципов. Доно- ры должны описывать себя как «здоровые», «не страдающие любыми бактериальными или вирусными инфекциями» и «не имеющие симптомов любой инфекции в течение пери- ода не менее одной недели перед сдачей кро- ви». Доноры не должны принимать нестеро- идные противовоспалительные лекарственные препараты в течение 48 ч перед сдачей крови и стероидные противовоспалительные лекар- ственные препараты – в течение 7 дней перед сдачей крови. Лица, которым были назначены иммунодепрессанты или другие лекарствен- ные препараты, которые влияют на выработ- ку выбранных показателей, не могут быть до- норами крови. Донорская кровь должна быть обследована на инфекционные маркеры в со- ответствии с национальными требованиями по трансфузиологии. 5.4. КВАЛИФИКАЦИЯ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЕННЫХ ОТ РЯДА ДОНОРОВ Пулы (цельной крови или компонентов крови, например мононуклеарные клетки пери- ферической крови) должны состоять из порций крови минимум от четырех индивидуальных доноров, но предпочтительно от восьми или бо- лее доноров; пулы формируются путем отбора от каждого пакета донорской крови приблизи- тельно одинаковых объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови. Для квалификации объединенных в пул клеток действуют следующим образом: в течение 4 ч с момента сбора крови строят кривые «доза – ответ» для пула с использованием рас- творов стандартного образца эндотоксина в не менее чем четырех разведениях, например, в диапазоне от 0,01 МЕ/мл до 4 МЕ/мл. Кривые «доза – ответ» должны отвечать двум критериям для калибровочной кривой, описан- ным в разделе 6.1 данной общей фармакопей- ной статьи. Если пул должен использоваться для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, то пулы должны быть квалифицированы, как опи- сано в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи. При объединении клеток, эффект усред- нения должен учитываться при утверждении ста- 14 туса соответствия («соответствует» или «не соот- ветствует») спецификации данного продукта. 5.5. КВАЛИФИКАЦИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК В качестве источника клеток в испытании на активацию моноцитов могут быть использо- ваны криоконсервированные клетки, например, кровь доноров, мононуклеарные клетки перифе- рической крови или моноцитарные клеточные ли- нии. Пулы криоконсервированных клеток полу- чают объединением перед замораживанием, или объединением единичных криоконсервирован- ных донорских порций сразу же после оттаивания. Квалификацию криоконсервированной крови или клеток выполняют сразу же после оттаивания (и объединения, в случае необходимости). Кри- вые «доза – ответ» для криоконсервированных крови или клеток должны отвечать двум крите- риям для калибровочной кривой, описанным в разделе 6.1 данной общей фармакопейной ста- тьи.
Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их квалификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 5.6. НЕПРЕРЫВНАЯ ЛИНИЯ МОНОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК Моноцитарные клеточные линии подходят для обнаружения бактериальных эндотоксинов, но имеют ограниченное применение для обна- ружения неэндотоксиновых пирогенов. Линию моноцитарных клеток необходимо постоянно культивировать для обеспечения достаточного количества клеток при использовании в испыта- нии на активацию моноцитов. Для оптимизации метода можно использовать клоны, полученные из клеточной линии. Клеточные линии должны поддерживаться в асептических условиях и регулярно контроли- роваться на контаминацию микоплазмами. Кро- ме того, клетки должны регулярно проверяться на идентичность (например, время удвоения, морфология и функции) и стабильность. Функциональная стабильность клеточ- ной линии оценивается путем наблюдения за ее состоянием с учетом количества пасса- жей в процессе рутинных испытаний. Должны быть установлены критерии функциональной стабильности, которые могут включать крите- рии роста, максимальную реакцию, получен- ную в испытании, фоновый шум и экспрессию рецептора. Экспрессию рецептора можно про- верить с помощью специфических лигандов, на- пример, липополисахарида для толл-подобного рецептора 4 (TLR4), липотейхоевой кислоты для толл-подобного рецептора 2 (TLR2), син- тетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR1 или синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR6 или флагеллина. Кривые зависимости «доза – ответ» долж- ны соответствовать двум критериям калибро- вочной кривой стандартного образца эндоток- сина, описанным в разделе 6.1 данной фарма- копейной статьи. Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их ква- лификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 6. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ Для обеспечения прецизионности и точно- сти испытания на активацию моноцитов про- водят предварительные испытания, в которых проверяют выполнение критериев для кривой стандартного образца эндотоксина, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать эндоток- сины и неэндотоксиновые пирогены, отсутствие влияния растворов на детектирующую систему. Проведение испытаний на мешающие факторы требуется, если в условия эксперимента вносят- ся какие-либо изменения, которые могут повли- ять на его результат. 6.1. КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ ДЛЯ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Из раствора стандартного образца эндоток- сина готовят не менее 4 растворов с различными концентрациями эндотоксина для построения калибровочной кривой. Проводят испытание, используя не менее 4 повторностей каждой концен- трации раствора стандартного образца эндотокси- на. Базовое высвобождение выбранного маркера в отсутствие добавленного раствора стандартно- го образца эндотоксина должно быть оптимизи- ровано до наиболее низкого возможного уровня (например, при использовании иммунофермент- ного анализа оптическая плотность ниже 0,1). Для калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина должны выполняться два критерия приемлемости: 15 ‒ регрессионная зависимость ответов (со- ответственно преобразованных при необходи- мости) от lg дозы должна быть статистически значима (р < 0,01); ‒ регрессионная зависимость ответов на lg дозы не должна существенно отличаться от ли- нейности (р > 0,05) (2.3.12.0). 6.2.
ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Для обеспечения точности испытания про- водят предварительные испытания, подтверж- дающие отсутствие влияния испытуемого об- разца на результаты испытания. Используя подходящий растворитель, готовят разведения испытуемого образца в геометрической прогрес- сии (1:2, 1:4 и т.д.) не превышающие максималь- но допустимого разведения. Аналогично готовят разведения испытуемого образца и прибавляют эндотоксин в соответствующей концентрации. В качестве альтернативы можно использовать разбавитель, содержащий добавленный эн- дотоксин в соответствующей концентрации. В обоих случаях соответствующая концентра- ция эндотоксина равна или близка к середине калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина (метод 1) или вдвое превышает рас- четное значение предела обнаружения (метод 2). Проводят испытания полученных рядов разведений параллельно в одном эксперименте. Для вычисления концентрации эквивалентов эн- дотоксина в каждом растворе используют кали- бровочную кривую. Вычисляют среднее значение открывае- мости добавленного эндотоксина в растворе с добавлением стандартным образцом эндоток- сина. Для этого из концентрации эквивалента эндотоксина в растворе с добавленным стан- дартным образцом эндотоксина вычитают сред- нюю концентрацию эквивалента эндотоксина в растворе (при его наличии). Считают, что испытуемый раствор не со- держит мешающих факторов, если в условиях испытания вычисленная концентрация эквива- лентов эндотоксина в испытуемом растворе с добавлением стандартного образца эндотоксина находится в пределах от 50 % до 200 % от из- вестной концентрации добавленного стандарт- ного образца эндотоксина, после вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина, обна- руженных в растворе без добавления стандарт- ного образца эндотоксина. Если испытание не отвечает этому критерию, следует провести ис- пытание методом 3. В методе 3 разведения исследуемых и кон- трольных серий зависят от типа анализа, ис- пользуемого для сравнения между ними. Тип анализа должен быть обоснован и валидирован для каждого лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Например, испытания проводят на 3 разведениях испыту- емого образца: наибольшая концентрация (наи- меньшее разведение), при котором наблюдают наибольшее высвобождение выбранного марке- ра, и двукратные разведения непосредственно выше и ниже выбранного разведения. В связи с тем, что концентрация испытуемого образца с наибольшим высвобождением выбранного мар- кера может зависеть как от особенностей клеток или крови донора, так и серии лекарственного средства, должна быть проведена валидация методики в отношении конкретного лекарствен- ного средства в трех независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров. Наибольшая концентрация (наименьшее разведение), при которой реги- стрируется наибольшее высвобождение выбран- ного маркера у большинства доноров и двукрат- ные разведения непосредственно ниже и выше выбранного разведения, считаются пригодны- ми для дальнейшего выполнения испытания. Если наибольшее высвобождение выбранно- го маркера происходит при испытании исходного испытуемого раствора, то последующее испы- тание должны выполнять с использованием не- разведенного (исходного) испытуемого раство- ра, а также испытуемого раствора, разведенного в соотношениях 1:2 и 1:4 перед его добавлением к моноцитарным клеткам. Степень разведения для этих трех растворов обозначают как f1, f2 и f3.
Если содержание пирогена в образце исход- но высокое, то целесообразнее использовать мо- дель параллельных линий для анализа кривых «доза – ответ» для испытуемой и контрольной серий. В таком случае, растворы испытуемых образцов испытывают в 3 или более геометри- ческих разведениях, которые охватывают ди- апазон кривой «доза – ответ», используемый для выбранного анализа (2.3.12.0). 16 6.3. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЭНДОТОКСИНОВЫХ ПИРОГЕНОВ В предварительных испытаниях также под- тверждают способность выбранной тест-си- стемы обнаруживать не только бактериальные эндотоксины, но и неэндотоксиновые пирогены. Пригодность метода для конкретного лекарствен- ного средства должна быть проверена. Для этого можно использовать архивные серии, наличие в которых неэндотоксиновых пирогенов было определено по положительным реакциям в ис- пытании Пирогенность или при развитии лихо- радочных реакций у человека. При отсутствии таких серий лекарственных средств, предвари- тельные испытания должны включать валидацию используемой методики с использованием не ме- нее двух неэндотоксиновых лигандов толл-по- добных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевой кислоты, синтетических бакте- риальных липопротеинов, флагеллина и неочи- щенного бактериального экстракта цельных кле- ток. Выбор неэндотоксинового пирогена должен отражать наиболее вероятное загрязнение иссле- дуемого лекарственного средства. 6.4. ВЛИЯНИЕ НА СИСТЕМУ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ Определяют оптимальное разведение рас- твора испытуемого образца и проверяют его влияние на систему детектирования (например, иммуноферментного анализа) для выбранного маркера. Различие в определяемых концентра- циях разведений стандарта выбранного маркера в присутствии и отсутствии испытуемого образ- ца должно находиться в диапазоне ± 20 % погло- щения (оптической плотности). 7. МЕТОДЫ 7.1. МЕТОД 1: КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ Метод 1 основан на сравнении реакции испы- туемого лекарственного средства с калибровочной кривой раствора стандартного образца эндотокси- на. Концентрация пирогенных веществ в испытуе- мом лекарственном средстве не должна превышать значение предельного содержания пирогенов. 7.1.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-1. Квалифицированные клетки культивируют в четырех повторностях с каждым из растворов. 7.1.2. Вычисления и обработка результатов Для обработки результатов используют дан- ные, относящиеся к клеткам, соответствующие двум критериям калибровочной кривой стан- дартного образца эндотоксина. Для каждого источника клеток (индивидуальное донорство, донорский пул или клеточная линия) при расче- те концентрации эквивалентов эндотоксина в ка- ждой из повторностей растворов A, B, C, AS, BS и CS используют калибровочную кривую R1-R4. Открываемость эквивалентов эндотоксина, рассчитанная путем вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина в растворе А, B, C из концентраций эквивалентов эндотоксина в растворе AS, BS и CS, соответственно, должна находится в диапазоне от 50 % до 200 %. Разве- дения, не соответствующие данным условиям, исключают из дальнейшей обработки. Испытуемое лекарственное средство отвечает требованиям испытаний для конкретного источ- ника клеток, если средние концентрации эквива- лентов эндотоксина, полученные в повторностях раствора А, В и С, с учетом поправок на разведе- ние, меньше предельного содержания пирогенов, установленного для испытуемого лекарствен- ного средства. Одно отвечающее требованиям разведение является минимальным требованием для признания пригодности испытания.
7.1.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства При использовании клеток от индивиду- альных доноров, испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание, проведенное с клетками от каждого из четы- рех различных доноров. Если испытуемое ле- карственное средство выдерживает испытание с клетками от трех из четырех доноров, то ис- пытание продолжают с клетками от других че- тырех доноров, клетки от которых не исполь- зовались в первом испытании. Испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с клетками от семи из восьми раз- личных доноров (то есть, допускается только одна положительная реакция при использова- нии клеток от восьми доноров). Если источник моноцитов представляет собой клетки, объе- диненные от ряда индивидуальных доноров, испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с одним пулом клеток. При использовании линии моноцитар- 17 Таблица 2.1.6.13.-1. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор Добавленный эндотоксин (МЕ/мл) Число повторностей А испытуемый раствор / f нет 4 В испытуемый раствор / 2 × f нет 4 С испытуемый раствор / 4 × f нет 4 AS испытуемый раствор / f середина калибровочной кривой (R3) 4 BS испытуемый раствор / 2 × f середина калибровочной кривой (R3) 4 CS испытуемый раствор / 4 × f середина калибровочной кривой (R3) 4 R0 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель нет (отрицательный контроль) 4 R1-R4 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель 4 концентрации раствора стандартного образца эндотоксина 4 каждой концентрации Примечание. ƒ – разведение раствора. Раствор A – раствор испытуемого лекарственного средства в наименьшем разведении ƒ, при котором было прове- дено испытание на мешающие факторы, то есть наибольшая концентрация (наименьшее разведение), для которой открываемость эндотоксина находится в пределах от 50 % до 200 %. Раствор B – двукратное разведение раствора A, не превышающее максимально допустимого разведения. Раствор C – двукратное разведение раствора B, не превышающее максимально допустимого разведения. Раствор AS – раствор A, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор BS – раствор B, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор CS – раствор C, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор R0 – отрицательный контроль. Растворы R1-R4 – растворы стандартного образца эндотоксина в концентрациях, использованных в испытании на мешающие факторы. ных клеток человека, испытуемое лекарствен- ное средство должно выдерживать испытание с одним соответствующим пассажем клеток. 7.2. МЕТОД 2: ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ При испытании методом 2 проводят срав- нение испытуемого лекарственного средства со стандартным образцом эндотоксина. Кон- центрация пирогена в испытуемом лекарствен- ном средстве должна быть меньше предельного содержания пирогенов. Для принятия решения о соответствии испытания используют раствор А, при отсутствии другого обоснования и разре- шения уполномоченного органа. 7.2.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-2. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях. 7.2.2.
Вычисления и обработка результатов Все результаты, включаемые в анализ дан- ных, должны быть связаны с клетками, для ко- торых среднее значение откликов на растворы R0-R4 увеличиваются в прогрессии. Среднее значение откликов на R0 может быть равным среднему значению откликов на R1. Для каж- дого конкретного источника клеток, среднее значение откликов на раствор R2 должно быть 18 Таблица 2.1.6.13.-2. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор Добавленный эндотоксин (МЕ/мл) Число повторностей А испытуемый раствор / f нет 4 B испытуемый раствор / f1 нет 4 С испытуемый раствор / f2 нет 4 AS испытуемый раствор / f стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 BS испытуемый раствор / f1 стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 CS испытуемый раствор / f2 стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 R0 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель нет (отрицательный контроль) 4 R1 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 0,5 × предел обнаружения для используемой системы 4 R2 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 1 × предел обнаружения для используемой системы 4 R3 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 R4 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 4 × предел обнаружения для используемой системы 4 Примечание. f, f1, f2 – степень разведения раствора. Раствор А – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f, при котором было проведено испытание на мешающие факторы. Раствор В – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f1 не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например 1:2 × максимально допустимое разведение (то есть, разведение в два раза меньше, чем максимально допустимое разведение). Раствор С – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f2 не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например максимально допустимого разведения. Раствор AS – раствор А с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы (как определено в предварительном испытании). Раствор BS – раствор В с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор CS – раствор С с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R0 – отрицательный контроль. Раствор R1 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 0,5 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R2 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 1 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R3 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R4 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 4 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. 19 больше положительного предельного значе- ния.
Результаты ниже этого положительного предельного значения рассматриваются как отрицательный отклик. Если среднее значе- ние ответных реакций на R1 или R2 превыша- ют предельное значение, то отклик на раствор, выбранный для оценки соответствия или не- соответствия лекарственного средства требо- ваниям, должен быть отрицательным (лекар- ственное средство выдерживает испытание). Для определения открываемости (%) добав- ки для каждого отрицательного раствора ис- пытуемого лекарственного средства (A, B и C) сравнивают среднее значение отклика соответ- ствующих растворов с добавленным стандарт- ным образцом эндотоксина (AS, BS или CS, соответственно) со средним значением отклика раствора R3. Если раствор испытуемого лекарственного средства, выбранный для оценки соответствия или несоответствия, и все разведения ниже его дают отрицательные результаты и определяе- мая концентрация добавленного стандартного образца эндотоксина находится в диапазоне от 50 % до 200 %, то концентрация пирогенного вещества в испытуемом лекарственном сред- стве меньше предельного содержания пироге- нов для данного источника клеток. 7.2.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства Критерии те же, что и для Метода 1 (см. раз- дел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи). 7.3. МЕТОД 3: СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ С КОНТРОЛЬНОЙ СЕРИЕЙ При испытании методом 3 проводится срав- нение испытуемого лекарственного средства с валидированной серией этого лекарственного средства, выбранной в качестве контрольной. Тип анализа, выбранный для их сравнения, дол- жен быть обоснован и подтвержден для каждо- го лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Контрольная серия также выбирается в соответствии с обоснован- ными и утвержденными критериями. Данное испытание предназначено для случаев, когда ис- пытуемое лекарственное средство оказывает за- метное мешающее действие, но не может быть разведено в диапазоне максимально допустимо- го разведения для его устранения, или предпо- лагается, что лекарственное средство содержит неэндотоксиновые пирогены. Реакции на неэндотоксиновые пирогены мо- гут быть более быстрыми и выраженными, чем реакции на эндотоксины, что делает необходи- мым выполнение испытания в диапазоне разве- дений, включающем минимальное разведение. Процедура испытания описана в разделе 7.3.1 данной общей фармакопейной статьи и включа- ет пример анализа, используемого для сравне- ния испытуемой серии с контрольной серией. 7.3.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-3. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях. 7.3.2. Вычисления и обработка результатов Все результаты, включаемые в обработку данных, должны быть получены на клетках, у которых раствор G и хотя бы один из растворов А, В и С вызывал ответную реакцию, превыша- ющую минимальный уровень высвобождения выбранного маркера (раствор R0). Для каждого конкретного источника клеток, например, инди- видуального донора, пула доноров или клеточ- ной линии, используют кривую «доза – ответ» для маркера (калибровочная кривая в двух по- вторностях с отрицательным контролем и не менее 4 разведений стандарта маркера в геоме- трической прогрессии) и вычисляют среднюю величину реакций на растворы A‒F. Суммируют средние ответные реакции на растворы А, В и С и средние ответные реакции на растворы D, Е и F. Делят сумму средних от- ветов на растворы D, Е и F на сумму средних ответов на растворы А, В и С.
Испытуемое ле- карственное средство отвечает требованиям ис- пытания для данного источника клеток, если по- лученное значение не превышает установленное значение критерия приемлемости, например 2,5. 7.3.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства Критерии те же, что и для метода 1 (см. раз- дел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи). Для более точного количественного опре- деления уровня контаминации методы 1, 2 и 3 могут выполняться с использованием других разведений раствора испытуемого лекарствен- ного средства, не превышающих максимально допустимого разведения. 20 Следующий раздел приводится для информации РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ 1. ВВЕДЕНИЕ Испытание на активацию моноцитов в первую очередь предназначено для использо- вания в качестве замены испытания на Пиро- генность. Испытание на активацию моноцитов позволяет обнаруживать пирогенные и провос- палительные вещества: эндотоксины грамотри- цательных бактерий и пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, включая пато- ген-ассоциированные молекулярные паттерны грамположительных и грамотрицательных бак- терий, вирусов и грибов; химические вещества, характерные для лекарственного средства и/или образующиеся в процессе производства. Пиро- генные вещества, отличные от эндотоксинов, представляют собой молекулы с разнообраз- ными физико-химическими характеристиками, и обычно природа пирогена, присутствующего в испытуемом лекарственном средства, неиз- вестна. Уровень содержания неэндотоксино- вых пирогенов выражается или в эквиваленте единиц эндотоксина, полученным путем срав- нения со стандартом эндотоксина или с серией испытуемого лекарственного средства, утверж- денной в качестве контрольной. В испытании на активацию моноцитов кон- центрации маркеров, образующихся в резуль- тате реакции на стандарт эндотоксина, обыч- но разводят приблизительно в 10 раз (на 1 lg) и при испытании лекарственных средств, со- держащих неэндотоксиновые пирогены (толь- ко неэндотоксиновые пирогены или в комби- нации с эндотоксинами), при определении их способности стимулировать моноциты часто получают очень крутые кривые «доза – ответ» (обычно лишь в диапазоне 1 или 2 степеней разведений). Чаще всего наибольшие ответ- ные реакции на такие лекарственные средства получают при использовании неразведенных растворов или небольших разведений испыту- емых лекарственных средств. По этой причине испытуемые растворы лекарственных средств, которые содержат или могут содержать неэн- дотоксиновые пирогены, должны испытывать- Таблица 2.1.6.13.-3. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор/степень разведения Число повторностей A раствор контрольной серии / f1 4 B раствор контрольной серии / f2 4 C раствор контрольной серии / f3 4 D раствор контрольной серии / f1 4 E раствор испытуемого лекарственного средства / f2 4 F раствор испытуемого лекарственного средства / f3 4 G положительный контроль (стандартный образец эндотоксина) 4 R0 растворитель (отрицательный контроль) 4 Примечание. f, f1, f2 ‒ степень разведения раствора. Растворы А, В и С ‒ разведения контрольной серии в степенях разведения f1, f2 и f3 определенных в испытании на мешающие факторы. Растворы D, Е и F ‒ разведения испытуемого лекарственного средства в степенях разведения f1, f2 и f3 определенных для контрольной серии в испытании на мешающие факторы. Раствор G – положительный контроль жизнеспособности клеток; представляет собой раствор стандартного образца эндотоксина в концентрации, при которой наблюдается однозначная положительная реакция.
Раствор R0 – растворитель, используемый для разведения испытуемого лекарственного средства; отрицательный контроль. 21 ся в диапазоне разведений, который включает минимальное разведение. 2. МЕТОДЫ 2.1. Информация относительно выбора методов Методы 1, 2 и 3 обычно не применяют в слу- чаях, когда испытуемое лекарственное средство может активировать высвобождение выбранного маркера, или когда одной из примесей в испыту- емом лекарственном средстве является выбран- ный маркер. В обоих случаях эти обстоятельства должны привести к модификации и валидации выбранного метода. Предполагается, что при валидации выбранно- го метода в отношении маркера будут определены: ‒ частота отсутствия реакции на соответ- ствующую комбинацию лекарственного сред- ства с пирогенными примесями; ‒ выбор мер по обеспечению надежности результатов испытаний, например, скрининг до- норов, увеличение числа доноров, у которых по- лучают клетки для каждого испытания; ‒ установление достаточно строгих критериев соответствия или несоответствия для макси- мального увеличения вероятности обнаруже- ния серий лекарственных средств, содержащих существенное количество пирогенов. Метод 1 подходит для испытания, если результаты различных разведений (эквивалент эндотоксина на миллилитр) показывают, что кривая «доза – ответ» параллельна калибровоч- ной кривой стандартного образца эндотоксина. Метод 2 является полуколичественным ис- пытанием, который можно применять, когда ответные реакции на разведения испытуемого лекарственного средства не параллельны от- ветным реакциям на разведения стандартного образца эндотоксина. Метод 3 – сравнительное испытание с кон- трольной серией испытуемого лекарственного средства. Метод 3 подходит для случаев со зна- чительной индивидуальной вариабельностью реакций донорских клеток на определенные комбинации лекарственных средств с пирогена- ми. Следует отметить, что реакция моноцитов большинства доноров на бактериальный эндо- токсин приблизительно одинакова, тогда как реакции моноцитов отдельных доноров на не- эндотоксиновые пирогены могут существенно различаться, что позволяет идентифицировать клетки «не реагирующие на неэндотоксиновые пирогены» и клетки со «слабой» и «сильной» реакцией на определенные комбинации лекар- ственных средств и пирогенных веществ. 2.2. Вычисление предельной концентрации пирогена Критерием приемлемости для принятия ре- шения о соответствии или несоответствии явля- ется предельное содержание пирогена, которое выражается в эквивалентах эндотоксина на мил- лиграмм или миллилитр или на единицы биоло- гической активности испытуемого лекарствен- ного средства. Если предельное содержание эндотоксина для лекарственного средства уста- новлено, то предельное содержание пирогена будет равно предельному содержанию эндоток- сина, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Предельное содержание пирогена выражают в эквивалентах эндотоксина и рассчитывают по формуле: ПСП = K M где: K — предельная пирогенная доза бактери- ального эндотоксина из расчета на килограмм массы тела; М — максимальная разовая доза испытуе- мого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела. В случае введения лекарственного препарата через частые интервалы или инфузионно, в ка- честве «М» используют общую максимальную дозу, вводимую в течение одного часа. Предельное содержание пирогена зависит от лекарственного препарата, пути его введения и представлено в некоторых частных фармако- пейных статьях. Значения для предельной пирогенной дозы бактериального эндотоксина на килограмм мас- сы тела (К) приведены в таблице 2.1.6.13.-4. 2.3.
Информация относительно криоконсервантов Следует учитывать воздействие криоконсер- вантов, например диметилсульфоксида (ДМСО), и их остаточных количеств на размороженные клетки: ДМСО обладает токсичностью и может изменять свойства клеток, в частности, проница- емость клеточных мембран, даже после тщатель- ной отмывки размороженной клеточной взвеси. 2.4. Испытание на мешающие факторы В случаях, когда это практически осуще- ствимо, проводят испытание на мешающие фак- торы по крайней мере трех различных серий 22 испытуемого лекарственного средства. Испыту- емые лекарственные средства, у которых отме- чается значительная вариабельность реакций от серии к серии, должны подвергаться испытанию на мешающие факторы в рамках каждого инди- видуального испытания, то есть сопутствующей валидации. Испытание на мешающие факторы в боль- шинстве случае выполняют на сериях испыту- емого лекарственного средства, которые не со- держат эндотоксинов и других пирогенов, но, если это невозможно, на сериях с минимальным содержанием пирогенов. Если имеется только одна серия испытуемого лекарственного сред- ства, валидация должна выполняться на этой серии в трех независимых испытаниях. Должны выполняться параметры прецизионности для воспроизводимости, например ± 50 %. 2.5. Перекрестная валидация В общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Применение испытания на бактериальные эндотоксины указано, что испытание на ак- тивацию моноцитов следует проводить для лекарственных средств, где нельзя исключать присутствие неэндотоксиновых пирогенов. Ис- ходя из этого, рекомендуется проводить экспе- рименты перекрестной валидации испытаний на активацию моноцитов вместе с экспери- ментами испытаний на бактериальные эндо- токсины, используя те же три серии. В случае изменения критических параметров процесса перекрестная валидация должна быть повто- рена на трех сериях, поскольку потенциальное загрязнение неэндотоксиновыми пирогенами не может быть исключено. Испытание на присутствие пирогенов про- водимое на кроликах (2.1.6.2) должно выпол- нять только для перекрестной валидации, если ни один из методов испытания на активацию моноцитов (метод 1, метод 2 или метод 3) не может быть подтвержден для определенного лекарственного средства. 3. ЗАМЕНА ИСПЫТАНИЯ ПИРОГЕННОСТЬ НА ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ Испытание на активацию моноцитов пре- жде всего, предназначено для использования в качестве замены испытания пирогенность на кроликах. Частные фармакопейные статьи могут содержать требования проведения ис- пытания на бактериальные эндотоксины, пи- рогенность или испытание на активацию мо- ноцитов. Общие принципы: ‒ в любой частной фармакопейной статье, при наличии требований к содержанию пиро- генных веществ, указывается только одно испы- тание: испытание на бактериальные эндотокси- ны, пирогенность или испытание на активацию моноцитов. Перед включением испытания на активацию моноцитов в частную фармакопей- ную статью требуется подтверждение пригодно- сти одного из трех методов, указанных в общей фармакопейной статье 2.1.6.13. Испытание на активацию моноцитов, для оценки лекарствен- ного средства, являющего предметом данной частной фармакопейной статьи; ‒ необходимая информация предоставляется производителями. Производителям предлагается предоставить любые подтверждающие данные, относящиеся к применимости испытания на активацию мо- ноцитов для контроля активных фармацевтиче- ских субстанций и лекарственных препаратов. Такие данные включают подробное описание приготовления образцов и любых процедур по удалению мешающих факторов.
Дополни- тельно требуются любые доступные данные по параллельному испытанию продукта на Пиро- Таблица 2.1.6.13.-4. – Предельные пирогенные дозы бактериального эндотоксина Путь введения К внутривенный 5,0 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг внутривенный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 2,5 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг интратекальный 0,2 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг парентеральный, для лекарственных препаратов вводимых в дозе, рассчитываемой на квадратный метр поверхности тела 100 МЕ эндотоксина на квадратный метр поверхности тела, ME/м2 23 генность, обосновывающие целесообразность замены испытания на пирогенность на испыта- ние на активацию моноцитов. 4. ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДИК Замена испытания Пирогенность или метода определения провоспалительных или пироген- ных веществ на другой метод должны рассма- триваться как использование альтернативный методики при замене фармакопейного метода согласно требованиям, представленным в разделе 1. Общие сведения Фармакопеи Союза. Для валидации методики испытания на активацию моноцитов, отличной от описан- ной в общей фармакопейной статье, предполага- ется соблюдение следующих требований: ‒ процедура, материалы и реактивы, исполь- зуемые в испытании, должны быть валидирова- ны в соответствии с рекомендациями для данно- го испытания; ‒ испытание на присутствие мешающих факторов (и, если необходимо, процедура по их устранению) выполняется на образцах не менее трех производственных серий. 201060014-2023 2.1.6.14. МИКОБАКТЕРИИ Общая фармакопейная статья распространя- ется на метод определения микобактерий. Если испытуемый образец может содержать микроорганизмы, отличные от микобактерий, его обрабатывают подходящим деконтаминиру- ющим раствором, например, раствором ацетил- цистеина и натрия гидроксида или раствором натрия лаурилсульфата. На каждую из двух подходящих твердых питательных сред (например, среда Левен- штейна-Йенсена или среда Миддлбрук 7Н10) инокулируют по 0,2 мл испытуемого образца. Испытание выполняют в трех повторностях. В подходящую жидкую питательную среду так- же в трех повторностях инокулируют по 0,5 мл испытуемого образца. Все среды инкубируют при температуре 37 °C в течение 56 сут. Определяют способность среды обеспечи- вать рост микобактерий в присутствии испыту- емого образца путем инокуляции подходящего штамма семейства Mycobacteriaceae, например, БЦЖ, и, при необходимости, используют подхо- дящий нейтрализующий агент. Если в течение первых восьми суток инку- бации наблюдают рост посторонних микроорга- низмов, испытание повторяют с одновременным проведением испытания на бактериологическую стерильность. Испытуемый образец выдерживает испы- тание, если в конце инкубационного периода ни в одной из пробирок не наблюдают рост микобактерий. 201060015-2023 2.1.6.15. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом и нековалентном свя- зывании антигенов антителами. Данные методы используют для обнаружения или количественно- го определения как антигенов, так и антител. Ком- плекс антиген-антитело можно идентифицировать и количественно определить различными метода- ми. Положения общей фармакопейной статьи от- носятся к иммунохимическим методам с исполь- зованием реактивов с меткой или без метки. Результаты, получаемые иммунохимически- ми методами, зависят от экспериментальных условий, характера и качества используемых ре- активов. Важно стандартизировать компоненты иммунохимического анализа и по возможности использовать для количественных определений международные стандартные образцы.
Для проведения иммунохимических исследований обычно используют коммерче- ски доступные наборы, включающие реактивы (в частности, антиген или антитело) и материалы, предназначенные для оценки in vitro конкретной субстанции, а также инструкции по их примене- нию. Наборы используют в соответствии с ин- струкциями производителя. Перед использова- нием необходимо убедиться, что селективность и чувствительность наборов являются подходящи- ми для анализа конкретной субстанции. Общая фармакопейная статья включает так- же следующее понятие: набор (реактивов) – комплект специаль- но подобранных реактивов, составных частей и инструкций по проведению анализа, предна- значенный для определения in vitro одного кон- 24 кретного вещества, возбудителя (или активно- сти фермента), нескольких конкретных веществ, возбудителей (или суммарной активности ферментов), а также для детекции участка гено- ма. Совокупность компонентов, которые упако- ваны вместе и предназначены для выполнения специфического исследования in vitro. Компо- ненты набора реактивов могут включать в себя реактивы (антитела, ферменты, буферные и пи- тательные растворы, разбавители), калибраторы, контрольные материалы и другие материалы. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА В методах с использованием меченых анти- генов или антител могут применяться различ- ные метки, например, ферментные, флуорес- центные, люминесцентные и радиоизотопные. При использовании в качестве метки ра- диоизотопа метод называют радиоиммунным. Рекомендации по измерению радиоактивно- сти, приведенные в общей фармакопейной статье 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекар- ственные препараты, подходят также и для иммунологических методов с использованием радиоизотопов. Все работы с радиоактивны- ми материалами должны выполняться в со- ответствии с законодательством государств – членов Союза и международными документами по защите от радиационной опасности. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА МЕТОДЫ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ Методы иммунопреципитации включают флокуляцию и преципитацию. При смешивании раствора антигена с соответствующим антите- лом в определенных условиях образуются фло- кулирующие или преципитирующие агрегаты. Соотношение концентраций реактивов, обеспе- чивающее наименьшее время флокуляции или наиболее выраженную преципитацию, называ- ют оптимальным соотношением. Такое соотно- шение обычно получают при смешивании анти- генов и антител в эквивалентных количествах. Иммунопреципитацию оценивают визуально или с помощью методов светорассеяния (нефе- лометрия или турбидиметрия). Для повышения чувствительности в качестве реактивов можно использовать частицы (например, из латекса), покрытые антигенами или антителами. В методах флокуляции обычно использу- ют пошаговое разведение одного из реактивов, а в методах иммунодиффузии разведение про- исходит в процессе диффузии в гель и таким образом достигают градиента концентраций одного или обоих реактантов. При этом в геле образуются зоны с соотношением реактантов, оптимальным для преципитации. Постановку реакции флокуляции выполняют в пробирках, тогда как в методах иммунодиффузии использу- ют различные носители: пробирки, планшеты, предметные стекла, ячейки или камеры. Системы иммунопреципитации могут быть простыми, комплексными и множественными. Простая система состоит из одного антигена в со- четании с соответствующим антителом; комплекс- ная – из родственных, но серологически неиден- тичных реактантов, множественная – из нескольких серологически неродственных реактантов.
В методах простой диффузии градиент кон- центрации устанавливают только для одного реактанта, диффундирующего из внешнего источника в гель, который содержит соответ- ствующий реактант в сравнительно низкой кон- центрации. Простая (одиночная, радиальная) иммуно- диффузия – количественный метод, при кото- ром антиген (антитело), диффундируя в гель, образует кольцо преципитации с соответствую- щим ему антителом (антигеном). При достиже- нии равновесия между антигеном и антителом, площадь образовавшегося кольца преципитации прямо пропорциональна содержанию антигена (антитело) и обратно пропорциональна содер- жанию антитела (антигена) в геле. В методах двойной диффузии градиенты концентрации устанавливают для обоих реак- тантов. И антиген, и антитело из различных участков диффундируют в первоначально имму- нологически нейтральный гель. Методы сравнительной двойной диффу- зии используют для качественного сравнения различных антигенов по отношению к подходя- щему антителу или наоборот. Сравнение осно- вано на наличии или отсутствии взаимодействия между компонентами преципитации. Реакции идентичности, неидентичности и частичной идентичности антигенов (антител) могут быть различными. 25 ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммуноэлектрофорез (ИЭ) – качественный метод, сочетающий гель-электрофорез с после- дующей иммунодиффузией. Перекрестный иммуноэлектрофорез явля- ется модификацией метода иммуноэлектрофо- реза и подходит как для количественного, так и качественного анализа. Первая часть метода представляет собой гель-электрофорез, после которого продольные полоски геля, содержащие разделенные фракции, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно к пре- дыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем сравнительно низкие кон- центрации антител, соответствующих антигену. Зависимость между площадью пиков преципи- тации и количеством соответствующего антиге- на является линейной для данной концентрации антитела и толщины геля. Электроиммунный анализ, часто назы- ваемый ракетным иммуноэлектрофорезом, является быстрым методом количественного определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот. Электрофорез определяемого антигена выполняют в геле, со- держащем относительно низкие концентра- ции соответствующих антител. Испытуемый образец и разведения стандартного антигена, используемые для калибровки, вносят в раз- ные лунки в геле. В процессе электрофоре- за образуются мигрирующие зоны преципи- тации в виде пиков, которые увеличиваются до тех пор, покасохраняется избыток соответ- ствующего антигена. Для данной концентрации антител зависимость между высотой пика пре- ципитации и количеством антигена является линейной. Встречный иммуноэлектрофорез – бы- стрый метод количественного определения, при котором градиент концентрации устанавлива- ется между вносимыми антителом и антигеном в зависимости от заряда под действием посто- янного электрического поля. Стандартные рас- творы для калибровки и разведения испытуемо- го образца вносят в лунки одного ряда в геле, а в лунки противоположного ряда вносят разве- дения соответствующего реактанта с известной концентрацией. Титром испытуемого образца считают наибольшее разведение, при котором образуется линия преципитации. Существует ряд модификаций методов пере- крестного иммуноэлектрофореза и электроим- мунного анализа. Другие методы сочетают разделение антигенов по размеру молекул и серологическим свойствам.
ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ ИММУНОПРЕЦИПИТАПИИ Выявление и характеристику линий иммуно- преципитации выполняют путем селективного или неселективного окрашивания с использова- нием флуоресцентных, ферментных или изотоп- ных меток или другими подходящими методами. Методы селективного окрашивания в преци- питатах обычно используют для определения характеристик веществ небелковой природы. При подходящей концентрации каждого из реактантов в полупрозрачных гелях, напри- мер, агаре или агарозе, линии преципитации четко различимы невооруженным глазом. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА КРИТЕРИИ ВАЛИДАЦИИ Методики считаются приемлемыми, если: – антитело и антиген не имеют существенных отличий в стандартном и испытуемом образцах. В случае меченых реактивов различия между мече- ным и немеченым компонентами соответствующе- го реактива незначительны; – на результат испытания не оказывает влияния матрица (любой компонент испытуемого образ- ца или вспомогательные вещества, которые могут быть различными в разных образцах); – результат количественного определения не выходит за пределы критериев приемлемости, указанных в частной фармакопейной статье; – прецизионность количественного опреде- ления достаточна для выполнения требований, указанных в частной фармакопейной статье; – порядок выполнения количественного опре- деления не увеличивает систематические ошибки. МЕТОДИКИ ВАЛИДАЦИИ Для подтверждения соответствия критериям приемлемости валидация должна включать: – проведение испытания в не менее трех повторностях; – проведение испытания не менее чем на трех различных разведениях стандартных образцов и трех разведениях испытуемых образ- 26 цов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца; – использование рандомизации; – приготовление стандартного образца ана- логичным образом, если испытуемый образец находится в сыворотке или в смеси с другими компонентами; – измерение неспецифического связывания меченого реактанта; – для заместительного иммунного анализа: – определение максимального связывания (нулевое замещение); – использование разведений, охватывающих весь диапазон откликов от значений, близких к неспецифическому связыванию, до значений максимального связывания как для стандартных образцов, так и испытуемого образца. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА Для анализа результатов испытаний могут быть использованы методы, представленные в общей фармакопейной статье 2.3.12.0. Стати- стическая обработка результатов биологиче- ских испытаний лекарственных средств. Существенное отклонение от параллелизма указывает на то, что между антителом и антиге- ном в испытуемом и стандартном образцах име- ются различия, и результаты испытания являют- ся незначимыми. Для заместительного иммунологического анализа не должно быть существенных разли- чий между значениями неспецифического свя- зывания и максимального замещения при высо- кой концентрации испытуемого и стандартного образцов. Различия могут указывать на наличие эффектов, обусловленных матрицей, ингибиро- ванием связывания или разложением метки. 201060016-2023 2.1.6.16. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ Принцип проточной цитометрии (цитофлу- ориметрии) заключается в многопараметриче- ском исследовании оптических свойств отдель- ных частиц в проточной жидкой системе. Клетки или частицы в суспензии индиви- дуально распределяются в линейном потоке, протекающем через измерительное устройство. Для проведения анализа плотные ткани необ- ходимо преобразовать в суспензию отдельных клеток.
С помощью проточной цитометрии опре- деляют широкий спектр параметров: объем и морфологическую структуру клеток, клеточ- ные пигменты, содержание ДНК и РНК, белки, поверхностные клеточные маркеры, внутрикле- точные маркеры, ферментативную активность, значение pH, состояние мембраны, текучесть и т.д. Проточная цитометрия позволяет определять для каждой отдельной клетки два морфологиче- ских параметра и один или более сигналов флуо- ресценции. Многопараметрический анализ позво- ляет определить фенотип клеточной популяции. ПРИБОР Фокусировка, усиление сигнала и выбор источника света должны быть оптимизированы для автоматического обнаружения и измерения морфологических различий и особенностей окрашивания. При выполнении метода проточ- ной цитометрии проводят: – выбор источника света в зависимости от параметров, которые будут проанализированы; – настройку цитометра в зависимости от типа анализируемых клеток (например, кле- точные культуры, лейкоциты, тромбоциты, бактерии, сперматозоиды, дрожжи) и целей ана- лиза (например, фенотипирование, определение клеточного цикла, апоптоза, цитокинов, мем- бранной текучести, флуоресцентного белка). Для проточной цитометрии характерно автоматизированное количественное опреде- ление ряда заданных параметров для боль- шого числа единичных клеток в течение каждого анализа. Например, 100 000 частиц или более (фактически неограниченное количество) анализируются одна за другой, как правило, приблизительно в течение 1 мин. Предел обна- ружения составляет 100 флуоресцентных моле- кул на клетку. Прибор для проточной цитометрии (про- точный цитометр, проточный цитофлуориметр) имеет пять основных блоков: – система подачи растворов и проточная ячейка; – источник света; – система обнаружения (детектирование сигнала) и система аналого-цифрового преобра- зования; 27 – система усиления (амплификации); – компьютер с программным обеспечением для анализа сигналов. СИСТЕМА ПОДАЧИ РАСТВОРОВ И ПРОТОЧНАЯ ЯЧЕЙКА С помощью системы подачи растворов клетки переносят в проточную ячейку, где они под воздей- ствием обжимающей жидкости распределяются в линию по одному за счет гидродинамического фо- кусирования (поток в потоке) и пересекают пучок световых лучей. Детектирование клеток в канале проточной ячейки, через который проходят клетки, происходит с помощью луча света, сфокусирован- ного в эллипсоидном пространстве двумя конфо- кальными линзами. Для подсчета поверхностных клеточных маркеров скорость потока во время анализа должна быть постоянной и обеспечивать подходящее расстояние между клетками. ИСТОЧНИКИ СВЕТА Наиболее часто используют следующие источники света: – лампы (ртутная, ксеноновая); – лазеры большой мощности, охлаждае- мые водой (аргоновый, криптоновый, лазер на красителях); – лазеры низкой мощности, охлаждае- мые воздухом (аргоновый (488 нм), красный гелий-неоновый (633 нм), зеленый гелий-неоно- вый, гелий-кадмиевый (ультрафиолетовый)); – полупроводниковые (диодные) лазеры (синий, зеленый, красный, фиолетовый). ДЕТЕКТИРОВАНИЕ СИГНАЛА Когда частица проходит через пучок света, она рассеивает часть света во всех направлени- ях. Флуоресцентные красители, добавленные к частице, испускают свой собственный свет (флуоресценцию), которая также излучается во всех направлениях. Таким образом, генериру- ются два типа сигнала: рассеяние света и эмис- сия флуоресценции. Световые датчики прибора фокусируют часть этого рассеянного света и флуоресценции и преобразуют в электрические импульсы про- порционально количеству собранного света.
Светорассеяние Измеряют 2 параметра: – прямое рассеяние; – боковое рассеяние, под углом 90° к направ- лению пучка света. Прямое светорассеяние коррелирует с объе- мом клетки, в то время как боковое светорассея- ние, связанное с такими параметрами, как форма ядра, количество и тип цитоплазматических гра- нул или шероховатость мембран, коррелирует с морфологическим строением клетки. С воз- растанием сложности клеточной структуры, интенсивность бокового светорассеяния также возрастает. Сигналы светорассеяния, являющиеся функ- цией морфологических характеристик клеток и определяющиеся как базовые параметры, при анализе с помощью проточной цитометрии будут генерироваться всегда. Флуоресценция При прохождении частиц через лазерный луч, они будут испускать определенный флу- оресцентный свет, в зависимости от типа и количества источников света. Излучение флу- оресцентных сигналов происходит благодаря флуоресцентным красителям, естественно на- ходящимся в клетках (например, коферменты, хлорофилл, пигменты морской водоросли), и (или) флуоресцентным зондам, использован- ным для маркировки клеток для определения специфичных характеристик (например, флу- оресцирующие антитела, красители нукле- иновых кислот, pH-метки и кальций-зависи- мые метки, флуоресцирующие белки). Каждая флуоресцентная метка характеризуется инди- видуальным спектром возбуждения и спек- тром эмиссии, ее выбирают в зависимости от природы источника возбуждения, системы обнаружения и специфической цели анализа. Оптические фильтры должны соответствовать используемым флуорофором. УПРАВЛЕНИЕ СИГНАЛОМ И АНАЛОГО-ЦИФРОВОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ Сигналы светорассеяния и флуоресценции, испускаемые клетками при прохождении через лазерный луч, разделяются и направляются к детекторам с помощью оптических фильтров. Детекторы являются трансдукторами (фотоэлек- тронными умножителями), которые преобразуют световое излучение, генерируемое клетками, в импульсы напряжения. Процесс подсчета каждого импульса в соответствующем канале является аналого-циф- ровым преобразованием. Процесс отображается графически в виде частотной гистограммы. 28 Усиление (амплификация) Для оптимальной визуализации импульсы напряжения должны быть усилены. Процесс усиления подчеркивает различия между сиг- налами клетки и, следовательно, увеличивает разрешение между популяциями клеток с раз- личными характеристиками (например, отличие жизнеспособных от нежизнеспособных клеток, или неспецифической флуоресценции от анти- ген-специфической флуоресценции после окра- ски мечеными моноклональными антителами). Есть два метода усиления сигнала: линейный и логарифмический. Выбор между двумя типами делают для каждого отдельного сигнала в соот- ветствии с морфологическими характеристиками клеток и используемыми красителями (например, флуоресцентно-меченые моноклональные анти- тела, красители нуклеиновой кислоты). Линейное усиление увеличивает различия среди интенсивных импульсов, то есть исполь- зуется с теми параметрами, которые производят сигналы высокой интенсивности, например: – параметры светорассеяния клетки; – флуоресценция красителей нуклеиновых кислот при изучении клеточного цикла. Логарифмическое усиление, напротив, предна- значено для слабых импульсов и параметров или аналитических условий, которые могут произве- сти как слабый, так и сильный импульс, например: – антигены клетки; – светорассеяние от тромбоцитов, бактерий, дрожжей; – флуоресценция от красителей нуклеино- вых кислот при исследовании апоптоза. Компенсация сигналов флуоресценции У каждого флуоресцирующего красителя есть определенный спектр поглощения и спектр эмиссии.
При использовании для окрашивания клеток двух или более флуоресцентных меток одновременно (например, иммунное феноти- пирование по четырем антигенам), спектры эмиссии флуорофоров могут перекрываться. Как следствие, каждый детектор флуоресцен- ции зарегистрирует как определенную флуорес- центную метку, так и какое-то количество света, излучаемого другими флуоресцентными метка- ми. Это может привести к завышению сигнала и плохому разделению популяций клеток. Использование электронной матрицы позво- ляет селективно разделять перекрестные сигна- лы после их улавливания детектором (компенса- ция флуоресценции). Для компенсации флуоресценции требует- ся использование калибраторов флуоресценции, при этом предпочтительно использование положи- тельных образцов клеток, меченных необходимыми флуорофорами, присоединенными тем же спосо- бом, что и к антителам, используемым для анализа. ОТОБРАЖЕНИЕ СИГНАЛОВ После усиления и компенсации сигналы ото- бражаются в виде двух- или трехмерных гисто- грамм. Гистограммы показывают зависимость интенсивности сигнала от количества событий для данного параметра. Гистограммы, в которых каждая точка представляет клетку, основаны на комбинации двух сигналов (двухмерные то- чечные диаграммы с двумя параметрами). Тип и число распределений и комбинаций сигналов выбирают в зависимости от образцов клеток и использованных меток. При анализе получен- ных данных программное обеспечение для про- точной цитометрии может также генерировать и другие виды графических изображений (та- кие как накладывания, поверхностные гисто- граммы, томограммы (срезовые гистограммы), контурные гистограммы, гистограммы плотно- сти или интенсивности, накладывающиеся ги- стограммы). Также могут быть использованы статистические данные, такие как средние ин- тенсивности флуоресценции (и их изменения по времени или в зависимости от функции клетки). АНАЛИЗ ДАННЫХ Клеточная суспензия для испытания может содержать различные виды объектов, некото- рые из которых нежелательны (такие как не- жизнеспособные клетки, фрагменты клеток или макроагрегаты) или просто не являются целью анализа (например, гранулоциты при изучении лимфоцитов). Это зависит от типа образца (цель- ная кровь, костный мозг, клеточные культуры, биологические жидкости, клеточные суспензии из плотных тканей) и процедуры обработки (на- пример, методы окрашивания, лизиса (эритро- цитов), фиксации, криоконсервирования, размо- раживания, депарафинирования). Как следствие, не все сигналы, генерируемые во время анализа, принадлежат изучаемым клет- кам. Для исключения нежелательных и несоот- ветствующих сигналов применяют два подхода. Первый подход, который применяют в про- цессе накопления данных, представляет собой установление шумового порога для одного (или 29 более) существенного параметра (параметров). Данный подход регулирует включение в анализ только клеток, интенсивность сигнала которых выше, чем предопределенное дискриминиру- ющее (пороговое) значение для данного пара- метра. Параметр прямого светорассеяния чаще всего используют в качестве дискриминатора (фактора разделения) из-за его высокоинтенсив- ного сигнала с низким уровнем интерференции. Второй подход, который применяют при ана- лизе данных, заключается в процедуре гейтиро- вания, ограничивая анализ только сигналами от тех популяций клеток, которые удовлетворяют определенным морфологическим и экспресси- онным (по флуоресценции) профилям. Обыч- но используют 2 типа гейтирования. Первый тип основан на морфологии клеток.
Клеточные популяции идентифицируют по их морфологи- ческим характеристикам (определяемым с по- мощью прямого светорассеяния и бокового све- торассеяния). Область гейтирования определяет границы представляющей интерес популяции (например, лимфоциты, жизнеспособные клет- ки), после чего графики флуоресценции отобра- жаются только для выбранной области. Второй тип селекции сигнала основан на флуоресцен- ции. Интересующую клеточную популяцию идентифицируют на основании интенсивности экспрессии антигена или красителя, затем опре- деляют область гейтирования. Затем в рамках выбранной области строят графики флуоресцен- ции. Соответствующее программное обеспече- ние позволяет создавать множественные обла- сти гейтирования, используя последовательный логический порядок. Это особенно информатив- но при изучении редких популяций клеток или при сортировке клеток. КОНТРОЛИ Внутренний контроль Перед испытанием должна быть проведена настройка оптической системы с использовани- ем подходящих флуоросфер, а также проверена стабильность проточной системы. По получен- ным данным формируют отчет и используют при проведении периодического контроля. Для доказательства того, что используемые в испы- тании антитела функциональны и позволяют надлежащим образом использовать проточный цитометр, применяют положительный контроль, в который должны быть включены образцы, из- вестные как положительные для интересующего маркера. Внешний контроль Рекомендуется участвовать в межлаборатор- ных испытаниях для подтверждения надежно- сти полученных данных или проверки межлабо- раторной воспроизводимости. 201060017-2023 2.1.6.17. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на следующих подходах: – амплификация целевого фрагмента нукле- иновой кислоты с использованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР) или изотермической ам- плификации рибонуклеиновой кислоты (РНК); – амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, метода разветвлен- ной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); в этом случае амплификация сигнала достига- ется без повторяющихся циклов амплификации нуклеиновой кислоты. В общей фармакопейной статье описаны тре- бования к методам амплификации нуклеиновых кислот на примере типичного метода ПЦР для последующего детектирования амплифициро- ванных фрагментов ДНК подходящим методом. Фрагменты РНК после обратной транскрипции в комплементарную ДНК и последующей ам- плификации полученного фрагмента ДНК могут быть детектированы подходящим методом. Альтернативные методы амплификации ну- клеиновых кислот могут применяться при усло- вии, что они соответствуют требованиям к каче- ству испытаний, приведенным в данной общей фармакопейной статье. Общая фармакопейная статья устанавливает требования к подготовке образца, амплифика- ции in vitro фрагментов ДНК и детектированию специфического продукта ПЦР. ПРИНЦИП МЕТОДА Типичная ПЦР представляет собой трехста- дийную циклическую процедуру, позволяющую проводить in vitro амплификацию определен- 30 ных фрагментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции в комплементарную ДНК).
Основные стадии амплификации ДНК включают: – денатурацию двуцепочечной нуклеиновой кислоты (матричной ДНК, фрагментов ДНК), когда двуцепочечная ДНК под действием высокой темпе- ратуры переходит в одноцепочечное состояние; – специфический отжиг праймеров (синтети- ческих олигонуклеотидов противоположной на- правленности, фланкирующих целевой участок ДНК) с комплементарным участком молекулы ДНК в подходящих реакционных условиях; – элонгацию нуклеотидной цепи, компле- ментарной матричной, путем достраивания второй цепи ДНК с 3ʹ-конца праймера под воз- действием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез фрагментов ДНК). В дальнейшем повторяющиеся стадии дена- турации, специфического отжига и элонгации ведут к получению и накоплению амплифици- руемого фрагмента, ограниченного праймерами с двух концов. Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть детектирован различны- ми методами соответствующей специфичности и чувствительности. Мультиплексная ПЦР проводится с исполь- зованием нескольких пар праймеров, сконстру- ированных для одновременной амплификации различных целевых фрагментов ДНК в одной реакции. ИСПЫТУЕМЫЙ ОБРАЗЕЦ В связи с высокой чувствительностью ПЦР испытуемые образцы должны быть оптималь- ным образом защищены от внешней контами- нации нуклеиновыми кислотами и ампликона- ми. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого образца производят в условиях, минимизирующих разрушение матричной ДНК. В случае проведения испытания по определе- нию матричной РНК необходимо принять осо- бые меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воз- действию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реактивы, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказы- вать влияние на ход определения. МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ КОНТАМИНАЦИИ В связи с риском контаминации следует строго разграничивать рабочие зоны в зависи- мости от используемых материалов и приме- няемой технологии, учитывать передвижение персонала, использование средств индивидуаль- ной защиты, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации. При проведении испытания следует разде- лять такие зоны как: – зона первичной подготовки (зона, в кото- рой работы осуществляют только с материалами, не содержащими нуклеиновых кислот, способ- ных быть матрицей, например, с праймерами, буферными растворами и др.); – зона для пробоподготовки (зона, в которой осу- ществляют работу с реактивами, образцами и др.); – зона ПЦР-амплификации (зона, в которой амплифицируемый материал обрабатывается в закрытой системе); – зона детектирования (единственная зона, в которой операции с амплифицируемым мате- риалом производятся в открытой системе). В случае использования закрытой системы строгое разделение зон не обязательно. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Для подготовки образцов к постановке ПЦР используют различные физико-химические про- цедуры экстракции и (или) обогащения. Под- лежащая амплификации целевая ДНК должна быть экстрагирована или высвобождена из ис- пытуемого материала таким образом, чтобы амплификация в выбранных реакционных усло- виях была осуществима. Используемая методика должна быть эффективной и воспроизводимой. Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влияние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует использовать образцы для внутреннего контроля, описанные в разделе Контрольные образцы для проверки правильности хода испытания данной общей фармакопейной статьи.
В случае РНК-матриц следует уделять вни- мание предотвращению проявления рибонукле- азной активности. 31 АМПЛИФИКАЦИЯ Амплификацию целевого фрагмента нукле- иновой кислоты методом ПЦР проводят при оптимальных для каждого цикла заданных усло- виях (температурный профиль для денатурации двуцепочечной ДНК, отжига и элонгации, время инкубации при выбранных температурах, ско- рость элонгации). Эти условия зависят от раз- личных параметров, например: – длины и состава праймера и целевого фрагмента; – типа ДНК-полимеразы, состава буферной смеси и реакционного объема, используемых при амплификации; – типа используемого устройства для ампли- фикации и показателей теплопроводности меж- ду прибором, реакционной емкостью и реакци- онной смесью. ДЕТЕКТИРОВАНИЕ Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, можно идентифицировать по размеру, по- следовательности нуклеотидов, химической модификации или комбинации этих параме- тров. Для обнаружения и определения размера фрагмента могут быть использованы методы гель-электрофореза (с использованием агароз- ного или полиакриламидного гелей или ка- пиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (например, жидкостной хрома- тографии). Для обнаружения и определения ха- рактеристик последовательности нуклеотидов могут быть использованы специфическая гибри- дизация зондов, содержащих комплементарную мишени последовательность нуклеотидов, или расщепление амплифицированного материала, отражающее наличие мишень-специфических сайтов ферментативной рестрикции. Для обна- ружения и определения характеристик химиче- ской модификации может быть использовано, например, введение в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуоресценции, возни- кающей в результате возбуждения. Детектирование ампликонов может быть до- стигнуто с помощью зондов, помеченных для по- следующего хемилюминесцентного, радиоизотоп- ного или иммуноферментного детектирования. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Результат испытания является достовер- ным лишь при условии получения однозначно положительных результатов для образцов поло- жительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для образцов отри- цательного контроля (контролей). В связи с ис- ключительно высокой чувствительностью мето- да ПЦР и риском контаминации положительные результаты должны подтверждаться двукратным полным повторением процедуры испытания по возможности с новой аликвотой образца. Образец считается положительным, если хотя бы одно из двух повторных испытаний дает положительный результат. При определении нуклеиновой кислоты, для которой установлен измеримый предел количе- ственного определения, необходимо использо- вать методики для количественного определения. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР Программа валидации должна включать квали- фикацию оборудования. Следует учитывать поло- жения, изложенные в общей фармакопейной статье 2.3.14.0. Валидация аналитических методик. Для валидации ПЦР-испытания применяют подходящие стандартные образцы предприятия, калиброванные относительно международных стандартных образцов целевой последователь- ности нуклеотидов, если применимо. Определение наименьшего положительного значения При валидации испытания должно быть установлено наименьшее положительное зна- чение, определяемое как минимальное количе- ство целевых матричных нуклеиновых кислот в объеме образца, которые могут быть обнару- жены в 95 % испытаний.
Наименьшее положи- тельное значение зависит от таких взаимосвя- занных факторов, как объем экстрагированного образца и эффективность методологии экстрак- ции, транскрипция целевой РНК в комплемен- тарную ДНК, процесс амплификации и детек- тирования. 32 При определении предела обнаружения системы следует учитывать наименьшие положи- тельные значения для каждой целевой матричной нуклеиновой кислоты и результаты проведения испытания выше и ниже этих значений. Системы для количественного определения При валидации проводится оценка методики количественного определения по следующим ха- рактеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, предел количественного опреде- ления, линейность, диапазон применения и устой- чивость (робастность) аналитической методики. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕАКТИВОВ Все реактивы, имеющие критическое значе- ние для используемой методики, должны прохо- дить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность должна основываться на заранее установленных критериях качества. Праймеры являются важнейшими компонен- тами испытаний методом ПЦР, поэтому следует уделять особое внимание их строению, чисто- те и пригодности для испытаний. Праймеры могут быть модифицированы (например, конъ- югированием с флуорофором или антигеном) для возможности детектирования ампликона специфическими методами при условии, что такие модификации не приведут к ингибирова- нию правильного и эффективного протекания процесса амплификации целевого фрагмента. КОНТРОЛЬНЫЕ ОБРАЗЦЫ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ПРАВИЛЬНОСТИ ХОДА ИСПЫТАНИЯ Образцы для внешнего контроля При постановке ПЦР для минимизации риска контаминации и обеспечения соответству- ющей чувствительности при каждом испытании используют следующие внешние контрольные образцы: – образец положительного контроля: обра- зец содержит определенное количество копий целевого фрагмента, близкое к пороговому наи- меньшему положительному значению, уста- новленное индивидуально для каждой системы и выраженное кратно по отношению к наимень- шему положительному значению данной систе- мы; – образец отрицательного контроля: образец, аналогичный основной матрице, для которой до- казано отсутствие целевой последовательности нуклеотидов. Используется для выявления лож- ноположительного сигнала. Образцы для внутреннего контроля При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, образцы для внутренне- го контроля представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содер- жащие сайты связывания с праймерами (прайме- ры для таких последовательностей добавляются в реакционную смесь дополнительно). Образцы для внутреннего контроля должны амплифицироваться так же эффективно, как и ис- пытуемая последовательность нуклеотидов, но ампликоны должны иметь четко определяемые от- личия. Тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом образце. Образцы для внутреннего контроля предпоч- тительно добавлять к испытуемому образцу до выделения нуклеиновой кислоты; чтобы можно было их использовать для общего контроля про- цесса (экстракция, обратная транскрипция, ам- плификация, детектирование). Образец для контроля предела количественного определения Для контроля предела количественного определения готовят образец, содержащий кон- центрацию определяемого компонента в испы- туемом образце, максимально близкую, но не превышающую пороговую линию.
Образец для контроля предела количественного определения содержит компонент, калиброванный предпоч- тительно в международных единицах, и исполь- зуется параллельно при каждом количественном определении. ВНЕШНЯЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА Участие во внешних программах оценки ка- чества представляет собой важную процедуру обеспечения качества испытания методом ПЦР для каждой лаборатории и каждого аналитика. 33 Следующие разделы приводятся для информации. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Большинство аналитических методик, ос- нованных на амплификации нуклеиновых кис- лот, представляют собой испытания на наличие нуклеиновых кислот. Существует также ряд методик количествен- ного определения. Для определения контами- нации пулов плазмы РНК вирусом гепатита C (hepatitis C virus, HCV) адекватными являются испытания, которые могут быть рекомендованы для контроля предельного содержания примесей. В данном разделе описаны способы ва- лидации только для аналитических методик качественного анализа амплификации нукле- иновых кислот, предназначенных для оцен- ки контаминации пулов плазмы РНК HCV. Для этой цели двумя наиболее важными ха- рактеристиками для валидации аналитической методики являются специфичность и предел обнаружения. Кроме того, должна быть оцене- на устойчивость (робастность) аналитической методики. Однако данный раздел также может быть ис- пользован в качестве основы для валидации всей процедуры амплификации нуклеиновых кислот. В соответствии с данным разделом за анали- тическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекти- рования амплифицированного продукта. При использовании в аналитической ме- тодике или ее части коммерческого набо- ра, валидацию пользователя можно заменить документированным подтверждением валида- ции вышеуказанных положений, проведенной производителем набора. Тем не менее, пользо- вателем должна быть подтверждена эффектив- ность набора в отношении его предполагаемого использования (то есть предел обнаружения, устойчивость, перекрестная контаминация). СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность представляет собой способ- ность к однозначной оценке наличия нуклеино- вой кислоты в смеси с компонентами, присут- ствие которых можно ожидать. Специфичность аналитических методик, ос- нованных на амплификации нуклеиновых кис- лот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа конечного продукта) и обоснован- ности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и для стадии детек- тирования). При разработке праймеров и зондов долж- на быть исследована их специфичность в от- ношении детектирования только РНК HCV путем сравнения выбранной последовательности нуклеотидов с последовательностями нуклеоти- дов, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5ʹ-некодирующего участка генома HCV, которые консервативны для всех генотипов. Амплифицированный продукт должен одно- значно идентифицироваться одним из методов, например, проведением амплификации с вло- женными праймерами (гнездовая ПЦР), испыта- нием с использованием ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со специ- фическим зондом. Для валидации специфичности аналитиче- ской методики испытание должно быть прове- дено в отношении не менее 100 образцов РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть доказано отсутствие реакции. Способность аналитической методики к обнаружению всех генотипов HCV также зави- сит от выбора праймеров, зондов и параметров методики.
Эта способность должна быть под- тверждена с использованием охарактеризован- ных панелей сравнения. Однако ввиду сложно- сти получения некоторых генотипов (например, генотипа 6) должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе – генотипы 1 и 3). ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТОДИКИ За предел обнаружения данной аналитиче- ской методики принимают наименьшее количе- ство нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детектировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитическая методика амплификации нуклеиновых кислот, используемая для детек- тирования РНК HCV в пулах плазмы, как пра- вило, дает неколичественные результаты (либо положительный, либо отрицательный). Реко- 34 мендуется определение предела обнаружения, но в практических целях для аналитической ме- тодики на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено наименьшее положительное значение. Наименьшее положи- тельное значение (в соответствии с определени- ем, приведенным в данной общей фармакопей- ной статье) представляет собой минимальное количество целевых матричных нуклеиновых кислот в испытуемом объеме образца, кото- рые могут быть определены в 95 % испытаний. Минимальное положительное значение зави- сит от распределения вирусных геномов в ин- дивидуальных испытуемых образцах и такого фактора, как эффективность фермента, что мо- жет привести к получению различных наимень- ших положительных значений для отдельных испытаний. Для определения наименьшего положитель- ного значения ряд разведений стандартного образца предприятия или СО ФЕАЭС вируса гепатита С, калиброванного по международно- му стандартному образцу HCV Всемирной ор- ганизации здравоохранения, должен быть под- вергнут испытанию в разные дни для проверки вариабельности результатов анализа. Для про- ведения статистического анализа результатов должно быть испытано не менее трех незави- симых рядов разведений в достаточном количе- стве повторностей для получения 24 результатов испытания для каждого разведения. Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждо- го из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведений в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разве- дений не было слишком большим, следует про- вести предварительное испытание (например, с использованием логарифмических разведе- ний образца пула плазмы) с получением пред- варительного наименьшего положительного значения (то есть наибольшего разведения, дающего положительный результат). После этого диапазон разведений может быть выбран в области полученного предварительного зна- чения (с использованием, например, логариф- мического фактора разведения 0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концентрацию РНК HCV, которая может быть детектирована в 95 % испытаний, рассчитывают с использованием соответствую- щих методов статистической оценки. Эти результаты также могут служить для оценки изменчивости результатов, получа- емых данной аналитической методикой в ходе испытания и в разные дни. УСТОЙЧИВОСТЬ (РОБАСТНОСТЬ) Устойчивость (робастность) аналитической методики – мера ее способности выдерживать воздействие незначительных изменений параме- тров, являющаяся показателем надежности ме- тодики при обычном использовании. Оценка надежности аналитической методи- ки должна проводиться на этапе ее разработки. Устойчивость должна показать надежность ана- литической методики с учетом определенных вариаций параметров.
Для методов амплифика- ции нуклеиновых кислот небольшие изменения параметров методики могут иметь решающее значение. Однако в ходе разработки устойчи- вость методики может быть подтверждена не- большим изменением концентраций реактивов (например, магния хлорида, праймеров или нуклеотидов). Для подтверждения устойчиво- сти не менее 20 РНК HCV-отрицательных пу- лов плазмы, отобранных случайным образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в 3 раза превышающей заранее определенное наименьшее положитель- ное значение, должны быть испытаны и призна- ны положительными. Проблемы с устойчивостью могут возник- нуть также в связи с методиками, в которых стадия ультрацентрифугирования предшеству- ет экстракции вирусной РНК. Поэтому для ис- пытания устойчивости таких методик не менее 20 пулов плазмы, содержащих различные уров- ни РНК HCV, но не содержащих специфических антител к HCV, должны быть испытаны и при- знаны положительными. Предотвращение перекрестной контами- нации должно быть подтверждено путем точ- ного детектирования панели не менее чем из 20 образцов, попеременно заполненной образца- ми отрицательных пулов плазмы и отрицатель- ных пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного наименьшего положительного значения или не менее 104 МЕ/мл). 35 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ Для таких биологических методов, как ам- плификация нуклеиновых кислот, существу- ет вероятность возникновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валида- цию, так и на интерпретацию результатов. Ме- тодики испытаний должны быть четко описаны в виде стандартных операционных процедур, в которых следует указывать: – способ отбора проб (тип упаковки и др.); – приготовление мини-пулов (если при- менимо); – условия хранения до испытания; – четкое описание условий испытания, вклю- чая меры предосторожности против перекрестной контаминации и деградации вирусной РНК, ис- пользуемых реактивов и стандартных образцов; – четкое описание используемого обору- дования; – детальные формулы расчета результатов, включая статистическую обработку. В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы качества и надежности аналитической методики, когда бы она ни ис- пользовалась, может быть рекомендован под- ходящий образец для контроля хода испытания (например, подходящее разведение СО ФЕАЭС вируса гепатита С или образец плазмы, инфи- цированной HCV, калиброванный по междуна- родному стандартному образцу HCV Всемирной организации здравоохранения). Квалификация оборудования. Соответ- ствующая программа квалификации монтажа и функционирования должна быть реализована для каждой критически важной части использу- емого оборудования. После замены критически важного оборудования (например, терморегуля- торов) должна быть документально подтвержде- на функциональность аналитической процеду- ры путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных образцов пула плаз- мы, инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, соответствующей ра- нее определенному наименьшему положитель- ному значению. Все результаты должны быть положительными. Квалификация аналитика. В отношении каждого аналитика, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствую- щая квалификационная программа.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ДНК ВИРУСА B19 В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Согласно требованиям Фармакопеи Союза пулы плазмы, используемые при производстве определенных продуктов, должны быть прове- рены на содержание ДНК вируса B19 (B19V) в концентрации не выше допустимой. Для этого предпочтительно использовать методики ам- плификации c количественным определением нуклеиновых кислот. Наиболее важными ха- рактеристиками для валидации таких методик являются: правильность, прецизионность, спец- ифичность, предел количественного определе- ния, линейность и диапазон применения. Кроме того, должна быть оценена устойчивость (ро- бастность) аналитической методики. В разделе описаны способы валидации ме- тодик амплификации нуклеиновых кислот для определения контаминации пулов плазмы ДНК B19V. Однако данный раздел также может быть использован в качестве основы для валидации в целом процедуры амплификации нуклеиновых кислот. В соответствии с данным разделом за анали- тическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекти- рования амплифицированного продукта. В случае использования в аналитической методике или ее части коммерческого набора ва- лидацию можно заменить документированным подтверждением валидации вышеуказанных характеристик от производителя набора. При этом пользователем должна быть подтверждена эффективность набора в отношении его предпо- лагаемого использования (то есть правильность, прецизионность, диапазон применения, устой- чивость). ПРАВИЛЬНОСТЬ Правильность представляет собой близость совпадения между найденным значением и зна- чением, которое определено как условно пра- вильное, либо принято как значение сравнения. Правильность количественного определения за- висит от калибровочного графика и отклонений на различных стадиях количественного опреде- 36 ления. Хотя рекомендовано определять правиль- ность во всем специфицированном диапазоне, наиболее важно подтвердить правильность в диапазоне около предельного значения концен- трации (количество). В случае количественного определения ДНК B19V в пулах плазмы рекомен- дуется оценивать правильность методики путем количественного определения не менее 5 концен- траций (с логарифмическим коэффициентом раз- ведения 0,5) СО ФЕАЭС вирусной ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот или иного стандартного образца, калиброванного в международных единицах по международному стандартному образцу ДНК B19V Всемирной ор- ганизации здравоохранения в диапазоне рекомен- дованного на данный момент порогового значе- ния 10,0 МЕ/мкл ДНК B19V (то есть 105 МЕ/мл, 104,5 МЕ/мл, 104 МЕ/мл, 103,5 МЕ/мл и 103 МЕ/мл) не менее чем в трех повторностях для каждого разведения. Правильность должна быть доку- ментирована для различных концентраций в про- центах, определенных в сравнении с известным количеством ДНК B19V. Следует сопоставить технологический уровень соответствующего ме- тода количественного определения, например, с помощью совместных испытаний. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ Прецизионность представляет собой бли- зость совпадения между сериями измерений, по- лученных в многочисленных испытаниях различ- ных проб одного и того же гомогенного образца.
Прецизионность определяется на трех уровнях: – повторяемость: выражает точность при одних и тех же условиях испытания в течение короткого промежутка времени, оценивает- ся с использованием одной методики количе- ственного определения, с помощью которой трижды испытывают подходящие разведения положительных образцов с ДНК B19V, кали- брованных в международных единицах и охва- тывающих весь диапазон применения методики количественного определения; коэффициент вариации рассчитывают для индивидуальных образцов; – промежуточная (внутрилабораторная) пре- цизионность: выражает внутрилабораторную вариабельность, устанавливается оценкой по- вторных испытаний (как рутинный количествен- ный анализ) подходящих разведений положи- тельных образцов с ДНК B19V, калиброванных в международных единицах и охватывающих весь диапазон применения методики количе- ственного определения, в различной обстановке (то есть различные дни, различные аналитики, различное оборудование, различные реактивы); коэффициент вариации рассчитывают для инди- видуальных образцов; – воспроизводимость: выражает точность между различными лабораториями (межлабо- раторная прецизионность), оценивается путем участия в совместных количественных испыта- ниях на содержание ДНК B19V. СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность представляет собой спо- собность к однозначной оценке наличия ну- клеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать. Спец- ифичность аналитических методик, основан- ных на амплификации нуклеиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для испытания конечного продукта) и обо- снованности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и стадии детектирования). При разработке праймеров и зондов долж- на быть исследована их специфичность в от- ношении детектирования только ДНК B19V путем сравнения избранной последовательно- сти нуклеотидов с последовательностями ну- клеотидов, опубликованными в банках данных. Не должно обнаруживаться значительное сход- ство с последовательностями нуклеотидов, не относящимися к B19V. Амплифицированный продукт должен одно- значно идентифицироваться одним из методов, на- пример, проведением амплификации с вложенными праймерами (гнездовая ПЦР), анализом с использо- ванием ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со специфическим зондом. Для проверки специфичности аналитиче- ской методики испытание должно быть прове- дено в отношении не менее 20 ДНК B19V-отри- цательных пулов плазмы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Генотипы парвовируса B19. Междуна- родный комитет по таксономии вирусов клас- сифицирует представителей трех генотипов как штаммы человеческого парвовируса B19. Генотип 1 представляет прототип B19V, генотип 2 – вирусные последовательности нуклеотидов типа А6 и генотип 3 – V9-подобные последова- тельности нуклеотидов. При проведении вырав- 37 нивания с использованием соответствующей по- следовательности нуклеотидов генотипа B19V, доступной из баз данных последовательностей нуклеиновых кислот, праймеры и зонды долж- ны быть выбраны с таким расчетом, чтобы была возможность обнаружения и количественного определения в равной степени различных гено- типов парвовируса B19. Для проверки выбран- ного подхода следует использовать стандарт- ные образцы. Так как получение биологических препаратов сравнения может быть затруднено, соответствующие препараты плазмид или син- тетических нуклеиновых кислот также могут служить в качестве источника охарактеризован- ных целевых фрагментов. Однако они не могут быть использованы для валидации процедуры экстракции.
ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Предел количественного определения пред- ставляет собой минимальное количество ну- клеиновой кислоты в образце, которое может быть определено с требуемой правильностью и прецизионностью. Предел количественного определения методики, основанной на ампли- фикации нуклеиновых кислот B19V, оценивают при изучении правильности и межлабораторной прецизионности путем ограничения разведений. Определяют наименьшую концентрацию целе- вой матричной нуклеиновой кислоты, которая может быть определена количественно с доста- точной правильностью и прецизионностью. ЛИНЕЙНОСТЬ Линейность методики количественного определения – валидационная характеристи- ка возможности получения результатов, прямо пропорциональных концентрации нуклеиновой кислоты. Линейность методики, основанной на амплификации нуклеиновых кислот B19V, оценивают по характеристикам повторяемости и промежуточной (внутрилабораторной) пре- цизионности путем испытания в нескольких повторностях разведенных образцов с кон- центрациями, охватывающими весь диапазон применения методики. Определяют интервал, расположенный между верхней и нижней кон- центрациями целевой матричной нуклеиновой кислоты, при которых получаемые результаты прямо пропорциональны ее содержанию. ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ Диапазон применения – интервал, располо- женный между наибольшей и наименьшей кон- центрациями (количеством) нуклеиновой кисло- ты в образце, для которого было показано, что методика имеет приемлемый уровень правиль- ности, линейности и прецизионности. Диапазон применения методики амплификации нуклеино- вых кислот B19V оценивают по характеристикам повторяемости и промежуточной (внутрилабо- раторной) прецизионности путем испытаний в нескольких повторностях разведенных образ- цов. Определяют интервал, расположенный меж- ду наибольшей и наименьшей концентрациями целевой матричной нуклеиновой кислоты, кото- рый может быть выражен с приемлемой степе- нью правильности и прецизионности. УСТОЙЧИВОСТЬ (РОБАСТНОСТЬ) Устойчивость (робастность) аналитической методики – мера способности методики выдер- живать воздействие незначительных изменений параметров, являющаяся показателем надежно- сти этой методики при обычном использовании. Оценка надежности аналитической методики должна проводиться на этапе ее разработки. Устойчивость должна показать надежность ана- литической методики с учетом определенных вариаций параметров. Для методов амплифика- ции нуклеиновых кислот небольшие изменения параметров методики могут иметь решающее значение. Однако в ходе разработки методи- ки ее устойчивость может быть подтверждена небольшим изменением концентраций реакти- вов, например, магния хлорида, праймеров или нуклеотидов. Для подтверждения устойчиво- сти аналитической методики не менее 20 ДНК B19V-отрицательных пулов плазмы, инфициро- ванных ДНК B19V до получения конечной кон- центрации около наименьшего значения, долж- ны быть испытаны с получением приемлемых количественных значений. Предотвращение перекрестной контами- нации должно быть подтверждено путем точ- ного детектирования панели не менее чем из 20 образцов, попеременно заполненной образцами пулов плазмы без ДНК B19V или с концентрацией ниже порогового значения (10 образцов) и пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями ДНК B19V (не менее 100-кратного наименьшего значения, 10 образцов). 38 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ Для таких биологических методов, как амплификация нуклеиновых кислот, имеет- ся вероятность возникновения специфических проблем, которые могут повлиять как на вали- дацию, так и на интерпретацию результатов.
Методики испытаний должны быть четко описа- ны в виде стандартных операционных процедур, в которых следует указывать: – способ отбора проб (тип упаковки и др.); – приготовление мини-пулов производите- лем (если применимо); – условия хранения до испытания; – четкое описание условий испытания, включая меры предосторожности против пере- крестной контаминации и деградации вирусных нуклеиновых кислот, используемых реактивов и стандартных образцов; – четкое описание используемого оборудования; – детальные формулы расчета результатов, включая статистическую обработку. Для проверки соответствия системы каче- ства и надежности аналитической методики может быть использован подходящий образец для контроля хода испытания (например, плазма, инфицированная образцом ДНК вируса B19V, калиброванным в международных единицах в сравнении с СО ФЕАЭС вирусной ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот). Квалификация оборудования. Соответ- ствующая программа квалификации монтажа и функционирования должна быть реализова- на для каждой критически важной части ис- пользуемого оборудования. После замены кри- тически важного оборудования (например, терморегуляторов) должна быть документально подтверждена функциональность путем проведе- ния параллельного испытания с использованием 8 образцов пула плазмы, инфицированного ДНК B19V с получением конечной концентрации око- ло наименьшего значения. Все результаты долж- ны быть приемлемыми и отражать возможности методики количественного определения, как было установлено при валидации. Квалификация аналитика. В отношении каждого аналитика, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствую- щая квалификационная программа. 201060018-2023 2.1.6.18. МЕТОД ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ВАКЦИН Метод нефелометрии описан в общей фар- макопейной статье 2.1.2.1. Прозрачность и степень опалесценции жидкостей. Мето- дом иммунонефелометрии измеряют мутность, обусловленную формированием иммунного комплекса при реакции «антиген-антитело». Данный метод применяют как для определе- ния количества антител, так и для определения количества антигенов. В общей фармакопейной статье описано количественное определение антигенов как компонентов вакцин. ОБОРУДОВАНИЕ Для испытаний используют нефелометр, описанный в общей фармакопейной статье 2.1.2.1. Прозрачность и степень опалесценции жидкостей. Допускается проведение измерения под ненулевым углом, отличным от 90°. МЕТОДЫ Измерение светорассеяния в процессе реак- ции может быть проведено в три этапа. Сначала определяют базовый уровень све- торассеяния реакционной средой. После до- бавления первого реактива (антигена) про- исходит увеличение сигнала с последующим плато. Когда добавляют второй реактив (ан- титело), происходит второе усиление сиг- нала со вторым плато, за которым следует окончательное увеличение интенсивности сигнала, продолжающегося до тех пор, пока не будет достигнуто третье плато. Зону изме- рения фиксируют с момента добавления второ- го реактива до достижения наиболее высокой интенсивности светорассеяния (третье плато) в зависимости от концентрации определяемого компонента. Для количественной оценки иммунных комплексов, образующихся при реакции «анти- ген-антитело», используют следующие методы. 39 ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИЯ В КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ Методом иммунонефелометрии в конечной точке измеряют светорассеяние после форми- рования иммунного комплекса, примерно через 60 мин. Измеренное значение в конечной точке в этом случае прямо пропорционально содержа- нию определяемого компонента в присутствии избытка антител.
Проводят контрольный опыт, чтобы учесть значение неспецифического свето- рассеяния, обусловленного реакционной средой и реакционной измерительной кюветой. КИНЕТИЧЕСКАЯ ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИЯ Метод кинетической иммунонефелометрии основан на определении скорости образования иммунных комплексов (скорость увеличения светорассеяния), которая пропорциональна кон- центрации определяемого компонента. Существует 2 типа кинетической иммуноне- фелометрии. Иммунонефелометрия с фиксированным временем Первое измерение светорассеяния прово- дят через несколько секунд после добавления последнего реактива. Второе измерение про- водят через фиксированный интервал вре- мени, установленный при разработке ме- тодики. Разница между двумя значениями пропорциональна количеству определяемого компонента. Кинетическая иммунонефелометрия с использованием пика первой производной Формирование иммунного комплекса опи- сывает кривая, построенная по первой произ- водной изменения светорассеяния во времени (dΘD/dt). Появление двух последовательных пи- ков обусловлено добавлением первого, а затем второго реактива. Высота третьего пика кривой, построенной по первой производной, пропорциональна ко- личеству определяемого компонента в реакци- онной среде. Последовательные измерения про- водят через несколько секунд после добавления второго реактива. В этом случае свет, рассеянный реакцион- ной средой, компонентом и реактивом, не влияет на исходное значение полученного сигнала. РЕАКТИВЫ И СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ Реактивы, в том числе разбавители, и стандарт- ные образцы должны быть прозрачными и не со- держать взвешенных частиц. При необходимости их предварительно фильтруют или центрифугируют. Антисыворотки или антитела выбирают на основе их специфичности, способности к осаждению и их авидности по отношению к антигену, высокое значение которой обеспе- чивает быстрое появление четких сигналов, что улучшает качество результатов. Устанавливают подходящий диапазон кон- центраций антигена (рабочий диапазон), опре- деляемого в присутствии избытка антител, в котором отсутствует зональный эффект. Рекомендуется убедиться, что профили отклика испытуемого образца и соответствую- щего стандартного образца аналогичны. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ИСПЫТУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ При необходимости проводят соответствую- щую предварительную обработку испытуемого образца для удаления адъюванта или другого мешающего вещества. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Необходимо убедиться, что все реактивы име- ют подходящую температуру для оптимального протекания реакции. Образцы разводят подходя- щей средой в реакционной измерительной кюве- те, затем добавляют фиксированное количество антител. Выполняют несколько измерений каж- дого разведения испытуемого образца. В некоторых случаях ход реакции можно улучшить путем введения в реакционную среду дополнительных веществ (например, полиэти- ленгликоля). Стандартные и испытуемые образцы обраба- тывают одинаковым образом. ПРОВЕДЕНИЕ КОНТРОЛЬНОГО ОПЫТА Для обеспечения специфичности испытания, измеряют только светорассеяние, обусловленное 40 иммунными комплексами. Если другие частицы, матрица образца, реактивы или реакционная из- мерительная кювета могут мешать испытанию, то в таких случаях и в случае использования метода иммунонефелометрии в конечной точке проводят контрольный опыт для исключения не- специфического светорассеяния. КАЛИБРОВКА По разведениям стандартного образца строят калибровочную кривую, подбирая концентрации таким образом, чтобы охватить рабочий диапазон. МЕТОДЫ РАСЧЕТА Для расчетов используют метод параллель- ных прямых или метод калибровочной кривой (2.3.12.0).
КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ КАЛИБРОВОЧНЫЕ КРИВЫЕ Калибровочные кривые должны соответство- вать установленным критериям приемлемости. Для установления критериев приемлемости могут быть использованы следующие параметры: – минимальное светорассеяние, выраженное в единицах светорассеяния (light scattering units; LSU), для точки калибровочной кривой с самой низкой концентрацией; – коэффициент вариации LSU, измеренный для каждой точки кривой; – коэффициенты регрессии или корреляции калибровочной кривой; – наклон калибровочной кривой и отрезок, отсекаемый калибровочной кривой на оси координат. РЕЗУЛЬТАТЫ Примеры критериев приемлемости, которые следует оценивать: – коэффициент вариации или диапазон зна- чений результатов измерений испытуемого об- разца; – результаты испытания стандартного образ- ца с учетом тенденций или контрольной карты. 201060019-2023 2.1.6.19. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТАТОЧНОЙ ДНК КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА Общая фармакопейная статья описывает ана- литические методы, которые могут быть исполь- зованы для определения содержания и оценки размера остаточной ДНК клетки-хозяина в био- технологических лекарственных средствах, про- изведенных с применением клеток-продуцентов, что не исключает возможности использования альтернативных подходов при согласовании с уполномоченным органом. ВВЕДЕНИЕ Для определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина применяют различные чувствитель- ные аналитические методы, в том числе метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР-РВ) (метод 1) и ме- тод иммуноферментного анализа (метод 2). Метод кПЦР-РВ может также быть исполь- зован при оценке распределения по размеру остаточной ДНК клетки-хозяина, как одной из характеристик, зависящей от природы кле- точного субстрата (например, перевиваемые клеточные линии) и от количества остаточной ДНК клетки-хозяина. Подходящий метод выбирают в зависимо- сти от природы испытуемого образца и с учетом особенностей и ограничений каждого метода, указанных в таблице 2.1.6.19.-1. ПРОБОПОДГОТОВКА Концентрация остаточной ДНК клетки-хо- зяина существенно зависит от вида биотехноло- гического лекарственного средства, от техноло- гии при его создании и степени очистки от ДНК в производственном процессе. В зависимости от матрицы, для достижения надлежащей открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина может понадобиться предвари- тельная обработка образца. Для анализа белков высокой степени очист- ки, таких как рекомбинантные белки или моно- клональные антитела, необходимая величина 41 открываемости остаточной ДНК клетки-хозя- ина может быть достигнута с использованием обычного протеолитического расщепления или аффинной хроматографии. Для более сложной матрицы (например, вирусной вакцины или ви- русного вектора) для высвобождения остаточ- ной ДНК из вирусных частиц может потребо- ваться дополнительная стадия лизиса вируса. Метод иммуноферментного анализа осо- бенно чувствителен к интерферирующему воз- действию белков, избежать которого можно, используя расщепление протеиназой K и натрия додецилсульфатом в качестве первоначальной стадии предварительной обработки образца. Этого может быть достаточно для достижения необходимой открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина. В некоторых случаях остаточ- ная ДНК клетки-хозяина может быть связана с компонентами испытуемого образца, в кото- ром также могут присутствовать растворимые мешающие вещества, в этом случае может пона- добиться выделение остаточной ДНК клетки-хо- зяина из испытуемого образца.
Для выделения ДНК используют процеду- ры, при которых получена удовлетворительная величина открываемости в экспериментах с до- бавками. Существует несколько подходящих ме- тодов выделения, включая преципитацию ДНК или ДНК-специфическое связывание с матрицей (например, магнитными шариками или колонка- ми с диоксидом кремния). Для выделения оста- точной ДНК клетки-хозяина можно использовать коммерчески доступные наборы. В некоторых наборах для разрушения связи между остаточ- ной ДНК клетки-хозяина и компонентами ис- пытуемого образца используют хаотропные агенты (натрия йодид и др.) и детергент (натрия лаурилсаркозинат). Остаточную ДНК клетки-хо- зяина извлекают из испытуемого образца путем соосаждения с молекулой-носителем, та- кой как гликоген, в присутствии этанола или 2-пропанола. В зависимости от воспроизводи- мости результатов по проверке открываемо- сти добавки может потребоваться несколько Таблица 2.1.6.19.-1. – Сравнение методов кПЦР-РВ (метод 1) и иммуноферментного анализа (метод 2) Характеристики Метод 1 Метод 2 использование для оценки распределения по размеру ДНК да нет предел количественного определения (зависит от матрицы, используемого метода и мешающих веществ) (пг/мл) 0,01 – 10 2 – 10 специфичность (определение общего содержания ДНК или содержания конкретной ДНК) определение содержания конкретной ДНК определение общего содержания ДНК мешающие вещества белки детергенты, белки, растворители, РНК ограничения фрагменты, меньшие чем ПЦР-продукт, не могут быть обнаружены и определены количественно не применимо для лекарственных средств, на основе ДНК. Для фрагментов, содержащих менее 1000 пар оснований определяемое содержание ДНК занижается. Детектирование зависит от размера ДНК. Короткие последовательности ДНК (менее 80 нуклеотидов) не определяются, но могут мешать количественному определению из-за связывания реактива. Лекарственное средство не должно содержать бактериальной ДНК. Узкий рабочий диапазон: 5 – 150 пг/лунка. 42 независимых процедур выделения. В каждую процедуру выделения должны быть включены от- рицательные контроли. В некоторых случаях реко- мендуется разведение полученных образцов (извле- ченные пробы) для уменьшения эффекта матрицы. Также может быть применен поправочный коэф- фициент, учитывающий открываемость добавки. МЕТОД 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ кПЦР-РВ Метод может быть использован для опреде- ления целевой последовательности клеточной ДНК, выделенной из различных испытуемых об- разцов. Для определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина можно использовать метод кПЦР-РВ, направленный либо на стабильную последова- тельность нуклеотидов в высококонсервативной области генома клетки-хозяина, либо на повто- ряющиеся элементы для повышения чувстви- тельности испытания. При определении повто- ряющихся элементов потенциальный фоновый «шум» ДНК из окружающей среды может быть трудно устраним (например, при использова- нии Alu последовательностей генома человека). Специфичность методики с использованием метода кПЦР-РВ должна быть установлена в ходе валидационных исследований путем под- тверждения отсутствия перекрестной активно- сти с неродственными нуклеотидными последо- вательностями. В качестве альтернативы допустимо исполь- зование цифровые методы ПЦР. АМПЛИФИКАЦИЯ Обнаружение и определение остаточной ДНК клетки-хозяина методом кПЦР-РВ может включать использование ДНК зондов, специ- фичных к последовательности нуклеотидов, или неспецифического флуоресцентного краси- теля, интеркалирующего с любой двуцепочеч- ной ДНК. Принципы метода кПЦР-РВ описаны в общей фармакопейной статье 2.1.6.17.
Мето- ды амплификации нуклеиновых кислот. Количество циклов, необходимых для пре- вышения порогового значения (Ct или Cp) при флуоресцентном измерении, зависит от исход- ного количества остаточной ДНК клетки-хозяи- на в образце. Если выполняется несколько выделений, извлеченные пробы, при необходимости, после подходящего разведения, должны иметь сопо- ставимую концентрацию ДНК клетки-хозяина. Используют образцы для отрицательного контроля ПЦР. Стандартную кривую содержания геном- ной ДНК строят с использованием серий раз- ведений стандартного раствора геномной ДНК клетки-хозяина, чтобы можно было опреде- лить остаточные уровни ДНК клетки-хозя- ина в биотехнологических лекарственных средствах на основе их значений Ct или Cp. Для приготовления стандартного раствора ре- комендуется использовать тщательно охарак- теризованную репрезентативную геномную ДНК, выделенную из клеток, используемых для производства биотехнологического лекар- ственного средства. Аналогичный подход применяют для оцен- ки распределения по размеру остаточной ДНК клетки-хозяина. Для амплификации перекрыва- ющихся фрагментов разного размера в целевой последовательности нуклеотидов могут быть использованы как минимум два набора праймеров. КРИТЕРИИ ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ Контрольные образцы для проверки правильности хода испытания Для контроля надлежащей чувствительно- сти и контроля риска контаминации в каждом испытании используют следующие образцы: – образец отрицательного контроля для метода кПЦР-РВ и образец отрицательного контроля для выделения, состоящие из подходя- щих матриц с доказанным отсутствием целевой последовательности нуклеотидов; – образец положительного контроля для метода кПЦР-РВ содержит определенное количество копий целевой последовательности или определенную концентрацию ДНК, которая определяется индивидуально для каждой систе- мы анализа; – образец для внутреннего контроля (используется для контроля выделения), пред- ставляющий собой испытуемый образец, в ко- торый добавляют в определенной концентрации или количестве копии целевой последователь- ности. В этом случае ампликоны должны иметь четко определяемые различия и возможность быть обнаруженными в отдельном испытании методом кПЦР-РВ. В качестве альтернативы до- пустимо использование образца для внешнего контроля, состоящего из испытуемого образца 43 с хорошо охарактеризованным уровнем геном- ной ДНК. Открываемость методики должна находить- ся в пределах заданных значений, основанных на характеристиках методики, установленных во время валидации. Стандартная кривая содержания геномной ДНК Стандартная кривая содержания геномной ДНК в выбранном диапазоне должна быть ли- нейной. Коэффициент детерминации R2 стан- дартной кривой содержания геномной ДНК должен быть больше или равен 0,98. Эффектив- ность ПЦР на основе значений Ct или Cp должна находиться в заранее установленных пределах. Коэффициент вариации для различных из- влечений или повторов не должен превышать предварительно установленного значения. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Если выполняется несколько выделений, то каждая извлеченная проба анализируется индивидуально. Остаточное содержание ДНК клетки-хозяина рассчитывают по стандартной кривой содержания геномной ДНК путем усред- нения значений, полученных для различных извлечений или повторов. При необходимости, данный результат может быть скорректирован с учетом открываемости при выделении.
Для оценки распределения перекрывающих- ся фрагментов разных размеров остаточной ДНК клетки-хозяина рассчитывают соотношение количества копий для каждого размера амплико- на к количеству копий ампликона наименьшего размера. МЕТОД 2. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Метод иммуноферментного анализа пред- ставляет собой неспецифический метод количе- ственного определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина (независимо от ее происхождения), позволяющий обнаруживать одноцепочечную ДНК. Данный метод позволяет определить общее со- держание ДНК, и, следовательно, важно не только избегать загрязнения ДНК от окружающей среды, но и все используемые материалы и реактивы не должны содержать ДНК. Испытуемые образцы не должны быть контаминированы микроорга- низмами, и все образцы, в том числе стандартные образцы, должны быть обработаны в контролиру- емых условиях до этапа денатурации. ПРИНЦИП Определение общей ДНК состоит из четы- рех этапов: – денатурация и образование комплексов: при нагревании образца ДНК денатурируется в одноцепочечную ДНК; денатурированную ДНК смешивают с реактивом, который содер- жит белок, конъюгированный со стрептави- дином (связывающим одноцепочечную ДНК), и моноклональное антитело к ДНК, конъю- гированное с уреазой. ДНК-связывающий белок и моноклональное антитело специфичны для одноцепочечной ДНК, но не специфичны для двуцепочечной. Наличие стрептавидина в жидкой фазе способствует образованию ком- плекса с одноцепочечной ДНК из образца; – фильтрация: комплекс фильтруют через биотинилированную нитроцеллюлозную мем- брану. Биотин в мембране захватывает комплек- сы, связываясь со стрептавидином. Мембрану промывают для удаления любых несвязанных реактивов. Для исключения неспецифическо- го связывания используют нитроцеллюлозную мембрану, покрытую альбумином; – детектирование: мембрану помещают в планшетный спектрофотометр, содержащий раствор мочевины, реагирующий с уреазой в комплексе ДНК с образованием аммиака. Соот- ветствующее изменение рН, которое измеряют потенциометрическим датчиком (в микровольт в секунду), прямо пропорционально количеству ДНК в образце; – анализ: исходные данные для образца и стандартной кривой обрабатывают с использо- ванием соответствующего программного обе- спечения для определения остаточного содержа- ния ДНК клетки-хозяина в образце. Все образцы и отрицательные контроли испы- тывают с добавками и без добавок. Раствор добав- ки (1000 пг/мл) готовят путем разбавления кон- центрированного стандартного раствора (ДНК тимуса теленка) с концентрацией 5000 пг/мл. КРИТЕРИИ ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ Контрольные образцы – количество ДНК в положительном контроле должно находиться в пределах диапа- зона, указанного производителем; – открываемость добавки в отрицательном 44 контроле должна составлять от 80 % до 120 %. Образцы – при анализе нескольких повторов коэффи- циент вариации для разных повторов не должен превышать установленного значения; – открываемость добавки должна состав- лять от 80 % до 120 %. ВЫЧИСЛЕНИЯ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Содержание остаточной ДНК клетки-хозяи- на рассчитывают в пикограммах на миллилитр по формуле: ID · (C – A) V где: ID — коэффициент разведения; C — исходное (необработанное) среднее значение (в пикограммах на про- бирку) для пробирок, содержащих образец; A — исходное (необработанное) среднее значение (в пикограммах на пробир- ку) для пробирок, содержащих отри- цательный контроль; V — объем в пробирке, в миллилитрах (обычно 0,5 мл на пробирку).
При необходимости полученный результат может быть скорректирован с учетом откры- ваемости при выделении (например, средней открываемости для конкретного продукта). 201060020-2023 2.1.6.20. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА В общей фармакопейной статье представлены рекомендации по разработке и валидации мето- дик определения остаточных белков клетки-хозя- ина, применяемых для испытаний лекарственных средств, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК, что не исключает возможно- сти использования альтернативных методов, при- знанных приемлемыми уполномоченным органом. ВВЕДЕНИЕ Белки клетки-хозяина представляют собой производственные примеси, источником кото- рых является организм, из которого получены клетки, используемые в производстве лекар- ственного средства с использованием техноло- гии рекомбинантной ДНК. Предполагают, что снижение содержания белков клетки-хозяина до минимально возможного уровня уменьшит побочные эффекты лекарственного препарата (например, иммуногенность). Необходимо оценить эффективность удале- ния белков клетки-хозяина в процессе очист- ки. Содержание белков клетки-хозяина должно быть количественно определено с помощью методики, разработанной и валидированной для конкретного лекарственного средства. Предел содержания остаточных белков клет- ки-хозяина, выраженный, как правило, в нано- граммах на миллиграмм действующего (актив- ного) вещества (ppm), должен быть обоснован с учетом эффективности процесса очистки в отно- шении белков клетки-хозяина и их потенциально- го влияния на организм пациента, исходя из введе- ния максимального количества остаточных белков клетки-хозяина с дозой лекарственного препарата. При определении допустимых пределов со- держания необходимо учитывать, что невозмож- но установить общий предел содержания остаточ- ных белков клетки-хозяина для всех конкретных лекарственных препаратов, в связи с тем, что качественные и количественные характеристики остаточных белков клетки-хозяина изменяются от одного продукта к другому и даже от одной процедуры производства (очистки) к другой. Определение остаточных белков клетки-хозя- ина, как правило, проводят методами иммунофер- ментного анализа (ИФА), используя в качестве реактивов специально приготовленный антиген (антигены) белка клетки-хозяина или стандарт- ный образец белков клетки-хозяина и соответ- ствующие поликлональные антитела. Антисы- воротка должна содержать антитела к широкому спектру белков клетки-хозяина, характерных для конкретного лекарственного средства. Для определения остаточных белков клет- ки-хозяина чаще всего используют метод «сэндвич» ИФА. Следует учитывать, что со- держание остаточных белков клетки-хозяина, определяемое с помощью ИФА, не отражает абсолютное массовое содержание примес- ных белков. Чувствительность реакции об- условлена результатом, наблюдаемым при совокупной ответной реакции на множество отдельных белков клетки-хозяина, в сравнении 45 с ответной реакцией на стандартный образец белка клетки-хозяина. При разработке и вы- боре метода определения остаточных белков клетки-хозяина для получения характеристик различных белков клетки-хозяина, содержа- щихся в лекарственном средстве, рекоменду- ется использовать ортогональные аналитиче- ские методы (например, электрофорез, ВЭЖХ, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия). ВЫБОР МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Существуют различные типы методов количественного определения остаточных бел- ков клетки-хозяина.