3 2. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ 4 2.1. МЕТОДЫ АНАЛИЗА 5 201040037-2023 2.1.4.37. МЕТАНОЛ И 2-ПРОПАНОЛ Требования общей фармакопейной статьи рас- пространяются на лекарственные средства – фар- мацевтические субстанции (настойки, настойки гомеопатические матричные, экстракты жидкие) и лекарственные препараты в жидких лекарствен- ных формах (настойки, экстракты, растворы спир- товые и др.), содержащие в своем составе этанол. Предельно допустимое содержание метано- ла в лекарственных средствах должно состав- лять не более 0,05 % и 2-пропанола – не более 0,05 %, при отсутствии других указаний в част- ной фармакопейной статье. Испытания на содержание метанола и 2-про- панола могут быть проведены методами паро- фазной газовой хроматографии (метод 1) и газо- вой хроматографии (метод 2). МЕТОД 1. ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола Р1 доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученно- го раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Испытуемый раствор. К 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта прибавляют 4,0 мл испытуе- мого образца, доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают, при необходимости фильтру- ют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор сравнения (а). К 1,0 мл метанола Р2 прибавляют 1,0 мл 2-пропанола Р2, доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (б). 5,0 мл этанола без- водного Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 25,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 100,0 мл и переме- шивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта, 2,0 мл раствора сравне- ния (а) и 2,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Условия хроматографирования: – колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покры- тая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диме- тил]силоксана Р толщиной 3 мкм; – газ-носитель: гелий для хроматографии Р; – скорость газа-носителя: 3 мл/мин; – деление потока: 1:50; – условия парофазной хроматографии: – температура уравновешивания: 85 °C; – время уравновешивания: 20 мин; – режим изменения температуры: Время (мин) Температура (°С) колонка 0 – 1,6 40 1,6 – 9,9 40 → 65 9,9 – 13,6 65 →175 13,6 – 20,0 175 блок ввода проб 200 детектор 200 – детектор: пламенно-ионизационный; – объем вводимой пробы: по 1 мл газовой фазы испытуемого раствора и раствора сравнения (в). Порядок элюирования веществ (раствор срав- нения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол. Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол – около 0,8; 2-пропанол – около 1,2; пропанол – около 1,6. Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)): – разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола. Содержание метанола в объемных процен- тах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S1 · S'2 S2 · S'1 · 40 где: S1 — площадь пика метанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S2 — площадь пика метанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); 2.1.4. ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ 6 S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).
Содержание 2-пропанола в объемных про- центах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S3 · S'2 S4· S'1 · 40 где: S3 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S4 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). МЕТОД 2. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. Испытуемый раствор. 4,0 мл испытуемого образца и 1,0 мл раствора внутреннего стандар- та доводят водой Р до объема 20,0 мл и переме- шивают, при необходимости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор сравнения (а). 1,0 мл метанола Р и 1,0 мл 2-пропанола Р доводят водой Р до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного рас- твора доводят водой Р до объема 20,0 мл и переме- шивают. Раствор сравнения (б). 1,0 мл этанола без- водного Р доводят водой Р до объема 50,0 мл и перемешивают. Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора вну- треннего стандарта, 2,0 мл раствора сравнения (а) и 1,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой Р до объема 20,0 мл и перемешивают. Условия хроматографирования: – колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покры- тая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диме- тил]силоксана Р толщиной 3 мкм; – газ-носитель: гелий для хроматографии Р; – скорость газа-носителя: 3 мл/мин; – деление потока: 1:50; – режим изменения температуры: Время (мин) Температура (°С) колонка 0 – 1,6 40 1,6 – 9,9 40 → 65 9,9 – 13,6 65 →175 13,6 – 20,0 175 блок ввода проб 200 детектор 200 – детектор: пламенно-ионизационный; – объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуе- мого раствора и раствора сравнения (в). Порядок элюирования веществ (раствор сравнения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол. Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол – около 0,8; 2-пропанол – около 1,2; пропанол – около 1,6. Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)): – разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола. Содержание метанола в объемных процен- тах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S1 · S'2 S2 · S'1 · 40 где: S1 — площадь пика метанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S2 — площадь пика метанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). Содержание 2-пропанола в объемных про- центах (об/об) рассчитывают по формуле: Х = S3 · S'2 S4· S'1 · 40 где: S3 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме испытуемого раствора; S4 — площадь пика 2-пропанола на хромато- грамме раствора сравнения (в); S'1 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора; S'2 — площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в). 7 201060011-2023 2.1.6.11. ИСПЫТАНИЕ ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ Общая фармакопейная статья описывает метод испытания на нейровирулентность живых вирусных вакцин. В каждом испытании используют не менее десяти обезьян (нечеловекообразных прима- тов), клинически здоровых и серонегативных по отношению к испытуемому вирусу. Каждой из обезьян в таламический отдел каждого полу- шария головного мозга вводят не менее 0,5 мл испытуемого образца при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.
Доза вакцины, введенной обезьяне, не должна быть меньше, чем разовая доза вакцины, рекомендо- ванная для человека. Для обнаружения возможной контамина- ции дикими нейровирулентными вирусами кон- трольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян, содержат совместно с группой иммунизированных обезьян или в непосред- ственной близости от них. Иммунизированных обезьян наблюдают 17 – 30 сут при отсутствии других указаний в частной фармакопейной ста- тье, а обезьян из контрольной группы – в тече- ние того же периода и дополнительно 10 сут. Во время наблюдения в группах отмечают возник- новение неврологических и других клинически важных симптомов. Гибель животных в первые 48 ч после инъекции считают неспецифического характера, а сами животные могут быть замене- ны другими. Результаты испытания являются достовер- ными, если: – не более 20 % иммунизированных обезьян погибают по неспецифическим причинам; – образцы сыворотки крови обезьян кон- трольной группы, отобранные во время имму- низации испытуемых животных и через 10 сут после эвтаназии последних, не имеют признаков инфекции, вызванной диким вирусом испытуе- мого типа или вирусом кори. По окончании периода наблюдения выпол- няют аутопсию и гистологическое изучение со- ответствующих отделов мозга для выявления признаков поражения центральной нервной системы. Испытуемый образец выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидае- мых клинических и гистологических признаков поражения центральной нервной системы, кото- рые могут быть вызваны введенным вирусом. 201060012-2023 2.1.6.12. ИСПЫТАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА С Испытание на бактериальные эндотокси- ны с использованием рекомбинантного фак- тора С (recombinant factor C, rFC) применяют для количественного определения эндоток- синов грамотрицательных бактерий. Испы- тания с использованием rFC, основанные на последовательности гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda), выпол- няют с использованием метода флуориметрии. Испытание осуществляют таким образом, чтобы избежать контаминации бактериальны- ми эндотоксинами. Рекомендации по применению испытания на бактериальные эндотоксины представлены в общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Приме- нение испытания на бактериальные эндотоксины. ОБОРУДОВАНИЕ Cтеклянную посуду и другое термостойкое оборудование депирогенизируют методом сухо- жаровой стерилизации, используя валидирован- ный процесс. Как правило, минимальное время и температура стерилизации составляют 30 мин при 250 °C. Если используют оборудование из полимерных материалов (например, микроти- тровальные планшеты и наконечники для авто- матических пипеток), необходимо подтвердить отсутствие на них поддающихся обнаружению эндотоксинов и других мешающих факторов. 2.1.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ 8 РЕАКТИВЫ Реактивы Рекомбинантный фактор С кодируется по- следовательностью гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda). Все ре- активы, включая флуорогенный субстрат и бу- ферный раствор для анализа, не должны содер- жать эндотоксины выше предела обнаружения. Растворы реактивов При необходимости реактивы готовят в соответствии с инструкцией производителя набора для испытания. Реактивы хранят охлаж- денными или замороженными в соответствии с инструкцией производителя. Вода для испытания на бактериальные эндотоксины Вода для инъекций Р или иная подходящая вода, не реагирующая с реактивом rFC на его пределе чувствительности.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСХОДНОГО РАСТВОРА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Исходный раствор стандартного образца эндотоксина готовят из стандартного образца эндотоксина, например, СО ФЕАЭС эндоток- сина, калиброванного относительно междуна- родного стандартного образца. Содержание бактериальных эндотоксинов в международном стандартном образце уста- навливается Всемирной организацией здраво- охранения и выражается в международных еди- ницах (МЕ). 1 МЕ эндотоксина эквивалентна 1 ЕЭ (единица эндотоксина). ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Исходный раствор стандартного образца эн- дотоксина энергично перемешивают и готовят подходящую серию разведений, используя воду для испытания на бактериальные эндотоксины. Во избежание потери активности вслед- ствие адсорбции растворы используют по воз- можности быстрее. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМЫХ РАСТВОРОВ Испытуемые растворы готовят путем растворе- ния или разведения испытуемого образца субстан- ции для фармацевтического применения или лекар- ственного препарата с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины. Для не- которых из них может быть более подходящим рас- творение или разведение в других водных раство- рах. При необходимости доводят рН испытуемого раствора так, чтобы после смешивания реактивов и испытуемого раствора значение рН полученной смеси находилось в диапазоне, указанном произ- водителем набора реактивов (обычно от 6,0 до 8,0). Значение рН доводят кислотой, основанием или подходящим буферным раствором в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов. Кислота или основание могут быть приготовлены из концентратов или твердых веществ с исполь- зованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины в контейнерах, не контаминирован- ных эндотоксинами. Буферные растворы не долж- ны содержать эндотоксины выше предела обнару- жения и другие мешающие факторы. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОГО РАЗВЕДЕНИЯ Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, позволяющее определить предельное содержание эндотоксина. МДР рас- считывают по формуле: МДР = ПСЭ · С λ где: ПСЭ — предельное содержание эндотоксинов; С — концентрация испытуемого раствора; λ — чувствительность лизата амебоцитов в международных единицах в миллилитре. Предельное содержание эндотоксинов для действующего вещества рассчитывают на осно- ве дозы лекарственного препарата для паренте- рального применения по формуле: ПСЭ = K M 9 где: K — предельная пирогенная доза эндоток- сина на килограмм массы тела; M — максимальная разовая доза лекар- ственного препарата на килограмм массы тела. Если лекарственный препарат вводится с ча- стыми интервалами или инфузионно, величина М соответствует общей максимальной дозе, вво- димой в течение 1 ч. Предельное содержание эндотоксинов выра- жают в единицах: МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/ЕД и др. Концентрацию испытуемого раствора выражают в единицах: – мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в массовых единицах (МЕ/мг); – ЕД/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/ЕД); – мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в объемных единицах (МЕ/мл). КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ФЛУОРИМЕТРИИ Метод используют для измерения флуорес- ценции (относительные единицы флуоресцен- ции, OEΦ), излучаемой флуоресцентным суб- стратом (реактивом) после его расщепления rFC, активируемым эндотоксином.
Используют метод определения флуоресцен- ции в конечной точке, основанный на количе- ственной зависимости концентрации эндотокси- на от флуоресценции смеси реактивов в конце инкубационного периода, выражаемой, напри- мер, как ΔOEΦ: ΔOEΦ = OEΦti – OEΦt0 где: OEΦti — флуоресценция смеси реактивов в конце инкубационного периода; OEΦt0 — флуоресценция смеси реактивов в начале инкубационного периода. Испытание выполняют при температуре ин- кубации в соответствии с инструкцией произво- дителя набора реактивов (обычно (37 ± 1) °C). ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ В ходе предварительных испытаний под- тверждают правильность выполнения метода. При этом должны выдерживаться требова- ния, предъявляемые к калибровочной кривой (см. раздел Критерии приемлемости калибро- вочной кривой стандартного образца эндо- токсина данной общей фармакопейной статьи), а испытуемый раствор не должен оказывать вли- яния на проведение испытания (см. раздел Ме- шающие факторы данной общей фармакопей- ной статьи). При внесении в условия испытания измене- ний, способных повлиять на его результаты, необ- ходимо провести валидацию методики испытания. КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Испытание должно быть выполнено для каждой серии реактива rFC. Чувствительность прибора должна быть настроена в соответствии с инструкцией произ- водителя набора реактивов для испытания. Для построения калибровочной кривой используют исходный раствор стандартного об- разца эндотоксина, из которого готовят не менее трех растворов с концентрациями эндотоксина в диапазоне, указанном производителем набора реактивов. Если требуемый для испытания ди- апазон превышает 2 lg диапазона, указанного производителем, необходимо использовать до- полнительные растворы эндотоксина с шагом lg. Выполняют испытание, используя не менее трех повторностей растворов каждой концентрации эндотоксина в соответствии с инструкцией про- изводителя (соотношение объемов, время инку- бации, температура, рН и др.). Абсолютное значение коэффициента корре- ляции | r | для диапазона приготовленных концен- траций эндотоксина должно быть не менее 0,980. МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Поскольку при проведении испытания c реактивом rFC фактор G не используется, то получения ложноположительных резуль- татов вследствие его активации β-глюканом не ожидается, что требует учета при сравнении 10 метода с другими методами количественной оценки бактериальных эндотоксинов. Концентрацию эндотоксинов выбирают око- ло центра калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с таблицей 2.1.6.12.-1. Выполняют испытание не менее чем на двух повторностях этих растворов в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов для испытания (объемы испы- туемого раствора и смеси реактивов, объемное соотношение испытуемого раствора и смеси ре- активов, время инкубации и др.). Результаты испытания считают достоверны- ми, если выполняются следующие условия: – абсолютное значение коэффициента кор- реляции калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина не менее 0,980; – результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC. Рассчитывают среднее значение открыва- емости добавленного эндотоксина, вычитая из среднего значения концентрации эндотокси- на в растворе B (содержащего добавленный эн- дотоксин, таблица 2.1.6.12.-1) среднее значение концентрации эндотоксина в растворе A (если эндотоксин обнаружен, таблица 2.1.6.12.-1).
Считают, что испытуемый раствор не содер- жит мешающих факторов, если в условиях ис- пытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор, находится в пределах 50 – 200 % от известной концентра- ции добавленного эндотоксина после вычитания любого эндотоксина, обнаруженного в растворе без добавления эндотоксина. Если значение открываемости эндотоксина выходит за пределы указанного диапазона, счи- тают, что испытуемый раствор содержит меша- ющие факторы. Повторяют испытание, исполь- зуя большее разведение, не превышающее МДР. Кроме того, влияние испытуемого раствора (в разведении, не превышающем МДР) можно устранить обработкой с помощью валидирован- ных методов, таких как фильтрация, нейтрали- зация, диализ, термическая обработка или эта- пы связывания, специфичные для эндотоксина (обогащение эндотоксина из испытуемого рас- твора до обнаружения при отсутствии мешаю- щей матрицы). Для установления эффективно- Таблица 2.1.6.12.-1. – Приготовление растворов для испытания Раствор Концентрация эндотоксинов Раствор, к которому прибавляют эндотоксины Количество повторностей A отсутствует испытуемый раствор ≥ 2 B средняя концентрация на калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина испытуемый раствор ≥ 2 C минимум 3 концентрации (наименьшую концентрацию обозначают λ) вода для испытания на бактериальные эндотоксины каждой концентрации ≥ 2 D отсутствует вода для испытания на бактериальные эндотоксины ≥ 2 Примечание. Раствор A – испытуемый раствор, разведение которого не превышает МДР. Раствор B (положительный контроль) – испытуемый раствор в таком же разведении, как и раствор A, содержащий добавленный эндотоксин в концентрации, близкой к центру калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Раствор C – раствор стандартного образца эндотоксина в концентрациях, используемых при валидации методики, как описано в разделе Критерии приемлемости калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина данной общей фармакопейной статьи. Раствор D (отрицательный контроль) – вода для испытания на бактериальные эндотоксины. 11 сти устранения мешающего влияния выбранным методом обработки без потери эндотоксинов повторяют испытание на мешающие факторы, добавляя к испытуемому раствору стандартный раствор эндотоксина, с последующей его обра- боткой выбранным методом. ИСПЫТАНИЕ МЕТОДИКА Проводят испытание по методике, описан- ной в разделе Мешающие факторы данной общей фармакопейной статьи. РАСЧЕТЫ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Рассчитывают концентрацию эндотоксинов для каждой повторности раствора A, используя калибровочную кривую стандартного образца эндотоксина, полученную на основании рас- твора C стандартного образца эндотоксина. Результаты испытания считаются достовер- ными, если выполняются следующие условия: – результаты, полученные для раствора C, соответствуют требованиям к валидации, указан- ным в разделе Критерии приемлемости калибро- вочной кривой стандартного образца эндоток- сина данной общей фармакопейной статьи; – открываемость эндотоксина, рассчитан- ная из концентрации эндотоксина, обнаружен- ной в растворе B, после вычитания концентра- ции эндотоксина, обнаруженного в растворе A, находится в диапазоне 50 – 200 %; – результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ Испытуемый образец выдерживает испытание, если средняя концентрация эндотоксинов в повторностях раствора A с учетом разведений и концентраций ниже предельного содержания эндотоксинов.
201060013-2023 2.1.6.13. ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ Настоящая фармакопейная статья представ- ляет методы для обнаружения или количествен- ного определения бактериальных эндотоксинов и пирогенов неэндотоксиновой природы с ис- пользованием моноцитов или моноцитарных клеток человека в испытаниях in vitro. Испытание на активацию моноцитов подхо- дит для замены испытания Пирогенность после валидации методики для конкретного лекар- ственного средства. Дополнительную информацию о практиче- ских аспектах испытаний можно найти в разде- ле Рекомендации по применению данной общей фармакопейной статьи. 1. ВВЕДЕНИЕ В основу методов на активацию моноцитов положена способность моноцитов или моно- цитарных клеток человека в присутствии пи- рогенных веществ продуцировать эндогенные медиаторы, в частности, провоспалительные цитокины (фактор некроза опухолей (ФНО-α), интерлейкин-1β (ИЛ-1β) и интерлейкин-6 (ИЛ-6) и др.). Провоспалительные цитокины принимают участие в патогенезе лихорадки, по- этому испытание на активацию моноцитов мо- жет выявлять весь спектр пирогенов в испытуе- мом образце. При испытании лекарственных средств, содержащих неэндотоксиновые пирогены (напри- мер, пептидогликаны, дрожжи, грибы, вирусы) или провоспалительные цитокины, часто получают очень крутые или нелинейные кривые зависимо- сти «доза – ответ», в сравнении с кривыми зависи- мости «доза – ответ» эндотоксинов. Лекарствен- ные средства, которые могут содержать пирогены, отличные от бактериальных эндотоксинов, необ- ходимо испытывать в диапазоне концентраций, включающих минимальное разведение. В данной общей фармакопейной статье пред- ставлены три метода. Метод 1. Количественное испытание. Метод 2. Полуколичественное испытание. Метод 3. Сравнительное испытание с кон- трольной серией (серия, утвержденная в каче- стве контрольной). Испытания проводит таким образом, чтобы избежать контаминации пирогенами. 2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Максимально допустимое разведение представляет собой наибольшее разведение 12 испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое содержание пирогена. Максимально допустимое разведение рассчитывают по формуле: МДР = ПСП · С Предел обнаружения где: ПСП — предельное содержание пирогенов; С — концентрация испытуемого раствора. Поскольку предел обнаружения не всегда известен заранее, для расчета максимально до- пустимого разведения могут быть использова ны архивные данные. Критерием приемлемости для принятия положительного или отрицательного решения является предельное содержание пирогенов, которое выражают в эквиваленте единиц эн- дотоксина на миллиграмм или миллилитр, или на единицу биологической активности лекар- ственного средства. Предельное содержание пирогенов рассчи- тывают по формуле: ПСП = K M где: K — предельная пирогенная доза бактери- ального эндотоксина из расчета на ки- лограмм массы тела; М — максимальная разовая доза испы- туемого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела. В случае введения лекарственного препа- рата через частые интервалы или инфузионно, в качестве «М» используют общую максималь- ную дозу, введенную в течение одного часа. В случае, когда для лекарственного средства установлено предельное содержание эндоток- сина, предельное содержание пирогенов будет равно предельному содержанию эндотоксинов, при отсутствии других указаний в частной фар- макопейной статье.
В этом случае концентрация испытуемого раствора выражается: ‒ в мг/мл, если предельное содержание эндоток- синов установлено в массовых единицах (МЕ/мг); ‒ в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед); ‒ в мл/мл, если предельное содержание эндо- токсинов выражено в объемных единицах (МЕ/мл). Эквиваленты эндотоксина ‒ значения кон- центрации пирогенного вещества, вычисленные по кривой «доза – ответ» стандартного образца эндотоксина (метод 1) или значения, рассчиты- ваемые путем сравнения реакций с растворами стандартного образца эндотоксина (метод 2). Исходный раствор готовят из стандартного об- разца эндотоксина, калиброванного относитель- но Международного стандарта эндотоксина, например СО ФЕАЭС эндотоксина. Предел обнаружения определяют с исполь- зованием калибровочной кривой стандартно- го образца эндотоксина. Предел обнаружения представляет собой концентрацию эндотоксина, равную предельному значению, выраженному в единицах, соответствующих показаниям де- тектирующих приборов (например, для им- муноферментного анализа используют погло- щение (оптическую плотность). Для целей данногоиспытанияпределобнаружениявыражают как эквивалент эндотоксина на миллилитр. Предельное значение рассчитывают по фор- муле: X _ + 3s где: X _ — среднее значение четырех повтор- ностей реакций на отрицательный контроль (R0); s — стандартное отклонение четырех повторностей реакций на отрица- тельный контроль (R0). 3. ОБЩАЯ ПРОЦЕДУРА Испытуемый раствор инкубируют с источни- ком моноцитов человека или с линией моноци- тарных клеток человека. Источником моноцитов человека могут быть: гепаринизированная пери- ферическая кровь человека, отобранная не более, чем за 4 ч до испытания; моноцитсодержащая фракция крови, например, мононуклеарные клет- ки периферической крови человека, выделенные центрифугированием в градиенте плотности. Гепаринизированную периферическую кровь человека обычно разводят культуральной сре- дой или физиологическим раствором, например, до концентрации от 2 % до 50 % (об/об). Монону- клеарные клетки периферической крови человека или линии моноцитарных клеток в культуральной среде с добавлением плазмы донора или сыво- 13 ротки АВ (IV группа крови) обычно используют при окончательной плотности клеток 0,1 – 1,0×106 клеток на лунку, пробирку или другую емкость. При использовании линий моноцитарных клеток сыворотку АВ можно заменить на фетальную бы- чью сыворотку, инактивированную нагреванием. Культура клеток готовится при температуре (37 ± 1) °С в подходящей атмосфере для культу- ральной среды, например, увлажненном воздухе с 5 % СО2. Продолжительность культивирования должна быть достаточной для накопления мар- керов пирогена. Реакцию выбранного маркера, например, провоспалительного цитокина, срав- нивают с реакциями на стандартный образец эндотоксина или контрольную серию испытуе- мого препарата. 4. ОБОРУДОВАНИЕ Всю стеклянную посуду и другой расход- ный материал, устойчивую к нагреванию, депи- рогенизируют в стерилизационном воздушном шкафу с использованием валидированной про- цедуры. Общепринятым минимальным режи- мом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °С не менее 30 минут. Если используют пластиковый материал, в частно- сти микропланшеты и наконечники для автома- тических пипеток, необходимо убедиться, что данное оборудование не содержит пирогенов и не влияет на испытание. 5. ИСТОЧНИКИ КЛЕТОК И КВАЛИФИКАЦИЯ 5.1.
ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ Цельную кровь получают от доноров или от пулов цельной крови, которые квалифициру- ют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 5.2. МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Мононуклеарные клетки перифериче- ской крови выделяют из крови, полученной от доноров или из пулов цельной крови, которые квалифицируют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фарма- копейной статьи. 5.3. КВАЛИФИКАЦИЯ ДОНОРОВ Доноры крови должны соответствовать при- веденным квалификационным критериям на- ряду с другими действующими требованиями в отношении согласия на процедуру, здоровья, безопасности и этических принципов. Доно- ры должны описывать себя как «здоровые», «не страдающие любыми бактериальными или вирусными инфекциями» и «не имеющие симптомов любой инфекции в течение пери- ода не менее одной недели перед сдачей кро- ви». Доноры не должны принимать нестеро- идные противовоспалительные лекарственные препараты в течение 48 ч перед сдачей крови и стероидные противовоспалительные лекар- ственные препараты – в течение 7 дней перед сдачей крови. Лица, которым были назначены иммунодепрессанты или другие лекарствен- ные препараты, которые влияют на выработ- ку выбранных показателей, не могут быть до- норами крови. Донорская кровь должна быть обследована на инфекционные маркеры в со- ответствии с национальными требованиями по трансфузиологии. 5.4. КВАЛИФИКАЦИЯ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЕННЫХ ОТ РЯДА ДОНОРОВ Пулы (цельной крови или компонентов крови, например мононуклеарные клетки пери- ферической крови) должны состоять из порций крови минимум от четырех индивидуальных доноров, но предпочтительно от восьми или бо- лее доноров; пулы формируются путем отбора от каждого пакета донорской крови приблизи- тельно одинаковых объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови. Для квалификации объединенных в пул клеток действуют следующим образом: в течение 4 ч с момента сбора крови строят кривые «доза – ответ» для пула с использованием рас- творов стандартного образца эндотоксина в не менее чем четырех разведениях, например, в диапазоне от 0,01 МЕ/мл до 4 МЕ/мл. Кривые «доза – ответ» должны отвечать двум критериям для калибровочной кривой, описан- ным в разделе 6.1 данной общей фармакопей- ной статьи. Если пул должен использоваться для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, то пулы должны быть квалифицированы, как опи- сано в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи. При объединении клеток, эффект усред- нения должен учитываться при утверждении ста- 14 туса соответствия («соответствует» или «не соот- ветствует») спецификации данного продукта. 5.5. КВАЛИФИКАЦИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК В качестве источника клеток в испытании на активацию моноцитов могут быть использо- ваны криоконсервированные клетки, например, кровь доноров, мононуклеарные клетки перифе- рической крови или моноцитарные клеточные ли- нии. Пулы криоконсервированных клеток полу- чают объединением перед замораживанием, или объединением единичных криоконсервирован- ных донорских порций сразу же после оттаивания. Квалификацию криоконсервированной крови или клеток выполняют сразу же после оттаивания (и объединения, в случае необходимости). Кри- вые «доза – ответ» для криоконсервированных крови или клеток должны отвечать двум крите- риям для калибровочной кривой, описанным в разделе 6.1 данной общей фармакопейной ста- тьи.
Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их квалификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 5.6. НЕПРЕРЫВНАЯ ЛИНИЯ МОНОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК Моноцитарные клеточные линии подходят для обнаружения бактериальных эндотоксинов, но имеют ограниченное применение для обна- ружения неэндотоксиновых пирогенов. Линию моноцитарных клеток необходимо постоянно культивировать для обеспечения достаточного количества клеток при использовании в испыта- нии на активацию моноцитов. Для оптимизации метода можно использовать клоны, полученные из клеточной линии. Клеточные линии должны поддерживаться в асептических условиях и регулярно контроли- роваться на контаминацию микоплазмами. Кро- ме того, клетки должны регулярно проверяться на идентичность (например, время удвоения, морфология и функции) и стабильность. Функциональная стабильность клеточ- ной линии оценивается путем наблюдения за ее состоянием с учетом количества пасса- жей в процессе рутинных испытаний. Должны быть установлены критерии функциональной стабильности, которые могут включать крите- рии роста, максимальную реакцию, получен- ную в испытании, фоновый шум и экспрессию рецептора. Экспрессию рецептора можно про- верить с помощью специфических лигандов, на- пример, липополисахарида для толл-подобного рецептора 4 (TLR4), липотейхоевой кислоты для толл-подобного рецептора 2 (TLR2), син- тетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR1 или синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR6 или флагеллина. Кривые зависимости «доза – ответ» долж- ны соответствовать двум критериям калибро- вочной кривой стандартного образца эндоток- сина, описанным в разделе 6.1 данной фарма- копейной статьи. Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их ква- лификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи. 6. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ Для обеспечения прецизионности и точно- сти испытания на активацию моноцитов про- водят предварительные испытания, в которых проверяют выполнение критериев для кривой стандартного образца эндотоксина, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать эндоток- сины и неэндотоксиновые пирогены, отсутствие влияния растворов на детектирующую систему. Проведение испытаний на мешающие факторы требуется, если в условия эксперимента вносят- ся какие-либо изменения, которые могут повли- ять на его результат. 6.1. КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ ДЛЯ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА Из раствора стандартного образца эндоток- сина готовят не менее 4 растворов с различными концентрациями эндотоксина для построения калибровочной кривой. Проводят испытание, используя не менее 4 повторностей каждой концен- трации раствора стандартного образца эндотокси- на. Базовое высвобождение выбранного маркера в отсутствие добавленного раствора стандартно- го образца эндотоксина должно быть оптимизи- ровано до наиболее низкого возможного уровня (например, при использовании иммунофермент- ного анализа оптическая плотность ниже 0,1). Для калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина должны выполняться два критерия приемлемости: 15 ‒ регрессионная зависимость ответов (со- ответственно преобразованных при необходи- мости) от lg дозы должна быть статистически значима (р < 0,01); ‒ регрессионная зависимость ответов на lg дозы не должна существенно отличаться от ли- нейности (р > 0,05) (2.3.12.0). 6.2.
ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Для обеспечения точности испытания про- водят предварительные испытания, подтверж- дающие отсутствие влияния испытуемого об- разца на результаты испытания. Используя подходящий растворитель, готовят разведения испытуемого образца в геометрической прогрес- сии (1:2, 1:4 и т.д.) не превышающие максималь- но допустимого разведения. Аналогично готовят разведения испытуемого образца и прибавляют эндотоксин в соответствующей концентрации. В качестве альтернативы можно использовать разбавитель, содержащий добавленный эн- дотоксин в соответствующей концентрации. В обоих случаях соответствующая концентра- ция эндотоксина равна или близка к середине калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина (метод 1) или вдвое превышает рас- четное значение предела обнаружения (метод 2). Проводят испытания полученных рядов разведений параллельно в одном эксперименте. Для вычисления концентрации эквивалентов эн- дотоксина в каждом растворе используют кали- бровочную кривую. Вычисляют среднее значение открывае- мости добавленного эндотоксина в растворе с добавлением стандартным образцом эндоток- сина. Для этого из концентрации эквивалента эндотоксина в растворе с добавленным стан- дартным образцом эндотоксина вычитают сред- нюю концентрацию эквивалента эндотоксина в растворе (при его наличии). Считают, что испытуемый раствор не со- держит мешающих факторов, если в условиях испытания вычисленная концентрация эквива- лентов эндотоксина в испытуемом растворе с добавлением стандартного образца эндотоксина находится в пределах от 50 % до 200 % от из- вестной концентрации добавленного стандарт- ного образца эндотоксина, после вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина, обна- руженных в растворе без добавления стандарт- ного образца эндотоксина. Если испытание не отвечает этому критерию, следует провести ис- пытание методом 3. В методе 3 разведения исследуемых и кон- трольных серий зависят от типа анализа, ис- пользуемого для сравнения между ними. Тип анализа должен быть обоснован и валидирован для каждого лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Например, испытания проводят на 3 разведениях испыту- емого образца: наибольшая концентрация (наи- меньшее разведение), при котором наблюдают наибольшее высвобождение выбранного марке- ра, и двукратные разведения непосредственно выше и ниже выбранного разведения. В связи с тем, что концентрация испытуемого образца с наибольшим высвобождением выбранного мар- кера может зависеть как от особенностей клеток или крови донора, так и серии лекарственного средства, должна быть проведена валидация методики в отношении конкретного лекарствен- ного средства в трех независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров. Наибольшая концентрация (наименьшее разведение), при которой реги- стрируется наибольшее высвобождение выбран- ного маркера у большинства доноров и двукрат- ные разведения непосредственно ниже и выше выбранного разведения, считаются пригодны- ми для дальнейшего выполнения испытания. Если наибольшее высвобождение выбранно- го маркера происходит при испытании исходного испытуемого раствора, то последующее испы- тание должны выполнять с использованием не- разведенного (исходного) испытуемого раство- ра, а также испытуемого раствора, разведенного в соотношениях 1:2 и 1:4 перед его добавлением к моноцитарным клеткам. Степень разведения для этих трех растворов обозначают как f1, f2 и f3.
Если содержание пирогена в образце исход- но высокое, то целесообразнее использовать мо- дель параллельных линий для анализа кривых «доза – ответ» для испытуемой и контрольной серий. В таком случае, растворы испытуемых образцов испытывают в 3 или более геометри- ческих разведениях, которые охватывают ди- апазон кривой «доза – ответ», используемый для выбранного анализа (2.3.12.0). 16 6.3. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЭНДОТОКСИНОВЫХ ПИРОГЕНОВ В предварительных испытаниях также под- тверждают способность выбранной тест-си- стемы обнаруживать не только бактериальные эндотоксины, но и неэндотоксиновые пирогены. Пригодность метода для конкретного лекарствен- ного средства должна быть проверена. Для этого можно использовать архивные серии, наличие в которых неэндотоксиновых пирогенов было определено по положительным реакциям в ис- пытании Пирогенность или при развитии лихо- радочных реакций у человека. При отсутствии таких серий лекарственных средств, предвари- тельные испытания должны включать валидацию используемой методики с использованием не ме- нее двух неэндотоксиновых лигандов толл-по- добных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевой кислоты, синтетических бакте- риальных липопротеинов, флагеллина и неочи- щенного бактериального экстракта цельных кле- ток. Выбор неэндотоксинового пирогена должен отражать наиболее вероятное загрязнение иссле- дуемого лекарственного средства. 6.4. ВЛИЯНИЕ НА СИСТЕМУ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ Определяют оптимальное разведение рас- твора испытуемого образца и проверяют его влияние на систему детектирования (например, иммуноферментного анализа) для выбранного маркера. Различие в определяемых концентра- циях разведений стандарта выбранного маркера в присутствии и отсутствии испытуемого образ- ца должно находиться в диапазоне ± 20 % погло- щения (оптической плотности). 7. МЕТОДЫ 7.1. МЕТОД 1: КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ Метод 1 основан на сравнении реакции испы- туемого лекарственного средства с калибровочной кривой раствора стандартного образца эндотокси- на. Концентрация пирогенных веществ в испытуе- мом лекарственном средстве не должна превышать значение предельного содержания пирогенов. 7.1.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-1. Квалифицированные клетки культивируют в четырех повторностях с каждым из растворов. 7.1.2. Вычисления и обработка результатов Для обработки результатов используют дан- ные, относящиеся к клеткам, соответствующие двум критериям калибровочной кривой стан- дартного образца эндотоксина. Для каждого источника клеток (индивидуальное донорство, донорский пул или клеточная линия) при расче- те концентрации эквивалентов эндотоксина в ка- ждой из повторностей растворов A, B, C, AS, BS и CS используют калибровочную кривую R1-R4. Открываемость эквивалентов эндотоксина, рассчитанная путем вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина в растворе А, B, C из концентраций эквивалентов эндотоксина в растворе AS, BS и CS, соответственно, должна находится в диапазоне от 50 % до 200 %. Разве- дения, не соответствующие данным условиям, исключают из дальнейшей обработки. Испытуемое лекарственное средство отвечает требованиям испытаний для конкретного источ- ника клеток, если средние концентрации эквива- лентов эндотоксина, полученные в повторностях раствора А, В и С, с учетом поправок на разведе- ние, меньше предельного содержания пирогенов, установленного для испытуемого лекарствен- ного средства. Одно отвечающее требованиям разведение является минимальным требованием для признания пригодности испытания.
7.1.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства При использовании клеток от индивиду- альных доноров, испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание, проведенное с клетками от каждого из четы- рех различных доноров. Если испытуемое ле- карственное средство выдерживает испытание с клетками от трех из четырех доноров, то ис- пытание продолжают с клетками от других че- тырех доноров, клетки от которых не исполь- зовались в первом испытании. Испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с клетками от семи из восьми раз- личных доноров (то есть, допускается только одна положительная реакция при использова- нии клеток от восьми доноров). Если источник моноцитов представляет собой клетки, объе- диненные от ряда индивидуальных доноров, испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с одним пулом клеток. При использовании линии моноцитар- 17 Таблица 2.1.6.13.-1. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор Добавленный эндотоксин (МЕ/мл) Число повторностей А испытуемый раствор / f нет 4 В испытуемый раствор / 2 × f нет 4 С испытуемый раствор / 4 × f нет 4 AS испытуемый раствор / f середина калибровочной кривой (R3) 4 BS испытуемый раствор / 2 × f середина калибровочной кривой (R3) 4 CS испытуемый раствор / 4 × f середина калибровочной кривой (R3) 4 R0 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель нет (отрицательный контроль) 4 R1-R4 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель 4 концентрации раствора стандартного образца эндотоксина 4 каждой концентрации Примечание. ƒ – разведение раствора. Раствор A – раствор испытуемого лекарственного средства в наименьшем разведении ƒ, при котором было прове- дено испытание на мешающие факторы, то есть наибольшая концентрация (наименьшее разведение), для которой открываемость эндотоксина находится в пределах от 50 % до 200 %. Раствор B – двукратное разведение раствора A, не превышающее максимально допустимого разведения. Раствор C – двукратное разведение раствора B, не превышающее максимально допустимого разведения. Раствор AS – раствор A, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор BS – раствор B, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор CS – раствор C, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибро- вочной кривой (R3). Раствор R0 – отрицательный контроль. Растворы R1-R4 – растворы стандартного образца эндотоксина в концентрациях, использованных в испытании на мешающие факторы. ных клеток человека, испытуемое лекарствен- ное средство должно выдерживать испытание с одним соответствующим пассажем клеток. 7.2. МЕТОД 2: ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ При испытании методом 2 проводят срав- нение испытуемого лекарственного средства со стандартным образцом эндотоксина. Кон- центрация пирогена в испытуемом лекарствен- ном средстве должна быть меньше предельного содержания пирогенов. Для принятия решения о соответствии испытания используют раствор А, при отсутствии другого обоснования и разре- шения уполномоченного органа. 7.2.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-2. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях. 7.2.2.
Вычисления и обработка результатов Все результаты, включаемые в анализ дан- ных, должны быть связаны с клетками, для ко- торых среднее значение откликов на растворы R0-R4 увеличиваются в прогрессии. Среднее значение откликов на R0 может быть равным среднему значению откликов на R1. Для каж- дого конкретного источника клеток, среднее значение откликов на раствор R2 должно быть 18 Таблица 2.1.6.13.-2. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор Добавленный эндотоксин (МЕ/мл) Число повторностей А испытуемый раствор / f нет 4 B испытуемый раствор / f1 нет 4 С испытуемый раствор / f2 нет 4 AS испытуемый раствор / f стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 BS испытуемый раствор / f1 стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 CS испытуемый раствор / f2 стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 R0 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель нет (отрицательный контроль) 4 R1 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 0,5 × предел обнаружения для используемой системы 4 R2 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 1 × предел обнаружения для используемой системы 4 R3 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 2 × предел обнаружения для используемой системы 4 R4 апирогенный физиологический раствор или испытуемый растворитель стандартный образец эндотоксина 4 × предел обнаружения для используемой системы 4 Примечание. f, f1, f2 – степень разведения раствора. Раствор А – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f, при котором было проведено испытание на мешающие факторы. Раствор В – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f1 не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например 1:2 × максимально допустимое разведение (то есть, разведение в два раза меньше, чем максимально допустимое разведение). Раствор С – раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f2 не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например максимально допустимого разведения. Раствор AS – раствор А с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы (как определено в предварительном испытании). Раствор BS – раствор В с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор CS – раствор С с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R0 – отрицательный контроль. Раствор R1 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 0,5 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R2 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 1 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R3 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 2 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. Раствор R4 – стандартный образец эндотоксина в концентрации 4 × расчетный предел обнаружения для используемой системы. 19 больше положительного предельного значе- ния.
Результаты ниже этого положительного предельного значения рассматриваются как отрицательный отклик. Если среднее значе- ние ответных реакций на R1 или R2 превыша- ют предельное значение, то отклик на раствор, выбранный для оценки соответствия или не- соответствия лекарственного средства требо- ваниям, должен быть отрицательным (лекар- ственное средство выдерживает испытание). Для определения открываемости (%) добав- ки для каждого отрицательного раствора ис- пытуемого лекарственного средства (A, B и C) сравнивают среднее значение отклика соответ- ствующих растворов с добавленным стандарт- ным образцом эндотоксина (AS, BS или CS, соответственно) со средним значением отклика раствора R3. Если раствор испытуемого лекарственного средства, выбранный для оценки соответствия или несоответствия, и все разведения ниже его дают отрицательные результаты и определяе- мая концентрация добавленного стандартного образца эндотоксина находится в диапазоне от 50 % до 200 %, то концентрация пирогенного вещества в испытуемом лекарственном сред- стве меньше предельного содержания пироге- нов для данного источника клеток. 7.2.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства Критерии те же, что и для Метода 1 (см. раз- дел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи). 7.3. МЕТОД 3: СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ С КОНТРОЛЬНОЙ СЕРИЕЙ При испытании методом 3 проводится срав- нение испытуемого лекарственного средства с валидированной серией этого лекарственного средства, выбранной в качестве контрольной. Тип анализа, выбранный для их сравнения, дол- жен быть обоснован и подтвержден для каждо- го лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Контрольная серия также выбирается в соответствии с обоснован- ными и утвержденными критериями. Данное испытание предназначено для случаев, когда ис- пытуемое лекарственное средство оказывает за- метное мешающее действие, но не может быть разведено в диапазоне максимально допустимо- го разведения для его устранения, или предпо- лагается, что лекарственное средство содержит неэндотоксиновые пирогены. Реакции на неэндотоксиновые пирогены мо- гут быть более быстрыми и выраженными, чем реакции на эндотоксины, что делает необходи- мым выполнение испытания в диапазоне разве- дений, включающем минимальное разведение. Процедура испытания описана в разделе 7.3.1 данной общей фармакопейной статьи и включа- ет пример анализа, используемого для сравне- ния испытуемой серии с контрольной серией. 7.3.1. Процедура испытания Используя валидированную методику испы- тания, готовят растворы, представленные в та- блице 2.1.6.13.-3. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях. 7.3.2. Вычисления и обработка результатов Все результаты, включаемые в обработку данных, должны быть получены на клетках, у которых раствор G и хотя бы один из растворов А, В и С вызывал ответную реакцию, превыша- ющую минимальный уровень высвобождения выбранного маркера (раствор R0). Для каждого конкретного источника клеток, например, инди- видуального донора, пула доноров или клеточ- ной линии, используют кривую «доза – ответ» для маркера (калибровочная кривая в двух по- вторностях с отрицательным контролем и не менее 4 разведений стандарта маркера в геоме- трической прогрессии) и вычисляют среднюю величину реакций на растворы A‒F. Суммируют средние ответные реакции на растворы А, В и С и средние ответные реакции на растворы D, Е и F. Делят сумму средних от- ветов на растворы D, Е и F на сумму средних ответов на растворы А, В и С.
Испытуемое ле- карственное средство отвечает требованиям ис- пытания для данного источника клеток, если по- лученное значение не превышает установленное значение критерия приемлемости, например 2,5. 7.3.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства Критерии те же, что и для метода 1 (см. раз- дел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи). Для более точного количественного опре- деления уровня контаминации методы 1, 2 и 3 могут выполняться с использованием других разведений раствора испытуемого лекарствен- ного средства, не превышающих максимально допустимого разведения. 20 Следующий раздел приводится для информации РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ 1. ВВЕДЕНИЕ Испытание на активацию моноцитов в первую очередь предназначено для использо- вания в качестве замены испытания на Пиро- генность. Испытание на активацию моноцитов позволяет обнаруживать пирогенные и провос- палительные вещества: эндотоксины грамотри- цательных бактерий и пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, включая пато- ген-ассоциированные молекулярные паттерны грамположительных и грамотрицательных бак- терий, вирусов и грибов; химические вещества, характерные для лекарственного средства и/или образующиеся в процессе производства. Пиро- генные вещества, отличные от эндотоксинов, представляют собой молекулы с разнообраз- ными физико-химическими характеристиками, и обычно природа пирогена, присутствующего в испытуемом лекарственном средства, неиз- вестна. Уровень содержания неэндотоксино- вых пирогенов выражается или в эквиваленте единиц эндотоксина, полученным путем срав- нения со стандартом эндотоксина или с серией испытуемого лекарственного средства, утверж- денной в качестве контрольной. В испытании на активацию моноцитов кон- центрации маркеров, образующихся в резуль- тате реакции на стандарт эндотоксина, обыч- но разводят приблизительно в 10 раз (на 1 lg) и при испытании лекарственных средств, со- держащих неэндотоксиновые пирогены (толь- ко неэндотоксиновые пирогены или в комби- нации с эндотоксинами), при определении их способности стимулировать моноциты часто получают очень крутые кривые «доза – ответ» (обычно лишь в диапазоне 1 или 2 степеней разведений). Чаще всего наибольшие ответ- ные реакции на такие лекарственные средства получают при использовании неразведенных растворов или небольших разведений испыту- емых лекарственных средств. По этой причине испытуемые растворы лекарственных средств, которые содержат или могут содержать неэн- дотоксиновые пирогены, должны испытывать- Таблица 2.1.6.13.-3. – Приготовление растворов для испытания Раствор Раствор/степень разведения Число повторностей A раствор контрольной серии / f1 4 B раствор контрольной серии / f2 4 C раствор контрольной серии / f3 4 D раствор контрольной серии / f1 4 E раствор испытуемого лекарственного средства / f2 4 F раствор испытуемого лекарственного средства / f3 4 G положительный контроль (стандартный образец эндотоксина) 4 R0 растворитель (отрицательный контроль) 4 Примечание. f, f1, f2 ‒ степень разведения раствора. Растворы А, В и С ‒ разведения контрольной серии в степенях разведения f1, f2 и f3 определенных в испытании на мешающие факторы. Растворы D, Е и F ‒ разведения испытуемого лекарственного средства в степенях разведения f1, f2 и f3 определенных для контрольной серии в испытании на мешающие факторы. Раствор G – положительный контроль жизнеспособности клеток; представляет собой раствор стандартного образца эндотоксина в концентрации, при которой наблюдается однозначная положительная реакция.
Раствор R0 – растворитель, используемый для разведения испытуемого лекарственного средства; отрицательный контроль. 21 ся в диапазоне разведений, который включает минимальное разведение. 2. МЕТОДЫ 2.1. Информация относительно выбора методов Методы 1, 2 и 3 обычно не применяют в слу- чаях, когда испытуемое лекарственное средство может активировать высвобождение выбранного маркера, или когда одной из примесей в испыту- емом лекарственном средстве является выбран- ный маркер. В обоих случаях эти обстоятельства должны привести к модификации и валидации выбранного метода. Предполагается, что при валидации выбранно- го метода в отношении маркера будут определены: ‒ частота отсутствия реакции на соответ- ствующую комбинацию лекарственного сред- ства с пирогенными примесями; ‒ выбор мер по обеспечению надежности результатов испытаний, например, скрининг до- норов, увеличение числа доноров, у которых по- лучают клетки для каждого испытания; ‒ установление достаточно строгих критериев соответствия или несоответствия для макси- мального увеличения вероятности обнаруже- ния серий лекарственных средств, содержащих существенное количество пирогенов. Метод 1 подходит для испытания, если результаты различных разведений (эквивалент эндотоксина на миллилитр) показывают, что кривая «доза – ответ» параллельна калибровоч- ной кривой стандартного образца эндотоксина. Метод 2 является полуколичественным ис- пытанием, который можно применять, когда ответные реакции на разведения испытуемого лекарственного средства не параллельны от- ветным реакциям на разведения стандартного образца эндотоксина. Метод 3 – сравнительное испытание с кон- трольной серией испытуемого лекарственного средства. Метод 3 подходит для случаев со зна- чительной индивидуальной вариабельностью реакций донорских клеток на определенные комбинации лекарственных средств с пирогена- ми. Следует отметить, что реакция моноцитов большинства доноров на бактериальный эндо- токсин приблизительно одинакова, тогда как реакции моноцитов отдельных доноров на не- эндотоксиновые пирогены могут существенно различаться, что позволяет идентифицировать клетки «не реагирующие на неэндотоксиновые пирогены» и клетки со «слабой» и «сильной» реакцией на определенные комбинации лекар- ственных средств и пирогенных веществ. 2.2. Вычисление предельной концентрации пирогена Критерием приемлемости для принятия ре- шения о соответствии или несоответствии явля- ется предельное содержание пирогена, которое выражается в эквивалентах эндотоксина на мил- лиграмм или миллилитр или на единицы биоло- гической активности испытуемого лекарствен- ного средства. Если предельное содержание эндотоксина для лекарственного средства уста- новлено, то предельное содержание пирогена будет равно предельному содержанию эндоток- сина, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Предельное содержание пирогена выражают в эквивалентах эндотоксина и рассчитывают по формуле: ПСП = K M где: K — предельная пирогенная доза бактери- ального эндотоксина из расчета на килограмм массы тела; М — максимальная разовая доза испытуе- мого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела. В случае введения лекарственного препарата через частые интервалы или инфузионно, в ка- честве «М» используют общую максимальную дозу, вводимую в течение одного часа. Предельное содержание пирогена зависит от лекарственного препарата, пути его введения и представлено в некоторых частных фармако- пейных статьях. Значения для предельной пирогенной дозы бактериального эндотоксина на килограмм мас- сы тела (К) приведены в таблице 2.1.6.13.-4. 2.3.
Информация относительно криоконсервантов Следует учитывать воздействие криоконсер- вантов, например диметилсульфоксида (ДМСО), и их остаточных количеств на размороженные клетки: ДМСО обладает токсичностью и может изменять свойства клеток, в частности, проница- емость клеточных мембран, даже после тщатель- ной отмывки размороженной клеточной взвеси. 2.4. Испытание на мешающие факторы В случаях, когда это практически осуще- ствимо, проводят испытание на мешающие фак- торы по крайней мере трех различных серий 22 испытуемого лекарственного средства. Испыту- емые лекарственные средства, у которых отме- чается значительная вариабельность реакций от серии к серии, должны подвергаться испытанию на мешающие факторы в рамках каждого инди- видуального испытания, то есть сопутствующей валидации. Испытание на мешающие факторы в боль- шинстве случае выполняют на сериях испыту- емого лекарственного средства, которые не со- держат эндотоксинов и других пирогенов, но, если это невозможно, на сериях с минимальным содержанием пирогенов. Если имеется только одна серия испытуемого лекарственного сред- ства, валидация должна выполняться на этой серии в трех независимых испытаниях. Должны выполняться параметры прецизионности для воспроизводимости, например ± 50 %. 2.5. Перекрестная валидация В общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Применение испытания на бактериальные эндотоксины указано, что испытание на ак- тивацию моноцитов следует проводить для лекарственных средств, где нельзя исключать присутствие неэндотоксиновых пирогенов. Ис- ходя из этого, рекомендуется проводить экспе- рименты перекрестной валидации испытаний на активацию моноцитов вместе с экспери- ментами испытаний на бактериальные эндо- токсины, используя те же три серии. В случае изменения критических параметров процесса перекрестная валидация должна быть повто- рена на трех сериях, поскольку потенциальное загрязнение неэндотоксиновыми пирогенами не может быть исключено. Испытание на присутствие пирогенов про- водимое на кроликах (2.1.6.2) должно выпол- нять только для перекрестной валидации, если ни один из методов испытания на активацию моноцитов (метод 1, метод 2 или метод 3) не может быть подтвержден для определенного лекарственного средства. 3. ЗАМЕНА ИСПЫТАНИЯ ПИРОГЕННОСТЬ НА ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ Испытание на активацию моноцитов пре- жде всего, предназначено для использования в качестве замены испытания пирогенность на кроликах. Частные фармакопейные статьи могут содержать требования проведения ис- пытания на бактериальные эндотоксины, пи- рогенность или испытание на активацию мо- ноцитов. Общие принципы: ‒ в любой частной фармакопейной статье, при наличии требований к содержанию пиро- генных веществ, указывается только одно испы- тание: испытание на бактериальные эндотокси- ны, пирогенность или испытание на активацию моноцитов. Перед включением испытания на активацию моноцитов в частную фармакопей- ную статью требуется подтверждение пригодно- сти одного из трех методов, указанных в общей фармакопейной статье 2.1.6.13. Испытание на активацию моноцитов, для оценки лекарствен- ного средства, являющего предметом данной частной фармакопейной статьи; ‒ необходимая информация предоставляется производителями. Производителям предлагается предоставить любые подтверждающие данные, относящиеся к применимости испытания на активацию мо- ноцитов для контроля активных фармацевтиче- ских субстанций и лекарственных препаратов. Такие данные включают подробное описание приготовления образцов и любых процедур по удалению мешающих факторов.
Дополни- тельно требуются любые доступные данные по параллельному испытанию продукта на Пиро- Таблица 2.1.6.13.-4. – Предельные пирогенные дозы бактериального эндотоксина Путь введения К внутривенный 5,0 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг внутривенный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 2,5 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг интратекальный 0,2 ME эндотоксина на килограмм массы тела, ME/кг парентеральный, для лекарственных препаратов вводимых в дозе, рассчитываемой на квадратный метр поверхности тела 100 МЕ эндотоксина на квадратный метр поверхности тела, ME/м2 23 генность, обосновывающие целесообразность замены испытания на пирогенность на испыта- ние на активацию моноцитов. 4. ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДИК Замена испытания Пирогенность или метода определения провоспалительных или пироген- ных веществ на другой метод должны рассма- триваться как использование альтернативный методики при замене фармакопейного метода согласно требованиям, представленным в разделе 1. Общие сведения Фармакопеи Союза. Для валидации методики испытания на активацию моноцитов, отличной от описан- ной в общей фармакопейной статье, предполага- ется соблюдение следующих требований: ‒ процедура, материалы и реактивы, исполь- зуемые в испытании, должны быть валидирова- ны в соответствии с рекомендациями для данно- го испытания; ‒ испытание на присутствие мешающих факторов (и, если необходимо, процедура по их устранению) выполняется на образцах не менее трех производственных серий. 201060014-2023 2.1.6.14. МИКОБАКТЕРИИ Общая фармакопейная статья распространя- ется на метод определения микобактерий. Если испытуемый образец может содержать микроорганизмы, отличные от микобактерий, его обрабатывают подходящим деконтаминиру- ющим раствором, например, раствором ацетил- цистеина и натрия гидроксида или раствором натрия лаурилсульфата. На каждую из двух подходящих твердых питательных сред (например, среда Левен- штейна-Йенсена или среда Миддлбрук 7Н10) инокулируют по 0,2 мл испытуемого образца. Испытание выполняют в трех повторностях. В подходящую жидкую питательную среду так- же в трех повторностях инокулируют по 0,5 мл испытуемого образца. Все среды инкубируют при температуре 37 °C в течение 56 сут. Определяют способность среды обеспечи- вать рост микобактерий в присутствии испыту- емого образца путем инокуляции подходящего штамма семейства Mycobacteriaceae, например, БЦЖ, и, при необходимости, используют подхо- дящий нейтрализующий агент. Если в течение первых восьми суток инку- бации наблюдают рост посторонних микроорга- низмов, испытание повторяют с одновременным проведением испытания на бактериологическую стерильность. Испытуемый образец выдерживает испы- тание, если в конце инкубационного периода ни в одной из пробирок не наблюдают рост микобактерий. 201060015-2023 2.1.6.15. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом и нековалентном свя- зывании антигенов антителами. Данные методы используют для обнаружения или количественно- го определения как антигенов, так и антител. Ком- плекс антиген-антитело можно идентифицировать и количественно определить различными метода- ми. Положения общей фармакопейной статьи от- носятся к иммунохимическим методам с исполь- зованием реактивов с меткой или без метки. Результаты, получаемые иммунохимически- ми методами, зависят от экспериментальных условий, характера и качества используемых ре- активов. Важно стандартизировать компоненты иммунохимического анализа и по возможности использовать для количественных определений международные стандартные образцы.
Для проведения иммунохимических исследований обычно используют коммерче- ски доступные наборы, включающие реактивы (в частности, антиген или антитело) и материалы, предназначенные для оценки in vitro конкретной субстанции, а также инструкции по их примене- нию. Наборы используют в соответствии с ин- струкциями производителя. Перед использова- нием необходимо убедиться, что селективность и чувствительность наборов являются подходящи- ми для анализа конкретной субстанции. Общая фармакопейная статья включает так- же следующее понятие: набор (реактивов) – комплект специаль- но подобранных реактивов, составных частей и инструкций по проведению анализа, предна- значенный для определения in vitro одного кон- 24 кретного вещества, возбудителя (или активно- сти фермента), нескольких конкретных веществ, возбудителей (или суммарной активности ферментов), а также для детекции участка гено- ма. Совокупность компонентов, которые упако- ваны вместе и предназначены для выполнения специфического исследования in vitro. Компо- ненты набора реактивов могут включать в себя реактивы (антитела, ферменты, буферные и пи- тательные растворы, разбавители), калибраторы, контрольные материалы и другие материалы. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА В методах с использованием меченых анти- генов или антител могут применяться различ- ные метки, например, ферментные, флуорес- центные, люминесцентные и радиоизотопные. При использовании в качестве метки ра- диоизотопа метод называют радиоиммунным. Рекомендации по измерению радиоактивно- сти, приведенные в общей фармакопейной статье 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекар- ственные препараты, подходят также и для иммунологических методов с использованием радиоизотопов. Все работы с радиоактивны- ми материалами должны выполняться в со- ответствии с законодательством государств – членов Союза и международными документами по защите от радиационной опасности. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА МЕТОДЫ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ Методы иммунопреципитации включают флокуляцию и преципитацию. При смешивании раствора антигена с соответствующим антите- лом в определенных условиях образуются фло- кулирующие или преципитирующие агрегаты. Соотношение концентраций реактивов, обеспе- чивающее наименьшее время флокуляции или наиболее выраженную преципитацию, называ- ют оптимальным соотношением. Такое соотно- шение обычно получают при смешивании анти- генов и антител в эквивалентных количествах. Иммунопреципитацию оценивают визуально или с помощью методов светорассеяния (нефе- лометрия или турбидиметрия). Для повышения чувствительности в качестве реактивов можно использовать частицы (например, из латекса), покрытые антигенами или антителами. В методах флокуляции обычно использу- ют пошаговое разведение одного из реактивов, а в методах иммунодиффузии разведение про- исходит в процессе диффузии в гель и таким образом достигают градиента концентраций одного или обоих реактантов. При этом в геле образуются зоны с соотношением реактантов, оптимальным для преципитации. Постановку реакции флокуляции выполняют в пробирках, тогда как в методах иммунодиффузии использу- ют различные носители: пробирки, планшеты, предметные стекла, ячейки или камеры. Системы иммунопреципитации могут быть простыми, комплексными и множественными. Простая система состоит из одного антигена в со- четании с соответствующим антителом; комплекс- ная – из родственных, но серологически неиден- тичных реактантов, множественная – из нескольких серологически неродственных реактантов.
В методах простой диффузии градиент кон- центрации устанавливают только для одного реактанта, диффундирующего из внешнего источника в гель, который содержит соответ- ствующий реактант в сравнительно низкой кон- центрации. Простая (одиночная, радиальная) иммуно- диффузия – количественный метод, при кото- ром антиген (антитело), диффундируя в гель, образует кольцо преципитации с соответствую- щим ему антителом (антигеном). При достиже- нии равновесия между антигеном и антителом, площадь образовавшегося кольца преципитации прямо пропорциональна содержанию антигена (антитело) и обратно пропорциональна содер- жанию антитела (антигена) в геле. В методах двойной диффузии градиенты концентрации устанавливают для обоих реак- тантов. И антиген, и антитело из различных участков диффундируют в первоначально имму- нологически нейтральный гель. Методы сравнительной двойной диффу- зии используют для качественного сравнения различных антигенов по отношению к подходя- щему антителу или наоборот. Сравнение осно- вано на наличии или отсутствии взаимодействия между компонентами преципитации. Реакции идентичности, неидентичности и частичной идентичности антигенов (антител) могут быть различными. 25 ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммуноэлектрофорез (ИЭ) – качественный метод, сочетающий гель-электрофорез с после- дующей иммунодиффузией. Перекрестный иммуноэлектрофорез явля- ется модификацией метода иммуноэлектрофо- реза и подходит как для количественного, так и качественного анализа. Первая часть метода представляет собой гель-электрофорез, после которого продольные полоски геля, содержащие разделенные фракции, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно к пре- дыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем сравнительно низкие кон- центрации антител, соответствующих антигену. Зависимость между площадью пиков преципи- тации и количеством соответствующего антиге- на является линейной для данной концентрации антитела и толщины геля. Электроиммунный анализ, часто назы- ваемый ракетным иммуноэлектрофорезом, является быстрым методом количественного определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот. Электрофорез определяемого антигена выполняют в геле, со- держащем относительно низкие концентра- ции соответствующих антител. Испытуемый образец и разведения стандартного антигена, используемые для калибровки, вносят в раз- ные лунки в геле. В процессе электрофоре- за образуются мигрирующие зоны преципи- тации в виде пиков, которые увеличиваются до тех пор, покасохраняется избыток соответ- ствующего антигена. Для данной концентрации антител зависимость между высотой пика пре- ципитации и количеством антигена является линейной. Встречный иммуноэлектрофорез – бы- стрый метод количественного определения, при котором градиент концентрации устанавлива- ется между вносимыми антителом и антигеном в зависимости от заряда под действием посто- янного электрического поля. Стандартные рас- творы для калибровки и разведения испытуемо- го образца вносят в лунки одного ряда в геле, а в лунки противоположного ряда вносят разве- дения соответствующего реактанта с известной концентрацией. Титром испытуемого образца считают наибольшее разведение, при котором образуется линия преципитации. Существует ряд модификаций методов пере- крестного иммуноэлектрофореза и электроим- мунного анализа. Другие методы сочетают разделение антигенов по размеру молекул и серологическим свойствам.
ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ ИММУНОПРЕЦИПИТАПИИ Выявление и характеристику линий иммуно- преципитации выполняют путем селективного или неселективного окрашивания с использова- нием флуоресцентных, ферментных или изотоп- ных меток или другими подходящими методами. Методы селективного окрашивания в преци- питатах обычно используют для определения характеристик веществ небелковой природы. При подходящей концентрации каждого из реактантов в полупрозрачных гелях, напри- мер, агаре или агарозе, линии преципитации четко различимы невооруженным глазом. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА КРИТЕРИИ ВАЛИДАЦИИ Методики считаются приемлемыми, если: – антитело и антиген не имеют существенных отличий в стандартном и испытуемом образцах. В случае меченых реактивов различия между мече- ным и немеченым компонентами соответствующе- го реактива незначительны; – на результат испытания не оказывает влияния матрица (любой компонент испытуемого образ- ца или вспомогательные вещества, которые могут быть различными в разных образцах); – результат количественного определения не выходит за пределы критериев приемлемости, указанных в частной фармакопейной статье; – прецизионность количественного опреде- ления достаточна для выполнения требований, указанных в частной фармакопейной статье; – порядок выполнения количественного опре- деления не увеличивает систематические ошибки. МЕТОДИКИ ВАЛИДАЦИИ Для подтверждения соответствия критериям приемлемости валидация должна включать: – проведение испытания в не менее трех повторностях; – проведение испытания не менее чем на трех различных разведениях стандартных образцов и трех разведениях испытуемых образ- 26 цов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца; – использование рандомизации; – приготовление стандартного образца ана- логичным образом, если испытуемый образец находится в сыворотке или в смеси с другими компонентами; – измерение неспецифического связывания меченого реактанта; – для заместительного иммунного анализа: – определение максимального связывания (нулевое замещение); – использование разведений, охватывающих весь диапазон откликов от значений, близких к неспецифическому связыванию, до значений максимального связывания как для стандартных образцов, так и испытуемого образца. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА Для анализа результатов испытаний могут быть использованы методы, представленные в общей фармакопейной статье 2.3.12.0. Стати- стическая обработка результатов биологиче- ских испытаний лекарственных средств. Существенное отклонение от параллелизма указывает на то, что между антителом и антиге- ном в испытуемом и стандартном образцах име- ются различия, и результаты испытания являют- ся незначимыми. Для заместительного иммунологического анализа не должно быть существенных разли- чий между значениями неспецифического свя- зывания и максимального замещения при высо- кой концентрации испытуемого и стандартного образцов. Различия могут указывать на наличие эффектов, обусловленных матрицей, ингибиро- ванием связывания или разложением метки. 201060016-2023 2.1.6.16. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ Принцип проточной цитометрии (цитофлу- ориметрии) заключается в многопараметриче- ском исследовании оптических свойств отдель- ных частиц в проточной жидкой системе. Клетки или частицы в суспензии индиви- дуально распределяются в линейном потоке, протекающем через измерительное устройство. Для проведения анализа плотные ткани необ- ходимо преобразовать в суспензию отдельных клеток.
С помощью проточной цитометрии опре- деляют широкий спектр параметров: объем и морфологическую структуру клеток, клеточ- ные пигменты, содержание ДНК и РНК, белки, поверхностные клеточные маркеры, внутрикле- точные маркеры, ферментативную активность, значение pH, состояние мембраны, текучесть и т.д. Проточная цитометрия позволяет определять для каждой отдельной клетки два морфологиче- ских параметра и один или более сигналов флуо- ресценции. Многопараметрический анализ позво- ляет определить фенотип клеточной популяции. ПРИБОР Фокусировка, усиление сигнала и выбор источника света должны быть оптимизированы для автоматического обнаружения и измерения морфологических различий и особенностей окрашивания. При выполнении метода проточ- ной цитометрии проводят: – выбор источника света в зависимости от параметров, которые будут проанализированы; – настройку цитометра в зависимости от типа анализируемых клеток (например, кле- точные культуры, лейкоциты, тромбоциты, бактерии, сперматозоиды, дрожжи) и целей ана- лиза (например, фенотипирование, определение клеточного цикла, апоптоза, цитокинов, мем- бранной текучести, флуоресцентного белка). Для проточной цитометрии характерно автоматизированное количественное опреде- ление ряда заданных параметров для боль- шого числа единичных клеток в течение каждого анализа. Например, 100 000 частиц или более (фактически неограниченное количество) анализируются одна за другой, как правило, приблизительно в течение 1 мин. Предел обна- ружения составляет 100 флуоресцентных моле- кул на клетку. Прибор для проточной цитометрии (про- точный цитометр, проточный цитофлуориметр) имеет пять основных блоков: – система подачи растворов и проточная ячейка; – источник света; – система обнаружения (детектирование сигнала) и система аналого-цифрового преобра- зования; 27 – система усиления (амплификации); – компьютер с программным обеспечением для анализа сигналов. СИСТЕМА ПОДАЧИ РАСТВОРОВ И ПРОТОЧНАЯ ЯЧЕЙКА С помощью системы подачи растворов клетки переносят в проточную ячейку, где они под воздей- ствием обжимающей жидкости распределяются в линию по одному за счет гидродинамического фо- кусирования (поток в потоке) и пересекают пучок световых лучей. Детектирование клеток в канале проточной ячейки, через который проходят клетки, происходит с помощью луча света, сфокусирован- ного в эллипсоидном пространстве двумя конфо- кальными линзами. Для подсчета поверхностных клеточных маркеров скорость потока во время анализа должна быть постоянной и обеспечивать подходящее расстояние между клетками. ИСТОЧНИКИ СВЕТА Наиболее часто используют следующие источники света: – лампы (ртутная, ксеноновая); – лазеры большой мощности, охлаждае- мые водой (аргоновый, криптоновый, лазер на красителях); – лазеры низкой мощности, охлаждае- мые воздухом (аргоновый (488 нм), красный гелий-неоновый (633 нм), зеленый гелий-неоно- вый, гелий-кадмиевый (ультрафиолетовый)); – полупроводниковые (диодные) лазеры (синий, зеленый, красный, фиолетовый). ДЕТЕКТИРОВАНИЕ СИГНАЛА Когда частица проходит через пучок света, она рассеивает часть света во всех направлени- ях. Флуоресцентные красители, добавленные к частице, испускают свой собственный свет (флуоресценцию), которая также излучается во всех направлениях. Таким образом, генериру- ются два типа сигнала: рассеяние света и эмис- сия флуоресценции. Световые датчики прибора фокусируют часть этого рассеянного света и флуоресценции и преобразуют в электрические импульсы про- порционально количеству собранного света.
Светорассеяние Измеряют 2 параметра: – прямое рассеяние; – боковое рассеяние, под углом 90° к направ- лению пучка света. Прямое светорассеяние коррелирует с объе- мом клетки, в то время как боковое светорассея- ние, связанное с такими параметрами, как форма ядра, количество и тип цитоплазматических гра- нул или шероховатость мембран, коррелирует с морфологическим строением клетки. С воз- растанием сложности клеточной структуры, интенсивность бокового светорассеяния также возрастает. Сигналы светорассеяния, являющиеся функ- цией морфологических характеристик клеток и определяющиеся как базовые параметры, при анализе с помощью проточной цитометрии будут генерироваться всегда. Флуоресценция При прохождении частиц через лазерный луч, они будут испускать определенный флу- оресцентный свет, в зависимости от типа и количества источников света. Излучение флу- оресцентных сигналов происходит благодаря флуоресцентным красителям, естественно на- ходящимся в клетках (например, коферменты, хлорофилл, пигменты морской водоросли), и (или) флуоресцентным зондам, использован- ным для маркировки клеток для определения специфичных характеристик (например, флу- оресцирующие антитела, красители нукле- иновых кислот, pH-метки и кальций-зависи- мые метки, флуоресцирующие белки). Каждая флуоресцентная метка характеризуется инди- видуальным спектром возбуждения и спек- тром эмиссии, ее выбирают в зависимости от природы источника возбуждения, системы обнаружения и специфической цели анализа. Оптические фильтры должны соответствовать используемым флуорофором. УПРАВЛЕНИЕ СИГНАЛОМ И АНАЛОГО-ЦИФРОВОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ Сигналы светорассеяния и флуоресценции, испускаемые клетками при прохождении через лазерный луч, разделяются и направляются к детекторам с помощью оптических фильтров. Детекторы являются трансдукторами (фотоэлек- тронными умножителями), которые преобразуют световое излучение, генерируемое клетками, в импульсы напряжения. Процесс подсчета каждого импульса в соответствующем канале является аналого-циф- ровым преобразованием. Процесс отображается графически в виде частотной гистограммы. 28 Усиление (амплификация) Для оптимальной визуализации импульсы напряжения должны быть усилены. Процесс усиления подчеркивает различия между сиг- налами клетки и, следовательно, увеличивает разрешение между популяциями клеток с раз- личными характеристиками (например, отличие жизнеспособных от нежизнеспособных клеток, или неспецифической флуоресценции от анти- ген-специфической флуоресценции после окра- ски мечеными моноклональными антителами). Есть два метода усиления сигнала: линейный и логарифмический. Выбор между двумя типами делают для каждого отдельного сигнала в соот- ветствии с морфологическими характеристиками клеток и используемыми красителями (например, флуоресцентно-меченые моноклональные анти- тела, красители нуклеиновой кислоты). Линейное усиление увеличивает различия среди интенсивных импульсов, то есть исполь- зуется с теми параметрами, которые производят сигналы высокой интенсивности, например: – параметры светорассеяния клетки; – флуоресценция красителей нуклеиновых кислот при изучении клеточного цикла. Логарифмическое усиление, напротив, предна- значено для слабых импульсов и параметров или аналитических условий, которые могут произве- сти как слабый, так и сильный импульс, например: – антигены клетки; – светорассеяние от тромбоцитов, бактерий, дрожжей; – флуоресценция от красителей нуклеино- вых кислот при исследовании апоптоза. Компенсация сигналов флуоресценции У каждого флуоресцирующего красителя есть определенный спектр поглощения и спектр эмиссии.
При использовании для окрашивания клеток двух или более флуоресцентных меток одновременно (например, иммунное феноти- пирование по четырем антигенам), спектры эмиссии флуорофоров могут перекрываться. Как следствие, каждый детектор флуоресцен- ции зарегистрирует как определенную флуорес- центную метку, так и какое-то количество света, излучаемого другими флуоресцентными метка- ми. Это может привести к завышению сигнала и плохому разделению популяций клеток. Использование электронной матрицы позво- ляет селективно разделять перекрестные сигна- лы после их улавливания детектором (компенса- ция флуоресценции). Для компенсации флуоресценции требует- ся использование калибраторов флуоресценции, при этом предпочтительно использование положи- тельных образцов клеток, меченных необходимыми флуорофорами, присоединенными тем же спосо- бом, что и к антителам, используемым для анализа. ОТОБРАЖЕНИЕ СИГНАЛОВ После усиления и компенсации сигналы ото- бражаются в виде двух- или трехмерных гисто- грамм. Гистограммы показывают зависимость интенсивности сигнала от количества событий для данного параметра. Гистограммы, в которых каждая точка представляет клетку, основаны на комбинации двух сигналов (двухмерные то- чечные диаграммы с двумя параметрами). Тип и число распределений и комбинаций сигналов выбирают в зависимости от образцов клеток и использованных меток. При анализе получен- ных данных программное обеспечение для про- точной цитометрии может также генерировать и другие виды графических изображений (та- кие как накладывания, поверхностные гисто- граммы, томограммы (срезовые гистограммы), контурные гистограммы, гистограммы плотно- сти или интенсивности, накладывающиеся ги- стограммы). Также могут быть использованы статистические данные, такие как средние ин- тенсивности флуоресценции (и их изменения по времени или в зависимости от функции клетки). АНАЛИЗ ДАННЫХ Клеточная суспензия для испытания может содержать различные виды объектов, некото- рые из которых нежелательны (такие как не- жизнеспособные клетки, фрагменты клеток или макроагрегаты) или просто не являются целью анализа (например, гранулоциты при изучении лимфоцитов). Это зависит от типа образца (цель- ная кровь, костный мозг, клеточные культуры, биологические жидкости, клеточные суспензии из плотных тканей) и процедуры обработки (на- пример, методы окрашивания, лизиса (эритро- цитов), фиксации, криоконсервирования, размо- раживания, депарафинирования). Как следствие, не все сигналы, генерируемые во время анализа, принадлежат изучаемым клет- кам. Для исключения нежелательных и несоот- ветствующих сигналов применяют два подхода. Первый подход, который применяют в про- цессе накопления данных, представляет собой установление шумового порога для одного (или 29 более) существенного параметра (параметров). Данный подход регулирует включение в анализ только клеток, интенсивность сигнала которых выше, чем предопределенное дискриминиру- ющее (пороговое) значение для данного пара- метра. Параметр прямого светорассеяния чаще всего используют в качестве дискриминатора (фактора разделения) из-за его высокоинтенсив- ного сигнала с низким уровнем интерференции. Второй подход, который применяют при ана- лизе данных, заключается в процедуре гейтиро- вания, ограничивая анализ только сигналами от тех популяций клеток, которые удовлетворяют определенным морфологическим и экспресси- онным (по флуоресценции) профилям. Обыч- но используют 2 типа гейтирования. Первый тип основан на морфологии клеток.
Клеточные популяции идентифицируют по их морфологи- ческим характеристикам (определяемым с по- мощью прямого светорассеяния и бокового све- торассеяния). Область гейтирования определяет границы представляющей интерес популяции (например, лимфоциты, жизнеспособные клет- ки), после чего графики флуоресценции отобра- жаются только для выбранной области. Второй тип селекции сигнала основан на флуоресцен- ции. Интересующую клеточную популяцию идентифицируют на основании интенсивности экспрессии антигена или красителя, затем опре- деляют область гейтирования. Затем в рамках выбранной области строят графики флуоресцен- ции. Соответствующее программное обеспече- ние позволяет создавать множественные обла- сти гейтирования, используя последовательный логический порядок. Это особенно информатив- но при изучении редких популяций клеток или при сортировке клеток. КОНТРОЛИ Внутренний контроль Перед испытанием должна быть проведена настройка оптической системы с использовани- ем подходящих флуоросфер, а также проверена стабильность проточной системы. По получен- ным данным формируют отчет и используют при проведении периодического контроля. Для доказательства того, что используемые в испы- тании антитела функциональны и позволяют надлежащим образом использовать проточный цитометр, применяют положительный контроль, в который должны быть включены образцы, из- вестные как положительные для интересующего маркера. Внешний контроль Рекомендуется участвовать в межлаборатор- ных испытаниях для подтверждения надежно- сти полученных данных или проверки межлабо- раторной воспроизводимости. 201060017-2023 2.1.6.17. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на следующих подходах: – амплификация целевого фрагмента нукле- иновой кислоты с использованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР) или изотермической ам- плификации рибонуклеиновой кислоты (РНК); – амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, метода разветвлен- ной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); в этом случае амплификация сигнала достига- ется без повторяющихся циклов амплификации нуклеиновой кислоты. В общей фармакопейной статье описаны тре- бования к методам амплификации нуклеиновых кислот на примере типичного метода ПЦР для последующего детектирования амплифициро- ванных фрагментов ДНК подходящим методом. Фрагменты РНК после обратной транскрипции в комплементарную ДНК и последующей ам- плификации полученного фрагмента ДНК могут быть детектированы подходящим методом. Альтернативные методы амплификации ну- клеиновых кислот могут применяться при усло- вии, что они соответствуют требованиям к каче- ству испытаний, приведенным в данной общей фармакопейной статье. Общая фармакопейная статья устанавливает требования к подготовке образца, амплифика- ции in vitro фрагментов ДНК и детектированию специфического продукта ПЦР. ПРИНЦИП МЕТОДА Типичная ПЦР представляет собой трехста- дийную циклическую процедуру, позволяющую проводить in vitro амплификацию определен- 30 ных фрагментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции в комплементарную ДНК).
Основные стадии амплификации ДНК включают: – денатурацию двуцепочечной нуклеиновой кислоты (матричной ДНК, фрагментов ДНК), когда двуцепочечная ДНК под действием высокой темпе- ратуры переходит в одноцепочечное состояние; – специфический отжиг праймеров (синтети- ческих олигонуклеотидов противоположной на- правленности, фланкирующих целевой участок ДНК) с комплементарным участком молекулы ДНК в подходящих реакционных условиях; – элонгацию нуклеотидной цепи, компле- ментарной матричной, путем достраивания второй цепи ДНК с 3ʹ-конца праймера под воз- действием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез фрагментов ДНК). В дальнейшем повторяющиеся стадии дена- турации, специфического отжига и элонгации ведут к получению и накоплению амплифици- руемого фрагмента, ограниченного праймерами с двух концов. Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть детектирован различны- ми методами соответствующей специфичности и чувствительности. Мультиплексная ПЦР проводится с исполь- зованием нескольких пар праймеров, сконстру- ированных для одновременной амплификации различных целевых фрагментов ДНК в одной реакции. ИСПЫТУЕМЫЙ ОБРАЗЕЦ В связи с высокой чувствительностью ПЦР испытуемые образцы должны быть оптималь- ным образом защищены от внешней контами- нации нуклеиновыми кислотами и ампликона- ми. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого образца производят в условиях, минимизирующих разрушение матричной ДНК. В случае проведения испытания по определе- нию матричной РНК необходимо принять осо- бые меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воз- действию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реактивы, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказы- вать влияние на ход определения. МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ КОНТАМИНАЦИИ В связи с риском контаминации следует строго разграничивать рабочие зоны в зависи- мости от используемых материалов и приме- няемой технологии, учитывать передвижение персонала, использование средств индивидуаль- ной защиты, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации. При проведении испытания следует разде- лять такие зоны как: – зона первичной подготовки (зона, в кото- рой работы осуществляют только с материалами, не содержащими нуклеиновых кислот, способ- ных быть матрицей, например, с праймерами, буферными растворами и др.); – зона для пробоподготовки (зона, в которой осу- ществляют работу с реактивами, образцами и др.); – зона ПЦР-амплификации (зона, в которой амплифицируемый материал обрабатывается в закрытой системе); – зона детектирования (единственная зона, в которой операции с амплифицируемым мате- риалом производятся в открытой системе). В случае использования закрытой системы строгое разделение зон не обязательно. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Для подготовки образцов к постановке ПЦР используют различные физико-химические про- цедуры экстракции и (или) обогащения. Под- лежащая амплификации целевая ДНК должна быть экстрагирована или высвобождена из ис- пытуемого материала таким образом, чтобы амплификация в выбранных реакционных усло- виях была осуществима. Используемая методика должна быть эффективной и воспроизводимой. Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влияние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует использовать образцы для внутреннего контроля, описанные в разделе Контрольные образцы для проверки правильности хода испытания данной общей фармакопейной статьи.
В случае РНК-матриц следует уделять вни- мание предотвращению проявления рибонукле- азной активности. 31 АМПЛИФИКАЦИЯ Амплификацию целевого фрагмента нукле- иновой кислоты методом ПЦР проводят при оптимальных для каждого цикла заданных усло- виях (температурный профиль для денатурации двуцепочечной ДНК, отжига и элонгации, время инкубации при выбранных температурах, ско- рость элонгации). Эти условия зависят от раз- личных параметров, например: – длины и состава праймера и целевого фрагмента; – типа ДНК-полимеразы, состава буферной смеси и реакционного объема, используемых при амплификации; – типа используемого устройства для ампли- фикации и показателей теплопроводности меж- ду прибором, реакционной емкостью и реакци- онной смесью. ДЕТЕКТИРОВАНИЕ Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, можно идентифицировать по размеру, по- следовательности нуклеотидов, химической модификации или комбинации этих параме- тров. Для обнаружения и определения размера фрагмента могут быть использованы методы гель-электрофореза (с использованием агароз- ного или полиакриламидного гелей или ка- пиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (например, жидкостной хрома- тографии). Для обнаружения и определения ха- рактеристик последовательности нуклеотидов могут быть использованы специфическая гибри- дизация зондов, содержащих комплементарную мишени последовательность нуклеотидов, или расщепление амплифицированного материала, отражающее наличие мишень-специфических сайтов ферментативной рестрикции. Для обна- ружения и определения характеристик химиче- ской модификации может быть использовано, например, введение в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуоресценции, возни- кающей в результате возбуждения. Детектирование ампликонов может быть до- стигнуто с помощью зондов, помеченных для по- следующего хемилюминесцентного, радиоизотоп- ного или иммуноферментного детектирования. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Результат испытания является достовер- ным лишь при условии получения однозначно положительных результатов для образцов поло- жительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для образцов отри- цательного контроля (контролей). В связи с ис- ключительно высокой чувствительностью мето- да ПЦР и риском контаминации положительные результаты должны подтверждаться двукратным полным повторением процедуры испытания по возможности с новой аликвотой образца. Образец считается положительным, если хотя бы одно из двух повторных испытаний дает положительный результат. При определении нуклеиновой кислоты, для которой установлен измеримый предел количе- ственного определения, необходимо использо- вать методики для количественного определения. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР Программа валидации должна включать квали- фикацию оборудования. Следует учитывать поло- жения, изложенные в общей фармакопейной статье 2.3.14.0. Валидация аналитических методик. Для валидации ПЦР-испытания применяют подходящие стандартные образцы предприятия, калиброванные относительно международных стандартных образцов целевой последователь- ности нуклеотидов, если применимо. Определение наименьшего положительного значения При валидации испытания должно быть установлено наименьшее положительное зна- чение, определяемое как минимальное количе- ство целевых матричных нуклеиновых кислот в объеме образца, которые могут быть обнару- жены в 95 % испытаний.
Наименьшее положи- тельное значение зависит от таких взаимосвя- занных факторов, как объем экстрагированного образца и эффективность методологии экстрак- ции, транскрипция целевой РНК в комплемен- тарную ДНК, процесс амплификации и детек- тирования. 32 При определении предела обнаружения системы следует учитывать наименьшие положи- тельные значения для каждой целевой матричной нуклеиновой кислоты и результаты проведения испытания выше и ниже этих значений. Системы для количественного определения При валидации проводится оценка методики количественного определения по следующим ха- рактеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, предел количественного опреде- ления, линейность, диапазон применения и устой- чивость (робастность) аналитической методики. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕАКТИВОВ Все реактивы, имеющие критическое значе- ние для используемой методики, должны прохо- дить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность должна основываться на заранее установленных критериях качества. Праймеры являются важнейшими компонен- тами испытаний методом ПЦР, поэтому следует уделять особое внимание их строению, чисто- те и пригодности для испытаний. Праймеры могут быть модифицированы (например, конъ- югированием с флуорофором или антигеном) для возможности детектирования ампликона специфическими методами при условии, что такие модификации не приведут к ингибирова- нию правильного и эффективного протекания процесса амплификации целевого фрагмента. КОНТРОЛЬНЫЕ ОБРАЗЦЫ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ПРАВИЛЬНОСТИ ХОДА ИСПЫТАНИЯ Образцы для внешнего контроля При постановке ПЦР для минимизации риска контаминации и обеспечения соответству- ющей чувствительности при каждом испытании используют следующие внешние контрольные образцы: – образец положительного контроля: обра- зец содержит определенное количество копий целевого фрагмента, близкое к пороговому наи- меньшему положительному значению, уста- новленное индивидуально для каждой системы и выраженное кратно по отношению к наимень- шему положительному значению данной систе- мы; – образец отрицательного контроля: образец, аналогичный основной матрице, для которой до- казано отсутствие целевой последовательности нуклеотидов. Используется для выявления лож- ноположительного сигнала. Образцы для внутреннего контроля При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, образцы для внутренне- го контроля представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содер- жащие сайты связывания с праймерами (прайме- ры для таких последовательностей добавляются в реакционную смесь дополнительно). Образцы для внутреннего контроля должны амплифицироваться так же эффективно, как и ис- пытуемая последовательность нуклеотидов, но ампликоны должны иметь четко определяемые от- личия. Тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом образце. Образцы для внутреннего контроля предпоч- тительно добавлять к испытуемому образцу до выделения нуклеиновой кислоты; чтобы можно было их использовать для общего контроля про- цесса (экстракция, обратная транскрипция, ам- плификация, детектирование). Образец для контроля предела количественного определения Для контроля предела количественного определения готовят образец, содержащий кон- центрацию определяемого компонента в испы- туемом образце, максимально близкую, но не превышающую пороговую линию.
Образец для контроля предела количественного определения содержит компонент, калиброванный предпоч- тительно в международных единицах, и исполь- зуется параллельно при каждом количественном определении. ВНЕШНЯЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА Участие во внешних программах оценки ка- чества представляет собой важную процедуру обеспечения качества испытания методом ПЦР для каждой лаборатории и каждого аналитика. 33 Следующие разделы приводятся для информации. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Большинство аналитических методик, ос- нованных на амплификации нуклеиновых кис- лот, представляют собой испытания на наличие нуклеиновых кислот. Существует также ряд методик количествен- ного определения. Для определения контами- нации пулов плазмы РНК вирусом гепатита C (hepatitis C virus, HCV) адекватными являются испытания, которые могут быть рекомендованы для контроля предельного содержания примесей. В данном разделе описаны способы ва- лидации только для аналитических методик качественного анализа амплификации нукле- иновых кислот, предназначенных для оцен- ки контаминации пулов плазмы РНК HCV. Для этой цели двумя наиболее важными ха- рактеристиками для валидации аналитической методики являются специфичность и предел обнаружения. Кроме того, должна быть оцене- на устойчивость (робастность) аналитической методики. Однако данный раздел также может быть ис- пользован в качестве основы для валидации всей процедуры амплификации нуклеиновых кислот. В соответствии с данным разделом за анали- тическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекти- рования амплифицированного продукта. При использовании в аналитической ме- тодике или ее части коммерческого набо- ра, валидацию пользователя можно заменить документированным подтверждением валида- ции вышеуказанных положений, проведенной производителем набора. Тем не менее, пользо- вателем должна быть подтверждена эффектив- ность набора в отношении его предполагаемого использования (то есть предел обнаружения, устойчивость, перекрестная контаминация). СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность представляет собой способ- ность к однозначной оценке наличия нуклеино- вой кислоты в смеси с компонентами, присут- ствие которых можно ожидать. Специфичность аналитических методик, ос- нованных на амплификации нуклеиновых кис- лот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа конечного продукта) и обоснован- ности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и для стадии детек- тирования). При разработке праймеров и зондов долж- на быть исследована их специфичность в от- ношении детектирования только РНК HCV путем сравнения выбранной последовательности нуклеотидов с последовательностями нуклеоти- дов, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5ʹ-некодирующего участка генома HCV, которые консервативны для всех генотипов. Амплифицированный продукт должен одно- значно идентифицироваться одним из методов, например, проведением амплификации с вло- женными праймерами (гнездовая ПЦР), испыта- нием с использованием ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со специ- фическим зондом. Для валидации специфичности аналитиче- ской методики испытание должно быть прове- дено в отношении не менее 100 образцов РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть доказано отсутствие реакции. Способность аналитической методики к обнаружению всех генотипов HCV также зави- сит от выбора праймеров, зондов и параметров методики.
Эта способность должна быть под- тверждена с использованием охарактеризован- ных панелей сравнения. Однако ввиду сложно- сти получения некоторых генотипов (например, генотипа 6) должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе – генотипы 1 и 3). ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТОДИКИ За предел обнаружения данной аналитиче- ской методики принимают наименьшее количе- ство нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детектировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитическая методика амплификации нуклеиновых кислот, используемая для детек- тирования РНК HCV в пулах плазмы, как пра- вило, дает неколичественные результаты (либо положительный, либо отрицательный). Реко- 34 мендуется определение предела обнаружения, но в практических целях для аналитической ме- тодики на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено наименьшее положительное значение. Наименьшее положи- тельное значение (в соответствии с определени- ем, приведенным в данной общей фармакопей- ной статье) представляет собой минимальное количество целевых матричных нуклеиновых кислот в испытуемом объеме образца, кото- рые могут быть определены в 95 % испытаний. Минимальное положительное значение зави- сит от распределения вирусных геномов в ин- дивидуальных испытуемых образцах и такого фактора, как эффективность фермента, что мо- жет привести к получению различных наимень- ших положительных значений для отдельных испытаний. Для определения наименьшего положитель- ного значения ряд разведений стандартного образца предприятия или СО ФЕАЭС вируса гепатита С, калиброванного по международно- му стандартному образцу HCV Всемирной ор- ганизации здравоохранения, должен быть под- вергнут испытанию в разные дни для проверки вариабельности результатов анализа. Для про- ведения статистического анализа результатов должно быть испытано не менее трех незави- симых рядов разведений в достаточном количе- стве повторностей для получения 24 результатов испытания для каждого разведения. Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждо- го из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведений в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разве- дений не было слишком большим, следует про- вести предварительное испытание (например, с использованием логарифмических разведе- ний образца пула плазмы) с получением пред- варительного наименьшего положительного значения (то есть наибольшего разведения, дающего положительный результат). После этого диапазон разведений может быть выбран в области полученного предварительного зна- чения (с использованием, например, логариф- мического фактора разведения 0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концентрацию РНК HCV, которая может быть детектирована в 95 % испытаний, рассчитывают с использованием соответствую- щих методов статистической оценки. Эти результаты также могут служить для оценки изменчивости результатов, получа- емых данной аналитической методикой в ходе испытания и в разные дни. УСТОЙЧИВОСТЬ (РОБАСТНОСТЬ) Устойчивость (робастность) аналитической методики – мера ее способности выдерживать воздействие незначительных изменений параме- тров, являющаяся показателем надежности ме- тодики при обычном использовании. Оценка надежности аналитической методи- ки должна проводиться на этапе ее разработки. Устойчивость должна показать надежность ана- литической методики с учетом определенных вариаций параметров.
Для методов амплифика- ции нуклеиновых кислот небольшие изменения параметров методики могут иметь решающее значение. Однако в ходе разработки устойчи- вость методики может быть подтверждена не- большим изменением концентраций реактивов (например, магния хлорида, праймеров или нуклеотидов). Для подтверждения устойчиво- сти не менее 20 РНК HCV-отрицательных пу- лов плазмы, отобранных случайным образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в 3 раза превышающей заранее определенное наименьшее положитель- ное значение, должны быть испытаны и призна- ны положительными. Проблемы с устойчивостью могут возник- нуть также в связи с методиками, в которых стадия ультрацентрифугирования предшеству- ет экстракции вирусной РНК. Поэтому для ис- пытания устойчивости таких методик не менее 20 пулов плазмы, содержащих различные уров- ни РНК HCV, но не содержащих специфических антител к HCV, должны быть испытаны и при- знаны положительными. Предотвращение перекрестной контами- нации должно быть подтверждено путем точ- ного детектирования панели не менее чем из 20 образцов, попеременно заполненной образца- ми отрицательных пулов плазмы и отрицатель- ных пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного наименьшего положительного значения или не менее 104 МЕ/мл). 35 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ Для таких биологических методов, как ам- плификация нуклеиновых кислот, существу- ет вероятность возникновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валида- цию, так и на интерпретацию результатов. Ме- тодики испытаний должны быть четко описаны в виде стандартных операционных процедур, в которых следует указывать: – способ отбора проб (тип упаковки и др.); – приготовление мини-пулов (если при- менимо); – условия хранения до испытания; – четкое описание условий испытания, вклю- чая меры предосторожности против перекрестной контаминации и деградации вирусной РНК, ис- пользуемых реактивов и стандартных образцов; – четкое описание используемого обору- дования; – детальные формулы расчета результатов, включая статистическую обработку. В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы качества и надежности аналитической методики, когда бы она ни ис- пользовалась, может быть рекомендован под- ходящий образец для контроля хода испытания (например, подходящее разведение СО ФЕАЭС вируса гепатита С или образец плазмы, инфи- цированной HCV, калиброванный по междуна- родному стандартному образцу HCV Всемирной организации здравоохранения). Квалификация оборудования. Соответ- ствующая программа квалификации монтажа и функционирования должна быть реализована для каждой критически важной части использу- емого оборудования. После замены критически важного оборудования (например, терморегуля- торов) должна быть документально подтвержде- на функциональность аналитической процеду- ры путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных образцов пула плаз- мы, инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, соответствующей ра- нее определенному наименьшему положитель- ному значению. Все результаты должны быть положительными. Квалификация аналитика. В отношении каждого аналитика, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствую- щая квалификационная программа.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ДНК ВИРУСА B19 В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Согласно требованиям Фармакопеи Союза пулы плазмы, используемые при производстве определенных продуктов, должны быть прове- рены на содержание ДНК вируса B19 (B19V) в концентрации не выше допустимой. Для этого предпочтительно использовать методики ам- плификации c количественным определением нуклеиновых кислот. Наиболее важными ха- рактеристиками для валидации таких методик являются: правильность, прецизионность, спец- ифичность, предел количественного определе- ния, линейность и диапазон применения. Кроме того, должна быть оценена устойчивость (ро- бастность) аналитической методики. В разделе описаны способы валидации ме- тодик амплификации нуклеиновых кислот для определения контаминации пулов плазмы ДНК B19V. Однако данный раздел также может быть использован в качестве основы для валидации в целом процедуры амплификации нуклеиновых кислот. В соответствии с данным разделом за анали- тическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекти- рования амплифицированного продукта. В случае использования в аналитической методике или ее части коммерческого набора ва- лидацию можно заменить документированным подтверждением валидации вышеуказанных характеристик от производителя набора. При этом пользователем должна быть подтверждена эффективность набора в отношении его предпо- лагаемого использования (то есть правильность, прецизионность, диапазон применения, устой- чивость). ПРАВИЛЬНОСТЬ Правильность представляет собой близость совпадения между найденным значением и зна- чением, которое определено как условно пра- вильное, либо принято как значение сравнения. Правильность количественного определения за- висит от калибровочного графика и отклонений на различных стадиях количественного опреде- 36 ления. Хотя рекомендовано определять правиль- ность во всем специфицированном диапазоне, наиболее важно подтвердить правильность в диапазоне около предельного значения концен- трации (количество). В случае количественного определения ДНК B19V в пулах плазмы рекомен- дуется оценивать правильность методики путем количественного определения не менее 5 концен- траций (с логарифмическим коэффициентом раз- ведения 0,5) СО ФЕАЭС вирусной ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот или иного стандартного образца, калиброванного в международных единицах по международному стандартному образцу ДНК B19V Всемирной ор- ганизации здравоохранения в диапазоне рекомен- дованного на данный момент порогового значе- ния 10,0 МЕ/мкл ДНК B19V (то есть 105 МЕ/мл, 104,5 МЕ/мл, 104 МЕ/мл, 103,5 МЕ/мл и 103 МЕ/мл) не менее чем в трех повторностях для каждого разведения. Правильность должна быть доку- ментирована для различных концентраций в про- центах, определенных в сравнении с известным количеством ДНК B19V. Следует сопоставить технологический уровень соответствующего ме- тода количественного определения, например, с помощью совместных испытаний. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ Прецизионность представляет собой бли- зость совпадения между сериями измерений, по- лученных в многочисленных испытаниях различ- ных проб одного и того же гомогенного образца.
Прецизионность определяется на трех уровнях: – повторяемость: выражает точность при одних и тех же условиях испытания в течение короткого промежутка времени, оценивает- ся с использованием одной методики количе- ственного определения, с помощью которой трижды испытывают подходящие разведения положительных образцов с ДНК B19V, кали- брованных в международных единицах и охва- тывающих весь диапазон применения методики количественного определения; коэффициент вариации рассчитывают для индивидуальных образцов; – промежуточная (внутрилабораторная) пре- цизионность: выражает внутрилабораторную вариабельность, устанавливается оценкой по- вторных испытаний (как рутинный количествен- ный анализ) подходящих разведений положи- тельных образцов с ДНК B19V, калиброванных в международных единицах и охватывающих весь диапазон применения методики количе- ственного определения, в различной обстановке (то есть различные дни, различные аналитики, различное оборудование, различные реактивы); коэффициент вариации рассчитывают для инди- видуальных образцов; – воспроизводимость: выражает точность между различными лабораториями (межлабо- раторная прецизионность), оценивается путем участия в совместных количественных испыта- ниях на содержание ДНК B19V. СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность представляет собой спо- собность к однозначной оценке наличия ну- клеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать. Спец- ифичность аналитических методик, основан- ных на амплификации нуклеиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для испытания конечного продукта) и обо- снованности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и стадии детектирования). При разработке праймеров и зондов долж- на быть исследована их специфичность в от- ношении детектирования только ДНК B19V путем сравнения избранной последовательно- сти нуклеотидов с последовательностями ну- клеотидов, опубликованными в банках данных. Не должно обнаруживаться значительное сход- ство с последовательностями нуклеотидов, не относящимися к B19V. Амплифицированный продукт должен одно- значно идентифицироваться одним из методов, на- пример, проведением амплификации с вложенными праймерами (гнездовая ПЦР), анализом с использо- ванием ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со специфическим зондом. Для проверки специфичности аналитиче- ской методики испытание должно быть прове- дено в отношении не менее 20 ДНК B19V-отри- цательных пулов плазмы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Генотипы парвовируса B19. Междуна- родный комитет по таксономии вирусов клас- сифицирует представителей трех генотипов как штаммы человеческого парвовируса B19. Генотип 1 представляет прототип B19V, генотип 2 – вирусные последовательности нуклеотидов типа А6 и генотип 3 – V9-подобные последова- тельности нуклеотидов. При проведении вырав- 37 нивания с использованием соответствующей по- следовательности нуклеотидов генотипа B19V, доступной из баз данных последовательностей нуклеиновых кислот, праймеры и зонды долж- ны быть выбраны с таким расчетом, чтобы была возможность обнаружения и количественного определения в равной степени различных гено- типов парвовируса B19. Для проверки выбран- ного подхода следует использовать стандарт- ные образцы. Так как получение биологических препаратов сравнения может быть затруднено, соответствующие препараты плазмид или син- тетических нуклеиновых кислот также могут служить в качестве источника охарактеризован- ных целевых фрагментов. Однако они не могут быть использованы для валидации процедуры экстракции.
ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Предел количественного определения пред- ставляет собой минимальное количество ну- клеиновой кислоты в образце, которое может быть определено с требуемой правильностью и прецизионностью. Предел количественного определения методики, основанной на ампли- фикации нуклеиновых кислот B19V, оценивают при изучении правильности и межлабораторной прецизионности путем ограничения разведений. Определяют наименьшую концентрацию целе- вой матричной нуклеиновой кислоты, которая может быть определена количественно с доста- точной правильностью и прецизионностью. ЛИНЕЙНОСТЬ Линейность методики количественного определения – валидационная характеристи- ка возможности получения результатов, прямо пропорциональных концентрации нуклеиновой кислоты. Линейность методики, основанной на амплификации нуклеиновых кислот B19V, оценивают по характеристикам повторяемости и промежуточной (внутрилабораторной) пре- цизионности путем испытания в нескольких повторностях разведенных образцов с кон- центрациями, охватывающими весь диапазон применения методики. Определяют интервал, расположенный между верхней и нижней кон- центрациями целевой матричной нуклеиновой кислоты, при которых получаемые результаты прямо пропорциональны ее содержанию. ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ Диапазон применения – интервал, располо- женный между наибольшей и наименьшей кон- центрациями (количеством) нуклеиновой кисло- ты в образце, для которого было показано, что методика имеет приемлемый уровень правиль- ности, линейности и прецизионности. Диапазон применения методики амплификации нуклеино- вых кислот B19V оценивают по характеристикам повторяемости и промежуточной (внутрилабо- раторной) прецизионности путем испытаний в нескольких повторностях разведенных образ- цов. Определяют интервал, расположенный меж- ду наибольшей и наименьшей концентрациями целевой матричной нуклеиновой кислоты, кото- рый может быть выражен с приемлемой степе- нью правильности и прецизионности. УСТОЙЧИВОСТЬ (РОБАСТНОСТЬ) Устойчивость (робастность) аналитической методики – мера способности методики выдер- живать воздействие незначительных изменений параметров, являющаяся показателем надежно- сти этой методики при обычном использовании. Оценка надежности аналитической методики должна проводиться на этапе ее разработки. Устойчивость должна показать надежность ана- литической методики с учетом определенных вариаций параметров. Для методов амплифика- ции нуклеиновых кислот небольшие изменения параметров методики могут иметь решающее значение. Однако в ходе разработки методи- ки ее устойчивость может быть подтверждена небольшим изменением концентраций реакти- вов, например, магния хлорида, праймеров или нуклеотидов. Для подтверждения устойчиво- сти аналитической методики не менее 20 ДНК B19V-отрицательных пулов плазмы, инфициро- ванных ДНК B19V до получения конечной кон- центрации около наименьшего значения, долж- ны быть испытаны с получением приемлемых количественных значений. Предотвращение перекрестной контами- нации должно быть подтверждено путем точ- ного детектирования панели не менее чем из 20 образцов, попеременно заполненной образцами пулов плазмы без ДНК B19V или с концентрацией ниже порогового значения (10 образцов) и пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями ДНК B19V (не менее 100-кратного наименьшего значения, 10 образцов). 38 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ Для таких биологических методов, как амплификация нуклеиновых кислот, имеет- ся вероятность возникновения специфических проблем, которые могут повлиять как на вали- дацию, так и на интерпретацию результатов.
Методики испытаний должны быть четко описа- ны в виде стандартных операционных процедур, в которых следует указывать: – способ отбора проб (тип упаковки и др.); – приготовление мини-пулов производите- лем (если применимо); – условия хранения до испытания; – четкое описание условий испытания, включая меры предосторожности против пере- крестной контаминации и деградации вирусных нуклеиновых кислот, используемых реактивов и стандартных образцов; – четкое описание используемого оборудования; – детальные формулы расчета результатов, включая статистическую обработку. Для проверки соответствия системы каче- ства и надежности аналитической методики может быть использован подходящий образец для контроля хода испытания (например, плазма, инфицированная образцом ДНК вируса B19V, калиброванным в международных единицах в сравнении с СО ФЕАЭС вирусной ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот). Квалификация оборудования. Соответ- ствующая программа квалификации монтажа и функционирования должна быть реализова- на для каждой критически важной части ис- пользуемого оборудования. После замены кри- тически важного оборудования (например, терморегуляторов) должна быть документально подтверждена функциональность путем проведе- ния параллельного испытания с использованием 8 образцов пула плазмы, инфицированного ДНК B19V с получением конечной концентрации око- ло наименьшего значения. Все результаты долж- ны быть приемлемыми и отражать возможности методики количественного определения, как было установлено при валидации. Квалификация аналитика. В отношении каждого аналитика, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствую- щая квалификационная программа. 201060018-2023 2.1.6.18. МЕТОД ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ВАКЦИН Метод нефелометрии описан в общей фар- макопейной статье 2.1.2.1. Прозрачность и степень опалесценции жидкостей. Мето- дом иммунонефелометрии измеряют мутность, обусловленную формированием иммунного комплекса при реакции «антиген-антитело». Данный метод применяют как для определе- ния количества антител, так и для определения количества антигенов. В общей фармакопейной статье описано количественное определение антигенов как компонентов вакцин. ОБОРУДОВАНИЕ Для испытаний используют нефелометр, описанный в общей фармакопейной статье 2.1.2.1. Прозрачность и степень опалесценции жидкостей. Допускается проведение измерения под ненулевым углом, отличным от 90°. МЕТОДЫ Измерение светорассеяния в процессе реак- ции может быть проведено в три этапа. Сначала определяют базовый уровень све- торассеяния реакционной средой. После до- бавления первого реактива (антигена) про- исходит увеличение сигнала с последующим плато. Когда добавляют второй реактив (ан- титело), происходит второе усиление сиг- нала со вторым плато, за которым следует окончательное увеличение интенсивности сигнала, продолжающегося до тех пор, пока не будет достигнуто третье плато. Зону изме- рения фиксируют с момента добавления второ- го реактива до достижения наиболее высокой интенсивности светорассеяния (третье плато) в зависимости от концентрации определяемого компонента. Для количественной оценки иммунных комплексов, образующихся при реакции «анти- ген-антитело», используют следующие методы. 39 ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИЯ В КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ Методом иммунонефелометрии в конечной точке измеряют светорассеяние после форми- рования иммунного комплекса, примерно через 60 мин. Измеренное значение в конечной точке в этом случае прямо пропорционально содержа- нию определяемого компонента в присутствии избытка антител.
Проводят контрольный опыт, чтобы учесть значение неспецифического свето- рассеяния, обусловленного реакционной средой и реакционной измерительной кюветой. КИНЕТИЧЕСКАЯ ИММУНОНЕФЕЛОМЕТРИЯ Метод кинетической иммунонефелометрии основан на определении скорости образования иммунных комплексов (скорость увеличения светорассеяния), которая пропорциональна кон- центрации определяемого компонента. Существует 2 типа кинетической иммуноне- фелометрии. Иммунонефелометрия с фиксированным временем Первое измерение светорассеяния прово- дят через несколько секунд после добавления последнего реактива. Второе измерение про- водят через фиксированный интервал вре- мени, установленный при разработке ме- тодики. Разница между двумя значениями пропорциональна количеству определяемого компонента. Кинетическая иммунонефелометрия с использованием пика первой производной Формирование иммунного комплекса опи- сывает кривая, построенная по первой произ- водной изменения светорассеяния во времени (dΘD/dt). Появление двух последовательных пи- ков обусловлено добавлением первого, а затем второго реактива. Высота третьего пика кривой, построенной по первой производной, пропорциональна ко- личеству определяемого компонента в реакци- онной среде. Последовательные измерения про- водят через несколько секунд после добавления второго реактива. В этом случае свет, рассеянный реакцион- ной средой, компонентом и реактивом, не влияет на исходное значение полученного сигнала. РЕАКТИВЫ И СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ Реактивы, в том числе разбавители, и стандарт- ные образцы должны быть прозрачными и не со- держать взвешенных частиц. При необходимости их предварительно фильтруют или центрифугируют. Антисыворотки или антитела выбирают на основе их специфичности, способности к осаждению и их авидности по отношению к антигену, высокое значение которой обеспе- чивает быстрое появление четких сигналов, что улучшает качество результатов. Устанавливают подходящий диапазон кон- центраций антигена (рабочий диапазон), опре- деляемого в присутствии избытка антител, в котором отсутствует зональный эффект. Рекомендуется убедиться, что профили отклика испытуемого образца и соответствую- щего стандартного образца аналогичны. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ИСПЫТУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ При необходимости проводят соответствую- щую предварительную обработку испытуемого образца для удаления адъюванта или другого мешающего вещества. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Необходимо убедиться, что все реактивы име- ют подходящую температуру для оптимального протекания реакции. Образцы разводят подходя- щей средой в реакционной измерительной кюве- те, затем добавляют фиксированное количество антител. Выполняют несколько измерений каж- дого разведения испытуемого образца. В некоторых случаях ход реакции можно улучшить путем введения в реакционную среду дополнительных веществ (например, полиэти- ленгликоля). Стандартные и испытуемые образцы обраба- тывают одинаковым образом. ПРОВЕДЕНИЕ КОНТРОЛЬНОГО ОПЫТА Для обеспечения специфичности испытания, измеряют только светорассеяние, обусловленное 40 иммунными комплексами. Если другие частицы, матрица образца, реактивы или реакционная из- мерительная кювета могут мешать испытанию, то в таких случаях и в случае использования метода иммунонефелометрии в конечной точке проводят контрольный опыт для исключения не- специфического светорассеяния. КАЛИБРОВКА По разведениям стандартного образца строят калибровочную кривую, подбирая концентрации таким образом, чтобы охватить рабочий диапазон. МЕТОДЫ РАСЧЕТА Для расчетов используют метод параллель- ных прямых или метод калибровочной кривой (2.3.12.0).
КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ КАЛИБРОВОЧНЫЕ КРИВЫЕ Калибровочные кривые должны соответство- вать установленным критериям приемлемости. Для установления критериев приемлемости могут быть использованы следующие параметры: – минимальное светорассеяние, выраженное в единицах светорассеяния (light scattering units; LSU), для точки калибровочной кривой с самой низкой концентрацией; – коэффициент вариации LSU, измеренный для каждой точки кривой; – коэффициенты регрессии или корреляции калибровочной кривой; – наклон калибровочной кривой и отрезок, отсекаемый калибровочной кривой на оси координат. РЕЗУЛЬТАТЫ Примеры критериев приемлемости, которые следует оценивать: – коэффициент вариации или диапазон зна- чений результатов измерений испытуемого об- разца; – результаты испытания стандартного образ- ца с учетом тенденций или контрольной карты. 201060019-2023 2.1.6.19. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТАТОЧНОЙ ДНК КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА Общая фармакопейная статья описывает ана- литические методы, которые могут быть исполь- зованы для определения содержания и оценки размера остаточной ДНК клетки-хозяина в био- технологических лекарственных средствах, про- изведенных с применением клеток-продуцентов, что не исключает возможности использования альтернативных подходов при согласовании с уполномоченным органом. ВВЕДЕНИЕ Для определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина применяют различные чувствитель- ные аналитические методы, в том числе метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР-РВ) (метод 1) и ме- тод иммуноферментного анализа (метод 2). Метод кПЦР-РВ может также быть исполь- зован при оценке распределения по размеру остаточной ДНК клетки-хозяина, как одной из характеристик, зависящей от природы кле- точного субстрата (например, перевиваемые клеточные линии) и от количества остаточной ДНК клетки-хозяина. Подходящий метод выбирают в зависимо- сти от природы испытуемого образца и с учетом особенностей и ограничений каждого метода, указанных в таблице 2.1.6.19.-1. ПРОБОПОДГОТОВКА Концентрация остаточной ДНК клетки-хо- зяина существенно зависит от вида биотехноло- гического лекарственного средства, от техноло- гии при его создании и степени очистки от ДНК в производственном процессе. В зависимости от матрицы, для достижения надлежащей открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина может понадобиться предвари- тельная обработка образца. Для анализа белков высокой степени очист- ки, таких как рекомбинантные белки или моно- клональные антитела, необходимая величина 41 открываемости остаточной ДНК клетки-хозя- ина может быть достигнута с использованием обычного протеолитического расщепления или аффинной хроматографии. Для более сложной матрицы (например, вирусной вакцины или ви- русного вектора) для высвобождения остаточ- ной ДНК из вирусных частиц может потребо- ваться дополнительная стадия лизиса вируса. Метод иммуноферментного анализа осо- бенно чувствителен к интерферирующему воз- действию белков, избежать которого можно, используя расщепление протеиназой K и натрия додецилсульфатом в качестве первоначальной стадии предварительной обработки образца. Этого может быть достаточно для достижения необходимой открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина. В некоторых случаях остаточ- ная ДНК клетки-хозяина может быть связана с компонентами испытуемого образца, в кото- ром также могут присутствовать растворимые мешающие вещества, в этом случае может пона- добиться выделение остаточной ДНК клетки-хо- зяина из испытуемого образца.
Для выделения ДНК используют процеду- ры, при которых получена удовлетворительная величина открываемости в экспериментах с до- бавками. Существует несколько подходящих ме- тодов выделения, включая преципитацию ДНК или ДНК-специфическое связывание с матрицей (например, магнитными шариками или колонка- ми с диоксидом кремния). Для выделения оста- точной ДНК клетки-хозяина можно использовать коммерчески доступные наборы. В некоторых наборах для разрушения связи между остаточ- ной ДНК клетки-хозяина и компонентами ис- пытуемого образца используют хаотропные агенты (натрия йодид и др.) и детергент (натрия лаурилсаркозинат). Остаточную ДНК клетки-хо- зяина извлекают из испытуемого образца путем соосаждения с молекулой-носителем, та- кой как гликоген, в присутствии этанола или 2-пропанола. В зависимости от воспроизводи- мости результатов по проверке открываемо- сти добавки может потребоваться несколько Таблица 2.1.6.19.-1. – Сравнение методов кПЦР-РВ (метод 1) и иммуноферментного анализа (метод 2) Характеристики Метод 1 Метод 2 использование для оценки распределения по размеру ДНК да нет предел количественного определения (зависит от матрицы, используемого метода и мешающих веществ) (пг/мл) 0,01 – 10 2 – 10 специфичность (определение общего содержания ДНК или содержания конкретной ДНК) определение содержания конкретной ДНК определение общего содержания ДНК мешающие вещества белки детергенты, белки, растворители, РНК ограничения фрагменты, меньшие чем ПЦР-продукт, не могут быть обнаружены и определены количественно не применимо для лекарственных средств, на основе ДНК. Для фрагментов, содержащих менее 1000 пар оснований определяемое содержание ДНК занижается. Детектирование зависит от размера ДНК. Короткие последовательности ДНК (менее 80 нуклеотидов) не определяются, но могут мешать количественному определению из-за связывания реактива. Лекарственное средство не должно содержать бактериальной ДНК. Узкий рабочий диапазон: 5 – 150 пг/лунка. 42 независимых процедур выделения. В каждую процедуру выделения должны быть включены от- рицательные контроли. В некоторых случаях реко- мендуется разведение полученных образцов (извле- ченные пробы) для уменьшения эффекта матрицы. Также может быть применен поправочный коэф- фициент, учитывающий открываемость добавки. МЕТОД 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ кПЦР-РВ Метод может быть использован для опреде- ления целевой последовательности клеточной ДНК, выделенной из различных испытуемых об- разцов. Для определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина можно использовать метод кПЦР-РВ, направленный либо на стабильную последова- тельность нуклеотидов в высококонсервативной области генома клетки-хозяина, либо на повто- ряющиеся элементы для повышения чувстви- тельности испытания. При определении повто- ряющихся элементов потенциальный фоновый «шум» ДНК из окружающей среды может быть трудно устраним (например, при использова- нии Alu последовательностей генома человека). Специфичность методики с использованием метода кПЦР-РВ должна быть установлена в ходе валидационных исследований путем под- тверждения отсутствия перекрестной активно- сти с неродственными нуклеотидными последо- вательностями. В качестве альтернативы допустимо исполь- зование цифровые методы ПЦР. АМПЛИФИКАЦИЯ Обнаружение и определение остаточной ДНК клетки-хозяина методом кПЦР-РВ может включать использование ДНК зондов, специ- фичных к последовательности нуклеотидов, или неспецифического флуоресцентного краси- теля, интеркалирующего с любой двуцепочеч- ной ДНК. Принципы метода кПЦР-РВ описаны в общей фармакопейной статье 2.1.6.17.
Мето- ды амплификации нуклеиновых кислот. Количество циклов, необходимых для пре- вышения порогового значения (Ct или Cp) при флуоресцентном измерении, зависит от исход- ного количества остаточной ДНК клетки-хозяи- на в образце. Если выполняется несколько выделений, извлеченные пробы, при необходимости, после подходящего разведения, должны иметь сопо- ставимую концентрацию ДНК клетки-хозяина. Используют образцы для отрицательного контроля ПЦР. Стандартную кривую содержания геном- ной ДНК строят с использованием серий раз- ведений стандартного раствора геномной ДНК клетки-хозяина, чтобы можно было опреде- лить остаточные уровни ДНК клетки-хозя- ина в биотехнологических лекарственных средствах на основе их значений Ct или Cp. Для приготовления стандартного раствора ре- комендуется использовать тщательно охарак- теризованную репрезентативную геномную ДНК, выделенную из клеток, используемых для производства биотехнологического лекар- ственного средства. Аналогичный подход применяют для оцен- ки распределения по размеру остаточной ДНК клетки-хозяина. Для амплификации перекрыва- ющихся фрагментов разного размера в целевой последовательности нуклеотидов могут быть использованы как минимум два набора праймеров. КРИТЕРИИ ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ Контрольные образцы для проверки правильности хода испытания Для контроля надлежащей чувствительно- сти и контроля риска контаминации в каждом испытании используют следующие образцы: – образец отрицательного контроля для метода кПЦР-РВ и образец отрицательного контроля для выделения, состоящие из подходя- щих матриц с доказанным отсутствием целевой последовательности нуклеотидов; – образец положительного контроля для метода кПЦР-РВ содержит определенное количество копий целевой последовательности или определенную концентрацию ДНК, которая определяется индивидуально для каждой систе- мы анализа; – образец для внутреннего контроля (используется для контроля выделения), пред- ставляющий собой испытуемый образец, в ко- торый добавляют в определенной концентрации или количестве копии целевой последователь- ности. В этом случае ампликоны должны иметь четко определяемые различия и возможность быть обнаруженными в отдельном испытании методом кПЦР-РВ. В качестве альтернативы до- пустимо использование образца для внешнего контроля, состоящего из испытуемого образца 43 с хорошо охарактеризованным уровнем геном- ной ДНК. Открываемость методики должна находить- ся в пределах заданных значений, основанных на характеристиках методики, установленных во время валидации. Стандартная кривая содержания геномной ДНК Стандартная кривая содержания геномной ДНК в выбранном диапазоне должна быть ли- нейной. Коэффициент детерминации R2 стан- дартной кривой содержания геномной ДНК должен быть больше или равен 0,98. Эффектив- ность ПЦР на основе значений Ct или Cp должна находиться в заранее установленных пределах. Коэффициент вариации для различных из- влечений или повторов не должен превышать предварительно установленного значения. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Если выполняется несколько выделений, то каждая извлеченная проба анализируется индивидуально. Остаточное содержание ДНК клетки-хозяина рассчитывают по стандартной кривой содержания геномной ДНК путем усред- нения значений, полученных для различных извлечений или повторов. При необходимости, данный результат может быть скорректирован с учетом открываемости при выделении.
Для оценки распределения перекрывающих- ся фрагментов разных размеров остаточной ДНК клетки-хозяина рассчитывают соотношение количества копий для каждого размера амплико- на к количеству копий ампликона наименьшего размера. МЕТОД 2. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Метод иммуноферментного анализа пред- ставляет собой неспецифический метод количе- ственного определения остаточной ДНК клет- ки-хозяина (независимо от ее происхождения), позволяющий обнаруживать одноцепочечную ДНК. Данный метод позволяет определить общее со- держание ДНК, и, следовательно, важно не только избегать загрязнения ДНК от окружающей среды, но и все используемые материалы и реактивы не должны содержать ДНК. Испытуемые образцы не должны быть контаминированы микроорга- низмами, и все образцы, в том числе стандартные образцы, должны быть обработаны в контролиру- емых условиях до этапа денатурации. ПРИНЦИП Определение общей ДНК состоит из четы- рех этапов: – денатурация и образование комплексов: при нагревании образца ДНК денатурируется в одноцепочечную ДНК; денатурированную ДНК смешивают с реактивом, который содер- жит белок, конъюгированный со стрептави- дином (связывающим одноцепочечную ДНК), и моноклональное антитело к ДНК, конъю- гированное с уреазой. ДНК-связывающий белок и моноклональное антитело специфичны для одноцепочечной ДНК, но не специфичны для двуцепочечной. Наличие стрептавидина в жидкой фазе способствует образованию ком- плекса с одноцепочечной ДНК из образца; – фильтрация: комплекс фильтруют через биотинилированную нитроцеллюлозную мем- брану. Биотин в мембране захватывает комплек- сы, связываясь со стрептавидином. Мембрану промывают для удаления любых несвязанных реактивов. Для исключения неспецифическо- го связывания используют нитроцеллюлозную мембрану, покрытую альбумином; – детектирование: мембрану помещают в планшетный спектрофотометр, содержащий раствор мочевины, реагирующий с уреазой в комплексе ДНК с образованием аммиака. Соот- ветствующее изменение рН, которое измеряют потенциометрическим датчиком (в микровольт в секунду), прямо пропорционально количеству ДНК в образце; – анализ: исходные данные для образца и стандартной кривой обрабатывают с использо- ванием соответствующего программного обе- спечения для определения остаточного содержа- ния ДНК клетки-хозяина в образце. Все образцы и отрицательные контроли испы- тывают с добавками и без добавок. Раствор добав- ки (1000 пг/мл) готовят путем разбавления кон- центрированного стандартного раствора (ДНК тимуса теленка) с концентрацией 5000 пг/мл. КРИТЕРИИ ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ Контрольные образцы – количество ДНК в положительном контроле должно находиться в пределах диапа- зона, указанного производителем; – открываемость добавки в отрицательном 44 контроле должна составлять от 80 % до 120 %. Образцы – при анализе нескольких повторов коэффи- циент вариации для разных повторов не должен превышать установленного значения; – открываемость добавки должна состав- лять от 80 % до 120 %. ВЫЧИСЛЕНИЯ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Содержание остаточной ДНК клетки-хозяи- на рассчитывают в пикограммах на миллилитр по формуле: ID · (C – A) V где: ID — коэффициент разведения; C — исходное (необработанное) среднее значение (в пикограммах на про- бирку) для пробирок, содержащих образец; A — исходное (необработанное) среднее значение (в пикограммах на пробир- ку) для пробирок, содержащих отри- цательный контроль; V — объем в пробирке, в миллилитрах (обычно 0,5 мл на пробирку).
При необходимости полученный результат может быть скорректирован с учетом откры- ваемости при выделении (например, средней открываемости для конкретного продукта). 201060020-2023 2.1.6.20. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА В общей фармакопейной статье представлены рекомендации по разработке и валидации мето- дик определения остаточных белков клетки-хозя- ина, применяемых для испытаний лекарственных средств, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК, что не исключает возможно- сти использования альтернативных методов, при- знанных приемлемыми уполномоченным органом. ВВЕДЕНИЕ Белки клетки-хозяина представляют собой производственные примеси, источником кото- рых является организм, из которого получены клетки, используемые в производстве лекар- ственного средства с использованием техноло- гии рекомбинантной ДНК. Предполагают, что снижение содержания белков клетки-хозяина до минимально возможного уровня уменьшит побочные эффекты лекарственного препарата (например, иммуногенность). Необходимо оценить эффективность удале- ния белков клетки-хозяина в процессе очист- ки. Содержание белков клетки-хозяина должно быть количественно определено с помощью методики, разработанной и валидированной для конкретного лекарственного средства. Предел содержания остаточных белков клет- ки-хозяина, выраженный, как правило, в нано- граммах на миллиграмм действующего (актив- ного) вещества (ppm), должен быть обоснован с учетом эффективности процесса очистки в отно- шении белков клетки-хозяина и их потенциально- го влияния на организм пациента, исходя из введе- ния максимального количества остаточных белков клетки-хозяина с дозой лекарственного препарата. При определении допустимых пределов со- держания необходимо учитывать, что невозмож- но установить общий предел содержания остаточ- ных белков клетки-хозяина для всех конкретных лекарственных препаратов, в связи с тем, что качественные и количественные характеристики остаточных белков клетки-хозяина изменяются от одного продукта к другому и даже от одной процедуры производства (очистки) к другой. Определение остаточных белков клетки-хозя- ина, как правило, проводят методами иммунофер- ментного анализа (ИФА), используя в качестве реактивов специально приготовленный антиген (антигены) белка клетки-хозяина или стандарт- ный образец белков клетки-хозяина и соответ- ствующие поликлональные антитела. Антисы- воротка должна содержать антитела к широкому спектру белков клетки-хозяина, характерных для конкретного лекарственного средства. Для определения остаточных белков клет- ки-хозяина чаще всего используют метод «сэндвич» ИФА. Следует учитывать, что со- держание остаточных белков клетки-хозяина, определяемое с помощью ИФА, не отражает абсолютное массовое содержание примес- ных белков. Чувствительность реакции об- условлена результатом, наблюдаемым при совокупной ответной реакции на множество отдельных белков клетки-хозяина, в сравнении 45 с ответной реакцией на стандартный образец белка клетки-хозяина. При разработке и вы- боре метода определения остаточных белков клетки-хозяина для получения характеристик различных белков клетки-хозяина, содержа- щихся в лекарственном средстве, рекоменду- ется использовать ортогональные аналитиче- ские методы (например, электрофорез, ВЭЖХ, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия). ВЫБОР МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Существуют различные типы методов количественного определения остаточных бел- ков клетки-хозяина.
Метод выбирают с уче- том различных факторов, включая стадию раз- работки лекарственного препарата, природу клетки-хозяина и иммуногенность белков, тип экспрессии, производственный процесс и пред- шествующий опыт. При выборе и разработке методики количе- ственного определения остаточных белков клет- ки-хозяина необходимо учитывать жизненный цикл испытания (обеспеченность реактивами, постоянство их качества, валидацию методики количественного определения, внесение изме- нений в производственный процесс). ТИПЫ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Процесс-специфичные методы количественного определения Методику количественного определения оста- точных белков клетки-хозяина, специфичных для процесса (процесс-специфичных или про- дукт-специфичных остаточных белков клетки-хо- зяина), разрабатывают и валидируют с учетом особенностей производственного процесса и с ис- пользованием той же экспрессирующей системы, что и при получении рекомбинантного продукта. Антигены белков клетки-хозяина получают путем имитации процесса производства актив- ной фармацевтической субстанции (или анало- гичного ему процесса) до стадии, способной вырабатывать широкий спектр белков клет- ки-хозяина в достаточном количестве. Полученные антисыворотки должны охваты- вать широкий диапазон белков клетки-хозяина, чтобы определять как можно больше различных белков клетки-хозяина и учитывать вариабель- ность производственного процесса. Платформенные методы количественного определения Платформенные методы количественного определения остаточных белков клетки-хозяина разрабатывают производители для конкретных биотехнологических процессов, используемых в производстве. Одни и те же наборы реактивов применяют для определения остаточных белков клетки-хозя- ина в нескольких лекарственных средствах, полу- ченных от одного типа экспрессирующей систе- мы (например, линия клеток яичников китайского хомячка (CHO)), при условии, что процессы на- работки биологического материала с целевым продуктом (и последующие за ним выделение и очистка целевого продукта, если применимо) до- статочно схожи для этих лекарственных средств. Возможность применения антисыворотки долж- на быть оценена, как описано для процесс-спец- ифичных методов количественного определения. Общие методы количественного определения Коммерчески доступные наборы реактивов для определения остаточных белков клетки-хо- зяина предназначены для работы с широким спектром белков от аналогичных типов экспрес- сирующих систем. Подробная информация по производству реактивов может быть не доступ- на. Например, антигены могут быть выделены из смеси штаммов клетки-хозяина, и использу- емый процесс (процессы) может не совпадать с процессом, применяемым для конкретного лекарственного средства. Возможность приме- нения антисыворотки должна быть оценена, как описано для процесс-специфичного метода ко- личественного определения. КРИТЕРИИ ВЫБОРА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Ввиду потенциальных вопросов безопас- ности, ассоциированных с остаточным количе- ством белков клетки-хозяина в активных фар- мацевтических субстанциях, для выбора между общим, платформенным или процесс-специ- фичным методами количественного опре- деления проводят оценку риска, принимая во внимание стадию разработки лекарственно- го средства. На начальном этапе разработки могут быть использованы общий или платформенный мето- ды количественного определения.
46 На поздних этапах разработки следует использовать процесс-специфичные методы ко- личественных определений как более точные, особенно в сравнении с общими методами коли- чественного определения, так как процесс-спец- ифичные методы с большей вероятностью обна- ружат иммунореактивность против характерных белков клетки-хозяина. Методы платформен- ного или общего количественного определения могут быть использованы при условии, что ме- тодика количественного определения соответ- ствующим образом валидирована и ее пригод- ность оценена относительно специфичных для процесса остаточных белков клетки-хозяина. ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ Для иммунологического количественного определения остаточных белков клетки-хозяина реактивы (антигены и антисыворотки) получают способами, которые при необходимости могут быть повторно воспроизведены. Антигены используют для получения по- ликлональных антител с помощью иммуниза- ции одного или нескольких подходящих видов животных. Кроме того, антигены белков клет- ки-хозяина применяют в качестве стандартного образца при количественном определении оста- точных белков клетки-хозяина. Антигены должны охватывать как можно более широкую совокупность видов белков клетки-хозяина, которые могут быть получены в производственном процессе целевого белка и по возможности включать в себя всю сово- купность видов белков, получаемых в условиях наихудшего случая процесса очистки, а также обеспечивать робастность против потенциаль- ных изменений производственного процесса в течение жизненного цикла лекарственного препарата. ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ Разработка процесс-специфичного метода ко- личественного определения остаточных белков клетки-хозяина включает выбор нулевой клеточ- ной линии, не содержащей ген экспрессии целе- вого продукта и полученной из клеточной линии, использованной при создании производствен- ной клеточной линии, продуцирующей целевой белок. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно трансфицирован- ной. Ложно трансфицированную линию клеток получают с помощью трансфекции родительской линии клеток плазмидой, используемой при соз- дании производственной клеточной линии, но без гена, кодирующего целевой белок. ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА Процессы наработки продукта, содержащего целевой белок Антигены для процесс-специфичного метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина получают, имитируя планируе- мый производственный процесс с использовани- ем нулевой клеточной линии и, где это возможно, в одних и тех же условиях производства. Любая имитация производственного про- цесса является приближением к предполага- емому производственному процессу, поэтому они могут иметь отличия, например, различный масштаб, рабочие параметры, взаимодействие продуктов. Такие отличия необходимо тщатель- но оценить, так как они могут повлиять на сово- купность видов белков клетки-хозяина. Например, при имитации стадии фермента- ции процесса производства телец включения, получение желаемых телец включения может быть не достигнуто. В связи с этим, в зависи- мости от используемой нулевой клеточной ли- нии (например, ложно трансфицированной или не трансфицированной), антигены получают иначе, чем в предполагаемом производственном процессе.
В отдельных случаях для некоторых параме- тров производственного процесса при имитации производства может потребоваться корректи- ровка с учетом наихудшего случая (например, для получения антигенов, охватывающих широ- кий спектр различных видов белков клетки-хо- зяина). Например, супернатант клеточной куль- туры, содержащий антиген, может быть собран уже после достижения минимального уровня жизнеспособности клеток, чтобы включить больше цитозольных белков, которые высвобо- ждаются при дополнительном лизисе клеток. 47 Процессы выделения и очистки целевого белка Полученные антигены подвергают щадя- щему воздействию (фильтрации, концентриро- ванию) с целью получения репрезентативного спектра белков клетки-хозяина. Дальнейшую очистку обычно не рекомендуется, так как су- ществует риск потери видового разнообразия остаточных белков. В случаях, когда не достиг- нута репрезентативность антигенов (например, в результате узкого охвата), можно рассмотреть возможность смешивания имитационных мате- риалов с различных этапов обработки. Возмож- но увеличение разнообразия антигенов путем объединения материалов, полученных в резуль- тате имитации ферментации и (или) очистки с использованием различных производствен- ных условий, или селективных этапов очистки (например, для уменьшения общего количества некоторых иммунодоминантных остаточных белков клетки-хозяина). Перекрестная контаминация целевым белком Существенным фактором риска при получе- нии антигенов, используемых в качестве реак- тивов, является контаминация целевым белком с последующей перекрестной реакцией с поли- клональными антителами, что необходимо учи- тывать при организации производственного и лабораторного процессов. По этой причине при получении антигенов максимально используют специальное или одноразовое оборудование. Когда это невозможно, оборудование должно быть очищено соответствующим образом. Определение характеристик и испытания Перед использованием антигенов для имму- низации, в них определяют общее содержание белка и подтверждают отсутствие целевого белка. Сравнение совокупности белков клетки-хо- зяина, полученных в результате имитирован- ного и предполагаемого производственных процессов, выполняют, как правило, при помо- щи электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и (или) двумерного электрофореза с высокочувствительным красите- лем. Сравнение должно показать, что антигены, полученные при имитации процесса, содержат большинство видов белков клетки-хозяина пред- полагаемого производственного процесса. При необходимости дополнительная информация мо- жет быть получена с помощью ортогональных методов (например, масс-спектрометрии). ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ Разработка платформенного метода количе- ственного определения остаточных белков клет- ки-хозяина включает выбор нулевой клеточной линии, не содержащей ген экспрессии целевого продукта, и использование одного и того же вида клетки-хозяина. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно транс- фицированной и может быть использована для производства антигенов для продуктов данной производственной площадки производителя. ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА Наработка биоматериала, содержащего целевой белок Антигены для испытаний с использованием платформенного метода получают с помощью имитации производственного процесса, ис- пользуемого для нескольких продуктов, обычно с использованием одних и тех же компонентов среды.
При любой имитации производства ис- пользуемый процесс должен быть максимально приближен к предполагаемому производствен- ному процессу, так как это может повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина (см. раздел Процесс-специфичные методы количественного определения остаточных бел- ков данной общей фармакопейной статьи). Процесс выделения и очистки целевого белка Как и для других методов количественного определения, антигены белков клетки-хозяина, полученные на технологической стадии нара- ботки биоматериала, как правило, обрабаты- вают лишь в минимальной степени (например, без стадий очистки или с ограниченным количе- ством стадий) для получения широкого спектра белков клетки-хозяина, в то же время стратегии смешивания и объединения также могут исполь- зоваться для расширения спектра видов белков клетки-хозяина. Определение характеристик и испытания Определяют общее содержание белка и под- тверждают отсутствие целевого белка. Сравни- вают белки клетки-хозяина, полученные при имитации процесса и в предполагаемом произ- водственном процессе. 48 ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Общий метод количественного определения разрабатывает производитель коммерческого набора реактивов. Подробная информация по производству реактивов может быть не раскры- та. Например, клеточная культура может быть получена из смеси штаммов экспрессирующих клеток одного типа (вида), а используемый процесс (процессы) может не совпадать с про- цессом, применяемым для конкретного лекар- ственного средства. Общий метод количествен- ного определения должен быть выбран с учетом предполагаемого конкретного производственно- го процесса (например, подходящая линия клет- ки-хозяина) и надлежащим образом валидиро- ван для целевого продукта и этапа разработки. Если общий метод количественного опреде- ления применяют на более поздних этапах разра- ботки или во время промышленного производства, целесообразно валидировать методику количе- ственного определения и контролировать постоян- ство состава реактивов от серии к серии используя либо соответствующие предшествующие фрак- ции из производственного процесса, либо образец продукта, полученный при имитации процесса с использованием нулевой клеточной линии. ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТЕЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ И ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕНННОГО ОПРЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Иммунизация Для получения поликлональных антител им- мунизируют один или несколько подходящих видов животных. Основной задачей иммуниза- ции является получение высокоспецифичных поликлональных антител, чувствительных к каждому из антигенных белков в смеси белков клетки-хозяина, используемой в качестве им- муногена. Иммунный ответ животного должен индуцироваться как высокоиммунными, так и низкоиммунными антигенами. Выбирают вид животного, позволяющее по- лучать достаточное количество и разнообразие специфического к белкам клетки-хозяина имму- ноглобулина G. Если поликлональные антитела для образо- вания иммунного комплекса антиген – антитело (первичные антитела) и для детекции результатов реакции (вторичные антитела) получены из одного и того же источника, можно предположить, что при проведении количественного определения они рас- познают разные эпитопы на одном и том же белке клетки-хозяина. Альтернативно можно использо- вать поликлональные антитела к белкам клетки-хо- зяина от разных видов животных.
Использование нескольких животных для каждого из данных ви- дов позволяет уменьшить влияние индивидуальной изменчивости иммунной системы и обеспечить дополнительное разнообразие ответов, что будет способствовать максимальному охвату антителами против антигенов белков клетки-хозяина. В случае ограниченного количества антиге- нов, использование адъювантов сокращает вре- мя формирования иммунного ответа. В случае сложного состава смеси антигенов может потре- боваться дифференциальное усиление иммун- ного ответа к низкоиммуногенным антигенам или к антигенам в более низких концентрациях. Для достижения максимального иммунного ответа может потребоваться несколько циклов иммунизации, и, в зависимости от частоты имму- низации, процесс может занять от 3 до 6 месяцев. Иммунный ответ на белки клетки-хозяина для конкретной схемы иммунизации контроли- руют путем определения титра антител с исполь- зованием, например, ИФА, и путем сравнения ре- зультатов одно- или двумерного электрофореза после окрашивания белков и вестерн-блоттинга, где в качестве первичных антител используют поликлональные антитела к белкам клетки-хозя- ина. На практике некоторые белки, вызывающие сильный иммунный ответ, могут быть не видны в геле при окрашивании, а некоторые белки со слабыми антигенными свойствами, обнаружи- ваемые при окрашивании белков, могут не вы- зывать детектируемый иммунный ответ. В муль- типлексных иммунологических испытаниях для достижения линейности при разведении образ- ца важно, чтобы реактив, содержащий антитела, одновременно и специфически распознавал как можно больше отдельных молекул в образце, и присутствовал в стехиометрическом избытке. Для этой цели серии разведений испытуемых образцов, полученных на разных стадиях произ- водственного процесса, предварительно оцени- 49 вают с помощью твердофазного ИФА, используя для этого очищенные антитела белков клетки-хо- зяина, показавшие высокую эффективность в вестерн-блоттинге. На основании результатов описанных выше испытаний антисыворотки от разных животных объединяют, повторно испытывают и очищают. Очистка и подготовка Антитела к белкам клетки-хозяина долж- ны быть очищены. Как правило, применяют аффинную хроматографию на основе связы- вания с белком А или белком G и (или) аффин- ную хроматографию на основе антигена белка клетки-хозяина. Может потребоваться дополнительная очистка для удаления потенциальных агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии. Для ИФА часть очищенных антител к бел- кам клетки-хозяина конъюгируют с меткой, не- обходимой для детекции результатов реакции (например, биотином или пероксидазой хрена). Очищенные антитела к белкам клетки-хозя- ина и антисыворотки хранят при температуре, обеспечивающей их стабильность. Определение характеристик и испытания Полученные и используемые в качестве реак- тивов поликлональные антитела должны обеспе- чивать связывание максимального спектра белков антигена и не давать перекрестной реакции с це- левым белком. Их пригодность оценивают путем подтверждения охвата белков клетки-хозяина, ха- рактерных для производственного процесса. Для этого проводят двумерный электрофорез антигенов белков клетки-хозяина. Полученный белковый профиль после иммуноокрашивания сравнивают с белковым профилем, полученным при окрашивании неселективным красителем. Антитела к белкам клетки-хозяина должны рас- познавать широкий спектр белков клетки-хозяи- на при любых зарядах и молекулярных размерах. Могут быть рассмотрены другие подходящие методы.
ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Иммунизацию, очистку и производство ан- тител к белкам клетки-хозяина выполняет про- изводитель коммерческого набора реактивов, и подробная информация по производству мо- жет быть не представлена. В большинстве слу- чаев возможен лишь ограниченный контроль за постоянством качества реактивов от серии к серии, в связи с чем необходимо проводить соответствующие сравнительные испытания серий. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ- ХОЗЯИНА Метод твердофазного ИФА для определения остаточных белков клетки-хозяина разработан с целью обнаружения и количественного опреде- ления гетерогенной смеси антигенов, содержа- щихся в различных концентрациях, с помощью антител, добавляемых в соотношении не один к одному. Ниже описаны требования к разработ- ке и валидации данного типа ИФА. Методику испытания на остаточные бел- ки клетки-хозяина методом ИФА, валидируют по характеристикам: правильность, специфич- ность, прецизионность, предел количественного определения, предел обнаружения, линейность, диапазон применения и робастность. В течение жизненного цикла лекарственного препарата может потребоваться полная или частичная повторная валидация методики, например, при внесении изменений в производственный про- цесс, которые могут повлиять на пригодность антигенов. ПРАВИЛЬНОСТЬ Правильность подтверждают методом добавок и открываемости стандартного образ- ца белка клетки-хозяина в соответствующем «фоновой» матрице (например, активная фарма- цевтическая субстанция или образец с соответ- ствующего этапа очистки). СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность подтверждают отсутствием интерференции со стороны матрицы (напри- мер, содержащей активную фармацевтическую субстанцию). Для оценки специфичности могут быть использованы результаты проверки пра- вильности. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ Повторяемость, промежуточная прецизион- ность и воспроизводимость должны быть соот- ветствующим образом подтверждены. 50 ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ Чувствительность обычно находится в диапазоне частей на миллион (ppm) и вы- ражается через предел количественного определения. Предел количественного опре- деления как правило определяют методом добавок белков клетки-хозяина в активную фармацевтическую субстанцию или в соот- ветствующую пробу матрицы и рассчитывают на основе минимальной добавки, обеспечи- вающей отклик с заданной правильностью и прецизионностью. Предел обнаружения чаще всего не опреде- ляют, так как он не является обязательным пара- метром валидации. ЛИНЕЙНОСТЬ Линейность методики количественного определения остаточных белков клетки-хозя- ина подтверждают с помощью серии разведе- ний стандартного образца белка клетки-хозяина и изучения правильности. В силу особенностей количественного опре- деления остаточных белков клетки-хозяина, большим количеством видов белков и поликло- нальных антител белков клетки-хозяина, может наблюдаться нелинейность при разведениях об- разцов. Например, полученные путем обратных вычислений результаты возрастают по мере ро- ста числа разведений образцов. В большинстве случаев это связано с излишком одного или не- скольких отдельных белков клетки-хозяина в об- разце по сравнению с доступным количеством антител в ИФА белков клетки-хозяина. Как след- ствие, необходимо оценить линейность при раз- ведениях для соответствующих стадий процесса путем сравнения целевой и измеренной концен- трации остаточных белков клетки-хозяина при разной степени разведения пробы.
Линейность методики считается подтвержденной, если для разных разведений образца соблюдаются кри- терии приемлемости. Исследования, подтверж- дающие линейность при разведениях образца, можно проводить при разработке метода или на этапе валидации. Если при разведении образца отмечают от- сутствие линейности, делают многократные раз- ведения вне границ диапазона, в котором обна- руживается нелинейность. Окончательное содержание остаточных белков клетки-хозяина обычно выражают как среднюю концентрацию белков клетки-хозяина, полученную как минимум для двух разведений в пределах линейного диапазона. При соответ- ствующем обосновании может быть достаточно одного разведения. ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ Диапазон применения методики обычно определяют по концентрациям остаточных бел- ков клетки-хозяина, для которых был показан подходящий уровень прецизионности, правиль- ности и линейности. РОБАСТНОСТЬ Оценка робастности проводится на этапе разработки методики. ЗАМЕНА МЕТОДА КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И (ИЛИ) ИСПОЛЬЗУЕМЫХ РЕАКТИВОВ Количество антигенов и антител должно быть достаточным, чтобы обеспечить возможность проведения испытания на остаточные белки клет- ки-хозяина в течение нескольких лет. Следова- тельно, обеспеченность и постоянство качества реактивов должны надлежащим образом управ- ляться на протяжении всего жизненного цикла испытания. Для общего метода количественного определе- ния остаточных белков клетки-хозяина, чтобы убе- диться в постоянстве качества реактивов, может по- требоваться повторная проверка пригодности или повторная валидация методики для каждой новой серии реактива, поскольку их качество может ме- няться от одной серии к другой. Для процесс-специфичных и для платформен- ных методов количественных определений необхо- димость в новых сериях реактивов для испытания на белки клетки-хозяина может возникнуть в двух основных случаях: – исчерпаны запасы стандартного образца белков клетки-хозяина и (или) антител; в таком случае антитела могут быть выделены из запаса замороженной сыворотки или требуется новая иммунизация; – изменение производственного процесса может повлиять на совокупность видов белков 51 клетки-хозяина, присутствующих в очищенных промежуточных продуктах или активной фар- мацевтической субстанции; реактив для испы- тания может не подходить для обнаружения и количественного определения модифицирован- ных белков клетки-хозяина; поэтому изменение производственного процесса может обусловить непригодность реактивов для использования ис- пытании. Вновь приготовленные реактивы долж- ны быть тщательно охарактеризованы (напри- мер, сочетанием методов двумерного элек- трофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и вестерн-блоттинга или сочетанием методов двумерного электрофо- реза в полиакриламидном геле с натрия доде- цилсульфатом с дифференциальным гель-э- лектрофорезом и идентификацией с помощью масс-спектрометрии). Необходимо оценить валидационные характеристики методики с использованием новых реактивов. Проверку новых реактивов рекомендуется проводить па- раллельно с имеющимися ранее одобренными реактивами. 52 Таблица 2.1.6.20.-1.
– Рекомендации по оценке пригодности реактивов и оценке валидационных характеристик методики испытания в случае истощения запаса используемых реактивов или внесения изменения в производственный процесс Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Оценка пригодности Концентрацию белка в новой серии реактива предпочти- тельно определять с исполь- зованием тех же методов, что и для текущей (одобрен- ной) серии реактива, чтобы обеспечить сопоставимость концентраций белка. С по- мощью подходящих мето- дов (например, одно- или двумерный электрофорез, двумерный дифференци- альный гель-электрофорез оценивают сходство сово- купностей видов белков меж- ду новой серией и текущей (одобренной) серией реактивов. Определяют общую концентрацию белка новой серии антител. Конечную концен- трацию для количественного определения необходимо установить для новой серии, чтобы получить такую же калибровочную кривую, что и для текущей (одобренной) серии реактива. Для детектирующих антител с меткой (вторичные антитела) контролируют стехиометрию белков для подтвержде- ния аналогичности текущей (одобренной) серии антител. Иммунореактивность новой серии ан- тител сравнивают качественно (визуаль- ное сравнение) или полуколичественно (определение области охвата) с теку- щей (одобренной) серией подходящими методами (например, одно- или двумер- ный вестерн-блоттинг). Из-за изменчиво- сти методики настоятельно рекомендует- ся проводить эту проверку пригодности параллельно с текущей (одобренной) серией антител. Эффекты изменений производственного процесса, которые могут повлиять на совокупность видов бел- ков клетки-хозяина, проверяют подходящими мето- дами (например, одно- или двумерный электрофорез, вестерн-блоттинг, количественное определение белков клетки-хозяина). Если изменение производственного процесса не приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, но была подтверждена пригод- ность текущих (одобренных) реактивов, то текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производ- ственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, и было показано, что текущие (одобренные) реактивы не подходят для нового произ- водственного процесса, необходимо разработать новую методику испытания, включая пробную ферментацию в соответствии с новым производственным процессом и новую иммунизацию. 53 Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Испытание реактивов для количественного определения остаточных белков клетки-хозяина Новую серию реактива испы- тывают в сравнении с текущей (одобренной) серией реакти- ва с использованием метода добавок при различных кон- центрациях в пределах диапа- зона применения методики. Сравнивают сходимость кали- бровочных кривых, получен- ных с использованием новой серии реактива и текущей (одобренной) серии реактива. Сравнивают калибровочные кривые, полу- ченные при использовании новых и теку- щих (одобренных) серий антител. Сокращенное исследование проводят с испытанием соответствующих техноло- гических образцов (например, начиная от стадии очистки полупродукта до получения активной фармацевтической субстанции).
В параллельном эксперименте новая серия антител должна обнаруживать белки клет- ки-хозяина на разных этапах процесса в той же концентрации или ниже, что обнаружи- вает текущая (одобренная) серия антител. Сбор, полученный в пробном этапе нового процесса, прове- ряют на открываемость добавки с использованием текущей методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина. Образцы, соответствующие стадии производственного процесса (например, начиная от стадии очистки сбора до получения активной фармацевтической субстанции) из нового и текущего процессов проверяют параллельно. Таблица 2.1.6.20.-1. – Продолжение 54 Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Оценка валидационного статуса Если проверка пригодно- сти реактивов и испытания ИФА показали соответствие нового стандартного образца белка (белков) клетки-хозя- ина, текущий (одобренный) стандартный образец может быть заменен. Повторная ва- лидация методики испытания не требуется. Если новый стандартный образец белка (белков) клет- ки-хозяина значительно отли- чается по совокупности ви- дов белков и (или) по рабочим характеристикам в количе- ственном определении от те- кущего (одобренного) стан- дартного образца, требуется повторная валидация мето- дики. Если проверка пригодности реактивов и испытания ИФА показывают соответствие новой серии антител, текущая (одобрен- ная) серия антител может быть заменена. Повторная валидация методики испытания не требуется. Если новая серия антител значитель- но отличается по иммунореактивности вестерн-блоттинга или чувствительности иммуноанализа и (или) по рабочим харак- теристикам в количественном определении от текущей (одобренной) серии антител, требуется повторная валидация методики. Если для нового производственного процесса текущая (одобренная) серия антител показывает аналогичную или более высокую иммунореактивность по сравнению с пре- дыдущим процессом, и результат количественного опре- деления остаточных белков клетки-хозяина подтвержда- ет приемлемую открываемость белков клетки-хозяина из пробного сбора нового процесса, а также аналогичную или более высокую чувствительность для образцов из соответ- ствующих стадий производственного процесса, то текущая методика количественного определения и реактивы счита- ются подходящими для нового процесса. Повторная валида- ция методики испытаний не требуется. Если ИФА обнаруживает существенные различия в откры- ваемости добавки белков клетки-хозяина или в определяе- мых концентрациях белков клетки-хозяина на отдельных стадиях для текущего и нового процессов, при том, что реактивы признаны подходящими, требуется повторная валидация методики. Изменение производственного процес- са может также повлиять на линейность разведения испы- туемых образцов из отдельных стадий производственного процесса; если эти стадии являются критическими с точки зрения стратегии контроля содержания остаточных белков клетки-хозяина, может потребоваться повторная валидация или даже создание новых реактивов антител. В случае существенного изменения совокупности видов белков клетки-хозяина в новом производственном процес- се, которое приводит либо к несоответствию совокупности видов белков по сравнению с текущим (одобренным) стан- дартным образцом (антигенами), либо к снижению имму- нореактивности антител, либо к значительному снижению чувствительности иммунологического анализа, готовят но- вые реактивы для анализа и проводят валидацию методики анализа с использованием новых реактивов. Таблица 2.1.6.20.-1.
– Продолжение 55 201060021-2023 2.1.6.21. ПРИМЕНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ Настоящая общая фармакопейная статья приводится для информации. 1. ВВЕДЕНИЕ Эндотоксины грамотрицательных бактерий являются самой распространенной причиной токсических реакций, возникающих в резуль- тате загрязнения фармацевтической продукции пирогенами; их общая пирогенная активность намного выше, чем у других известных пиро- генных веществ. Бактериальные эндотоксины представляют собой липополисахариды, кото- рые являются термостабильным компонентом наружной части клеточной стенки всех грамо- трицательных микроорганизмов. Существует лишь небольшое количество пирогенов, обла- дающих иной структурой. В целом, по отсут- ствию бактериальных эндотоксинов в субстан- ции для фармацевтического применения и (или) лекарственном препарате можно сделать вывод об отсутствии пирогенных веществ при условии, что наличие пирогенов неэндотоксиновой при- роды исключено. Испытания на пирогенность (2.1.6.2) и на активацию моноцитов (2.1.6.13) являются подходящими методами для опреде- ления отсутствия пирогенов неэндотоксиновой природы в субстанции для фармацевтического применения и лекарственном препарате. Присутствие бактериальных эндотоксинов может быть замаскировано факторами, вли- яющими на реакцию между эндотоксинами и лизатом амебоцитов мечехвоста. На обнаруже- ние эндотоксинов могут влиять условия и (или) время хранения образцов и реактивов. Следова- тельно, перед проведением испытания на бакте- риальные эндотоксины или перед выбором меж- ду испытаниями на бактериальные эндотоксины и на пирогенность или на активацию моноцитов, необходимо подтвердить возможность его про- ведения для конкретной субстанции для фарма- цевтического применения и (или) лекарственно- го препарата; при этом может быть необходимо выполнение процедуры устранения мешающих факторов. Согласно указаниям общей фармакопей- ной статьи 2.1.6.8. Бактериальные эндотокси- ны, при проведении испытания должны быть выполнены следующие условия: – подтвержденное отсутствие влияния мате- риалов, используемых в испытании. Должно быть показано отсутствие эндотоксинов в воде для испы- тания на бактериальные эндотоксины, других реак- тивах и расходных материалах. Также, должна быть подтверждена чувствительность лизата амебоцитов, заявленная производителем; – чувствительность лизата амебоцитов опре- деленная как в присутствии, так и в отсутствии испытуемого образца, в связи с возможным влия- нием на испытание. Между двумя полученными значениями чувствительности не должно быть значимой разницы. В общей фармакопейной статье 2.1.6.8. Бактериальные эндотоксины представлены методы удаления мешающих факторов; в слу- чае использования других методов должно быть проведено дополнительное испытание для под- тверждения нейтрализации или удаления мешаю- щих факторов. В данной общей фармакопейной статье приве- дены причины установления требований к испыта- ниям на бактериальные эндотоксины, а также разъ- яснения по расчетам и интерпретации результатов. Замена испытания Пирогенность, указан- ного в частной фармакопейной статье, на испы- тание Бактериальные эндотоксины или другие методы, например, испытание на активацию моноцитов или испытание с использованием ре- комбинантного фактора С, требует подтвержде- ния возможности проведения метода для кон- кретной субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата и получения соответствующего результата альтер- нативным методом, в соответствии с указаниями раздела 1. Общие сведения Фармакопеи Союза (см.
также раздел 13 данной общей фармакопей- ной статьи). Метод определения бактериальных эндоток- синов может быть указан в частной фармакопей- ной статье. Если метод не указан, используют лю- бой из методов от A до F общей фармакопейной статьи 2.1.6.8. Бактериальные эндотоксины. 56 2. МЕТОДЫ И КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ 2.1. МЕТОДЫ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Добавление бактериальных эндотоксинов к лизату амебоцитов может привести к помут- нению, осаждению или гелеобразованию (гель- тромб). Первоначально, только гель-тромб метод применяли для оценки качества субстанции для фармацевтического применения и (или) лекар- ственного препарата при проведении испытания на бактериальные эндотоксины. Преимущество метода заключалось в простоте принятия реше- ния о качестве испытуемого образца по резуль- татам испытания на основании отсутствия или присутствия плотного геля, видимого невоору- женным глазом. Количественные фотометри- ческие методы C, D, E и F были разработаны позднее: данные методы требуют оснащения со- ответствующим оборудованием, но могут быть автоматизированы для рутинных испытаний большого количества образцов одной и той же субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата. Бактериальные эндотоксины могут адсор- бироваться на поверхности пробирок или пипе- ток из определенных полимерных материалов или типов стекла. Мешающие факторы могут появиться вследствие высвобождения веществ из полимерных материалов. Следовательно, ис- пользуемое оборудование должно быть проверено. 2.2. ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ Решение использовать в испытании на бак- териальные эндотоксины методы качественного анализа подразумевает, во-первых, установле- ние предельного содержания эндотоксинов для субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата, подлежащих исследованию, и, во-вторых, проведение испы- тания с целью получения информации будет ли концентрация эндотоксинов в испытуемом образце ниже или выше установленного пре- дельного содержания эндотоксинов. Количественные фотометрические методы C, D, E и F позволяют определить содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце, но для соответствия фармакопейным требованиям и при рутинном контроле качества основной вопрос заключается в том, превышает ли это значение допустимое предельное содер- жание эндотоксинов. При установлении предельного содержа- ния бактериальных эндотоксинов в лекар- ственном препарате следует учитывать его терапевтическую дозу и пути введения. При уста- новлении предельного содержания эндотоксинов в субстанции для фармацевтического примене- ния следует использовать рекомендации по при- менению и дозированию лекарственного препа- рата, в состав которого она входит. Предельное содержание бактериальных эндотоксинов определяет допустимую концен- трацию эндотоксинов в лекарственном препа- рате. Если содержание эндотоксинов не превы- шает этого показателя, то даже при введении пациенту максимальной дозы лекарственно- го препарата в течение часа предполагаемым путем не возникает токсической реакции, обусловленной эндотоксинами. Методы качественного анализа в ис- пытаниях на бактериальные эндотоксины не позволяют установить различия между содержанием эндотоксинов равным предель- ному содержанию или выше его. Образова- ние плотного геля происходит, если содер- жание эндотоксинов в испытуемом образце достигает значения предельного содержания эндотоксинов и когда превышает его. В обоих случаях испытуемый образец не выдерживает испытание.
Только при отсутствии образова- ния плотного геля можно сделать вывод, что содержание эндотоксинов ниже предельного содержания эндотоксинов. Для испытуемых образцов в твердом состо- янии предельное содержание эндотоксинов на единицу массы или международную единицу ак- тивности лекарственного средства должно быть преобразовано в содержание бактериальных эндотоксинов на миллилитр испытуемого рас- твора, поскольку данное испытание может быть проведено только в растворе. Лекарственные препараты в жидком состоянии (например, рас- творы для инфузий) обсуждаются ниже, в разде- ле 2.5 данной общей фармакопейной статьи. 2.3. ВЫЧИСЛЕНИЕ ПРЕДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ Для лекарственных препаратов, вводи- мых парентерально, предельное содержание 57 эндотоксинов, определенное на основе дозы, рассчитывают по формуле: ПСЭ = К M где: К — предельная пирогенная доза эндоток- сина на килограмм массы тела; M — максимальная разовая доза лекар- ственного препарата на килограмм массы тела. Если лекарственный препарат вводится с частыми интервалами или инфузионно, вели- чина М соответствует общей максимальной дозе, вводимой в течение 1 ч. Предельное содержание эндотоксинов зави- сит от лекарственного препарата, пути его вве- дения и может быть указано в некоторых част- ных фармакопейных статьях. Значения предельной пирогенной дозы бактериальных эндотоксинов (К) приведены в таблице 2.1.6.21.-1. 2.4. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ПРЕДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ В КОНКРЕТНОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ИЛИ ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ Допустимое предельное содержание эндо- токсинов в субстанции для фармацевтического применения или лекарственном препарате уста- навливают с учетом следующих аспектов. Расчет предельного содержания эндотоксинов Предельное содержание эндотоксинов рас- считывают, как описано в разделе 2.3 данной общей фармакопейной статьи. Показатель опре- деляет границу безопасности, которую нельзя превышать, если лекарственное средство пред- назначено для медицинского применения. Значение предельного содержание эндотоксинов, указанное в частной фармакопейной статье Обычно отражает достижимое в контроли- руемом производственном процессе содержание эндотоксинов в субстанции для фармацевтиче- ского применения или лекарственном препарате. Следовательно, значения предельного содержание эндотоксинов, указанное в частной фармакопей- ной статье, может быть меньше рассчитанного предельного содержания эндотоксинов. Произво- дитель может установить более жесткие требо- вания к предельному содержанию эндотоксинов, чем указанные в частной фармакопейной статье. Возможности производственного процесса Производственный процесс может обеспе- чивать снижение концентрации или удаление бактериальных эндотоксинов и соответственно приводить к более низким значениям предель- ного содержания эндотоксинов. Дополнительные требования безопасности Меры предосторожности принимают с уче- том популяции пациентов (например, использо- Таблица 2.1.6.21.-1.
– Значения предельной пирогенной дозы бактериальных эндотоксинов Путь введения К внутривенный 5,0 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) внутривенный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 2,5 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) интратекальный 0,2 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) интратекальный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 14 ME/V МЕ/мл (международных единиц эндотоксина на максимальную рекомендуемую дозу (объем)), где V максимальная рекомендуемая доза (объем) парентеральный, для лекарственных препаратов, вводимых в дозе, рассчитываемой на квадратный метр поверхности тела 100 ME/м2 (международных единиц эндотоксина на квадратный метр поверхности тела) Примечание. Одна международная единица (МЕ) эндотоксина соответствует одной единице эндотоксина (ЕЭ). 58 вание в педиатрии, для пациентов с истощением или кахексией и т.д.), конкретных региональных требований (например, использование при расче- тах предельного содержания эндотоксинов более низкой средней массы тела, 60 кг вместо 70 кг) или любые дополнительные меры безопасности, запрошенные уполномоченным органом. Состав При установлении значения предельного со- держания эндотоксинов необходимо учитывать любую теоретическую эндотоксиновую нагруз- ку, вносимую любыми компонентами, исполь- зуемыми для растворения и (или) разведения (например, вода для инъекций) субстанции для фармацевтического применения или лекарствен- ного препарата, или получаемую от исходных материалов и (или) иcходного сырья. 2.5. МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОЕ РАЗВЕДЕНИЕ В данном разделе рассматривают вопросы: какое разведение субстанции для фармацевтиче- ского применения или лекарственного препарата следует использовать в испытании для получения подтверждения, что при отрицательном результате содержание эндотоксинов в испытуемом образце меньше предельного содержания эндотоксинов, а при положительном результате равно или пре- вышает допустимое предельное содержание. Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое содержа- ние эндотоксинов. Оно зависит от предельного содержания эндотоксинов и чувствительно- сти лизата амебоцитов (предела обнаружения). МДР рассчитывают по формуле: МДР = ПСЭ · С λ где: ПСЭ — предельное содержание эндотоксинов; С — концентрация испытуемого раствора; λ — чувствительность лизата амебоцитов в международных единицах в миллилитре. Концентрацию испытуемого раствора выра- жают в единицах: – мг/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в массовых единицах (МЕ/мг); – ЕД/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в пересчете на единицу биоло- гической активности (МЕ/ЕД); – мл/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в объемных единицах (МЕ/мл). Предел обнаружения (λ) представляет со- бой чувствительность лизата в гель-тромб методе (МЕ/мл), заявленную производите- лем лизата амебоцитов, или самую низкую концентрацию эндотоксинов, определенную по стандартной калибровочной кривой в тур- бидиметрическом или хромогенном методах. Если значение МДР не является целым чис- лом, для рутинных испытаний можно исполь- зовать подходящее целое число, меньшее, чем МДР (приготовление раствора испытуемого образца в меньшем разведении, чем MДР). В та- ком случае, отрицательный результат означает, что содержание бактериальных эндотоксинов ниже допустимого предельного содержания.
Если содержание бактериальных эндотокси- нов в испытуемом образце ниже допустимого предельного содержания эндотоксинов, но до- статочно велико, чтобы вызвать гелеобразова- ние лизатом амебоцитов, то испытание в таких условиях может быть положительным. Следо- вательно, когда в испытании с использовани- ем «рабочего» разведения, кратность которого меньше МДР, получен положительный резуль- тат, испытуемый образец разводят до МДР и по- вторяют испытание. В любом сомнительном или спорном случае необходимо использовать МДР. Данный факт подчеркивает важность подтвержде- ния чувствительности лизата амебоцитов. Пример Необходимо провести испытание рас- твора 50 мг/мл натрия фенитоина (для вну- тривенного введения). Определяют МДР, используя следующие данные: М — максимальная доза для человека 15 мг/кг; С — концентрация испытуемого раствора 50 мг/мл; К — предельная пирогенная доза эндотокси- нов 5 МЕ/кг; λ — предел обнаружения 0,4 МЕ/мл. МДР = 5 · 50 · 1 = 41,67 15 0,4 59 Для рутинных испытаний данного лекар- ственного препарата 1 мл испытуемого раствора разводят до 20 мл (MДР/2 округляют до ближай- шего меньшего целого числа). В случае, если результат испытания будет положительным, то 1 мл испытуемого раствора следует развести до 41,67 мл и повторить испытание. Разведение до 41,67 мл также необходимо, когда испытание проводят в спорных случаях. 3. ОЦЕНКА РИСКА Отсутствие бактериальных эндотоксинов в субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственном препарате, как указано в разделе 1 данной общей фармакопейной статьи, позволяет сделать вывод об отсутствии пироге- нов при условии исключения присутствия пиро- генов неэндотоксиновой природы. Для подтверждения отсутствия неэндотокси- новых пирогенов в субстанциях для фармацевти- ческого применения и (или) лекарственных препа- ратах рекомендуется использовать испытания на пирогенность (2.1.6.2) или на активацию моноцитов (2.1.6.13) при выпуске или в ходе разработки произ- водственного процесса. Если в производственный процесс вносят какие-либо изменения, способные повлиять на качество субстанции для фармацевти- ческого применения и (или) лекарственного пре- парата в отношении пирогенности, испытания вы- бранным методом повторяют. Например, к таким изменениям относят использование другого исход- ного сырья, другой производственной площадки и других параметров процесса. Решение об использовании испытания на бактериальные эндотоксины в качестве един- ственного испытания на пирогенность необ- ходимо принимать после тщательной оценки риска для субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата, содержащих пирогены неэндотоксиновой при- роды. Оценку риска проводят с учетом любого фактора, способного привести к включению пи- рогенов, не обнаруживаемых при испытании на бактериальные эндотоксины. Далее представлен перечень факторов, ко- торые необходимо учитывать при оценке риска. Список не является исчерпывающим, при необ- ходимости может быть дополнен. Производство (химический синтез, фермен- тация, биотехнологический метод). Для продук- тов ферментации учитывают экспрессионную систему: прокариотическая или эукариотическая и, в случае использования прокариотической системы, ‒ грамположительные или грамотри- цательные бактерии. Кроме того, рассматрива- ют компоненты питательных сред с учетом их происхождения (синтетические, животного или растительного происхождения). Бионагрузка.
Должно быть учтено потенци- альное присутствие дрожжевых грибов и грампо- ложительных бактерий в качестве контаминантов активной фармацевтической субстанции, вспо- могательных веществ или исходных материалов и исходного сырья, используемых при производ- стве лекарственного препарата, а также проис- хождение сырья (синтетическое, животного или растительного происхождения). Качество воды также играет важную роль в общей оценке риска. Возможности последующей стадии произ- водственного процесса. Необходимо подтвер- дить, удаляются ли бактериальные эндотоксины на последующих стадиях производственного процесса. Безопасность. При оценке риска необходимо учитывать целевую популяцию и путь введения (например, внутривенно, интратекально и др.). Стабильность обнаружения эндотокси- нов. Следует учитывать, что на возможность обнаружения эндотоксинов оказывают влияние взаимодействие с определенными компонента- ми, условия или время хранения, температура, пробоподготовка испытуемого образца. Должны быть установлены процедуры хранения, пробо- подготовки и смешивания образцов, подтверж- дающие отсутствие влияния на стабильность обнаружения бактериальных эндотоксинов. 4. СТАНДАРТЫ ЭНДОТОКСИНА В качестве стандартного образца может быть использован стандартный образец, с содержа- нием бактериальных эндотоксинов, выражен- ным в международных единицах эндотоксина на упаковку, калиброванный относительно меж- дународного стандартного образца, например, СО ФЕАЭС эндотоксина. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца эндотоксина, устанавливаемую Всемирной организацией здравоохранения. Одна международная единица 60 (МЕ) эндотоксина соответствует одной единице эндотоксина (ЕЭ). 5. ВОДА ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ Вода для испытания на бактериальные эндо- токсины представляет собой стерильную воду, не содержащую эндотоксинов в количествах, определяемых в испытании. Обычно она ком- мерчески доступна и сертифицирована. Для подготовки воды для испытания на бак- териальные эндотоксины помимо тройной ди- стилляции могут быть использованы и другие методы. Приемлемые результаты дает метод об- ратного осмоса, в некоторых случаях предпоч- тительнее проведение процесса дистилляции более трех раз. Независимо от используемого метода, полученная вода не должна содержать поддающиеся обнаружению бактериальные эн- дотоксины. 6. pH СМЕСИ В испытании на бактериальные эндоток- сины оптимальное образование плотного геля происходит при рН (6,0 – 8,0). Следует учиты- вать, что добавление лизата амебоцитов в ис- пытуемый образец может приводить к сниже- нию значения рН. 7. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЗАЯВЛЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИЗАТА АМЕБОЦИТОВ При приготовлении растворов лизата аме- боцитов следуют инструкции производителя. Концентрации эндотоксинов в конечной точке реакции для каждого из разведений в гель-тромб методах А и В преобразуют в логарифмы. Не- обходимость преобразования заключается в том, что построенный график частотного распределе- ния логарифмических значений, обычно гораздо ближе к кривой нормального распределения, чем частотное распределение самих коэффи- циентов разведения; фактически они настолько близки, что допустимо использовать нормаль- ное распределение в качестве математической модели и вычисление доверительного интервала с помощью t-критерия Стьюдента. 8.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Испытания на присутствие бактериальных эндотоксинов не могут быть проведены без дополнительной подготовки, если: – испытуемый образец не смешивается с реактивами; – рН раствора испытуемого образца нельзя довести до значения 6,0 – 8,0; – испытуемый образец ингибирует или ак- тивирует ферментативную реакцию (например, испытуемый образец содержит β-D-глюканы). Необходимо проводить предварительное испы- тание на наличие мешающих факторов. В случае обнаружения мешающих факторов необходимо доказать эффективность процедуры их удаления и отсутствие влияния процедуры на любые присут- ствующие бактериальные эндотоксины. Целью предварительного испытания явля- ется проверка нулевой гипотезы, что чувстви- тельность лизата амебоцитов в присутствии испытуемого образца не отличается от чувстви- тельности лизата амебоцитов в отсутствие ис- пытуемого образца. В методах А и В нулевую гипотезу принимают, если чувствительность лизата амебоцитов в присутствии испытуемо- го образца составляет не менее 0,5 и не более 2 от чувствительности лизата амебоцитов в отсут- ствие испытуемого образца. В испытаниях на присутствие мешающих факторов методами А и В необходимо ис- пользование испытуемого образца, в котором эндотоксины не обнаруживаются. Это пред- ставляет собой теоретическую проблему при испытании новых лекарственных средств. В связи с этим, для количественных фотоме- трических методов C, D, E и F используют другой подход. Следует обратить внимание, что для проведе- ния испытания методами D и E, в которых исполь- зуют хромогенный пептид, необходимы реактивы, не используемые в методах A, B, C и F. Следо- вательно, соответствие методов A, B, C или F требованиям к мешающим факторам нельзя без экспериментального подтверждения экстра- полировать на метод D или метод E. 61 9. УСТРАНЕНИЕ МЕШАЮЩИХ ФАКТОРОВ Методики устранения мешающих факто- ров не должны приводить к увеличению или уменьшению (например, вследствие адсорбции) количества бактериальных эндотоксинов в ис- пытуемом образце. Корректный способ провер- ки эффективности нейтрализации мешающих факторов состоит в применении метода доба- вок, который представляет собой добавление к испытуемому образцу известного количества бактериальных эндотоксинов с последующим измерением их открываемости. Методы С и D. Если мешающие факторы обусловлены природой субстанции для фарма- цевтического применения или лекарственного препарата и не могут быть устранены общепри- нятыми методами (например, разведением или центрифугированием), возможно построение калибровочной кривой с использованием испы- туемого образца той же субстанции для фарма- цевтического применения или лекарственного препарата, но очищенного от эндотоксинов пу- тем соответствующей обработки или разведе- ния. Испытание на бактериальные эндотоксины проводят путем сравнения с указанной калибро- вочной кривой. Установлено, что в большинстве случаев подходит ультрафильтрация с использовани- ем асимметричных мембранных фильтров из триацетата целлюлозы. Фильтры должны быть надлежащим образом проверены, поскольку при некоторых обстоятельствах производные целлюлозы (β-D-глюканы) могут быть причиной ложноположительных результатов.
Другим вариантом удаления мешающих факторов является двухэтапная процедура, при которой, на первом этапе бактериальные эндо- токсины в испытуемом образце с мешающими факторами фиксируют на твердой фазе (напри- мер, метод предварительного концентрирования с использованием твердофазной экстракции), а на втором – после удаления мешающих факто- ров (например, путем промывки) бактериальные эндотоксины обнаруживают в неизменном виде в подходящих условиях испытания. 10. ЦЕЛЬ ПРОВЕДЕНИЯ КОНТРОЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ Цель проведения контрольных испытаний состоит в проверке активности лизата амебоци- тов в условиях испытаний методами A и B. Выполняют контрольное испытание с раствором стандартного образца эндотоксина в воде для испытания на бактериальные эндоток- сины в концентрации, в два раза превышающем указанную производителем чувствительность лизата амебоцитов. В качестве отрицательного контроля ис- пользуют воду для испытания на бактериальные эндотоксины для подтверждения отсутствия бактериальных эндотоксинов в обнаруживаемой концентрации. Положительный контроль, содержащий ис- пытуемый образец в концентрации, применяе- мой в испытании, предназначен для подтвержде- ния отсутствия мешающих факторов. 11. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Незначительные количества бактериальных эндотоксинов, содержащиеся в воде или в лю- бом другом реактиве или материале, с которыми во время испытания контактирует лизат амебо- цитов, могут не обнаруживаться до тех пор, пока это количество не достигнет предела обнаруже- ния лизата амебоцитов. Даже незначительные количества эндотоксинов могут увеличить их содержание в растворе с испытуемым образцом до значения, несколько превышающего пре- дел обнаружения лизата амебоцитов, и вызвать положительную реакцию. Риск возникновения такого нежелатель- ного явления можно уменьшить путем про- верки воды для испытания на бактериальные эндотоксины, других реактивов и материалов с использованием наиболее чувствительно- го лизата амебоцитов или, по крайней мере, более чувствительного, чем лизат амебоцитов, применяемый при испытании лекарственно- го средства. Даже в этом случае риск такого ложноположительного результата не может быть полностью исключен. 62 12. РЕАЛИЗАЦИЯ МЕТОДОВ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Методы испытаний, приведенные в общих фармакопейных статьях и частных фармако- пейных статьях, валидированы в соответствии с принятой научной практикой и действующими рекомендациями по валидации аналитических методик и являются официальными (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). Сле- довательно, методы, представленные в общих фармакопейных статьях 2.1.6.8. Бактериаль- ные эндотоксины, 2.1.6.13. Испытание на ак- тивацию моноцитов и 2.1.6.12. Испытание на бактериальные эндотоксины с использованием рекомбинантного фактора С не нуждаются в повторной валидации (ревалидации), од- нако требуют подтверждения возможности их использования для конкретной субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата в конкретных усло- виях испытания. Процедура, а также материалы и реактивы, используемые в методике, должны быть проверены согласно указаниям для соот- ветствующего испытания. Отсутствие мешаю- щих факторов (при необходимости, процедуры их устранения) проверяют на образцах не менее, чем трех производственных серий. Испытание на активацию моноцитов, со- гласно указаниям общей фармакопейной статьи 2.1.6.13. Испытание на активацию моноцитов, в первую очередь, предназначено для замены ис- пытания на пирогенность.
В этой же общей фар- макопейной статье представлены рекомендации по выбору и использованию методов (1, 2 или 3) и валидации испытания. 13. ЗАМЕНА МЕТОДА, ПРЕДПИСАННОГО В ЧАСТНОЙ ФАРМАКОПЕЙНОЙ СТАТЬЕ 13.1. ЗАМЕНА МЕТОДОМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫМ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Замена метода, предписанного в частной фармакопейной статье, на другой метод, пред- ставленный в Фармакопее Союза, необходимо рассматривать как использование альтернатив- ного метода взамен фармакопейного (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). Альтер- нативный метод, представленный в фармакопее не нуждается в повторной валидации, однако необходимо подтверждение возможности его использования для конкретной субстанции для фармацевтического применения или лекарствен- ного препарата в конкретных условиях испыта- ния, а также для подтверждения эквивалентно- сти предписанному методу. 13.2. ЗАМЕНА МЕТОДОМ, НЕ ПРЕДСТАВЛЕННЫМ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Замена метода, предписанного в част- ной фармакопейной статье, методом, не представленным в Фармакопее Союза, необ- ходимо рассматривать как использование аль- тернативного метода взамен фармакопейного (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). 63 201080027-2023 2.1.8.27. КОЭФФИЦИЕНТ ПЕНООБРАЗОВАНИЯ (ИНДЕКС ВСПЕНИВАНИЯ) Общая фармакопейная статья предназначена для определения пенообразующей способно- сти лекарственного растительного сырья и др., содержащих сапонины. Для выполнения методики используют 1,0 г испытуемого образца при отсутствии дру- гих указаний в частной фармакопейной статье. ОБОРУДОВАНИЕ Прибор для определения коэффициента пенообразования (см. рисунок 2.1.8.27.-1) обычно состоит из: – штатива с держателем для пипеток; – пипетки класса А вместимостью 50 мл; – стеклянного мерного цилиндра вместимо- стью 250 мл с градуировкой 2 мл и внутренним диаметром (38 ± 3) мм; – резиновой груши для наполнения пипетки. Закрепляют пипетку в штатив с держате- лем так, чтобы наконечник находился в 45 см от основания мерного цилиндра, расположенно- го под ним. Наконечник пипетки выравнивают по центру мерного цилиндра. Перед испытани- ем проверяют правильность установки мерного цилиндра, заполняя его и пипетку водой дис- тиллированной Р так, чтобы вода, вытекающая из пипетки, попадала в центр мерного цилиндра. Отмечают местоположение мерного цилиндра. МЕТОДИКА Приготовление испытуемого раствора. В химический стакан вместимостью 250 мл помещают 1,00 г измельченного испытуемого образца (355) (2.1.1.4). Добавляют 50 мл воды дистиллированной Р и настаивают в течение 30 мин, перемешивая шпателем 3–5 раз для дис- пергирования испытуемого образца, избегая обра- зования пены. Ополаскивают шпатель и внутрен- ние стенки химического стакана дополнительно 50 мл воды дистиллированной Р так, чтобы смыть в воду как можно большее количество испытуемого образца. Продолжают настаивание в течение 30 мин без перемешивания и филь- труют через фильтровальную бумагу диаметром 125 мм. В качестве испытуемого раствора используют фильтрат. Выполнение испытания. Закрепляют пипетку в штативе с держателем, отбирают 50,0 мл испытуемого раствора с помощью пипетки. Оставшийся объем испытуемого рас- твора переносят, избегая образования пены, в мерный цилиндр, стенки которого предва- рительно смочены водой дистиллированной Р. Помещают мерный цилиндр на отмеченное ме- сто под пипеткой. Открывают клапан Е и сли- вают раствор из пипетки в мерный цилиндр. Записывают максимальную высоту пены, пре- жде чем она начнет оседать. Испытание по- вторяют дополнительно два раза, тщательно промывая пипетку и мерный цилиндр водой дис- тиллированной Р между испытаниями. Рисунок 2.1.8.27.-1.
– Прибор для определения коэффи- циента пенообразования А – резиновая груша для наполнения пипетки; Б – пипетка класса А вместимостью 50 мл; В – стеклянный мерный цилиндр вместимостью 250 мл с градуировкой 2 мл и внутренним диаметром (38 ± 3) мм; Г, Д, Е – клапаны груши 2.1.8. МЕТОДЫ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ 64 Результаты испытаний. Коэффициент пенообразования (IF) рассчитывают по формуле: IF = H m где: H — высота образовавшейся пены в сантиметрах; m — масса образца, используемого для приготовления испытуемого раствора, в граммах. Результатом является среднее трех определе- ний. 65 201090030-2023 2.1.9.30. СИТОВОЙ АНАЛИЗ Общая фармакопейная статья распространя- ется на метод определения степени измельчения порошков с помощью ситового анализа. Степень измельчения порошка выражают с учетом номинального размера отверстий сит, применяемых для неаналитических процедур (2.1.1.4, таблица 2.1.1.4.-1), или с применением специальных терминов: крупный, среднекруп- ный, мелкий и очень мелкий порошок (2.1.10.9). Если такие термины не могут быть исполь- зованы, степень измельчения в процентах выра- жают отношением массы порошка, прошедшего через сито определенного номинального разме- ра отверстий, к общей массе порошка. МЕТОДИКА Для определения степени измельчения по- рошков методом просеивания собирают сита так, чтобы сито с более крупным размером от- верстий было верхним, а с более мелким разме- ром отверстий – нижним, и присоединяют к ним собирательную чашку. Порошок просеивают (2.1.10.8), после чего взвешивают каждое сито и определяют массу остатка на нем, а также на собирательной чашке. Для определения суммарного распределения частиц по массе или объему с размером не более x обычно используют величину Q3(x) (2.1.10.9). Степень измельчения порошка, соответствую- щую номинальному размеру отверстий сита, ука- зывают в скобках в частной фармакопейной статье. В случае использования сита одного номи- нального размера отверстий через него должно проходить не менее 97 % массы порошка при отсутствии других указаний в частной фармако- пейной статье. 201090031-2023 2.1.9.31. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ РАСПЫЛЕНИЯ Общая фармакопейная статья определя- ет характеристики лекарственных препаратов для распыления, предназначенных для достав- ки действующих веществ в легкие с помощью небулайзеров. Для определения характеристик используют следующие испытания: – скорость высвобождения действующего вещества и общее содержание высвобождаемого вещества; – аэродинамическая оценка распыляемых аэрозолей. Данные испытания представляют подходы к определению дозы, получаемой пациентом, но не предназначены для оценки качества небу- лайзера. Для определения эффективности лекар- ственного препарата более приемлемым является средневзвешенное распределение частиц по мас- се, чем по количеству. Кроме того, масса действу- ющего вещества как функция аэродинамического диаметра в большей степени отражает их тера- певтическое действие на дыхательные пути. СКОРОСТЬ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА И ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ВЕЩЕСТВА Испытания проводят для определения скорости высвобождения действующего вещества и общего содержания высвобожда- емого вещества, используя стандартные усло- вия волюмометрического измерения скорости потока. Следует отметить, что небулайзеры с усилением дыхания или активируемые ды- ханием, оцениваются с помощью симулятора дыхания, так как выход лекарственного препа- рата из устройства значительно зависит от ско- рости вдыхаемого потока. Приведенная ниже методика основана на применении стандартной 2.1.9.
ФАРМАЦЕВТИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ 66 модели дыхания для взрослых. Если лекар- ственный препарат для распыления показан для применения только в педиатрии (новорожден- ные, младенцы и дети), должна использоваться модель дыхания для ребенка. Для проведения подходящего измерения массы высвобождае- мого вещества использование моделей дыхания является более предпочтительным, чем испы- тания при скорости непрерывного потока. Ско- рость высвобождения действующего вещества и общее содержание высвобождаемого веще- ства являются наиболее подходящими характе- ристиками для оценки высвобождаемой массы стандартным способом независимо от типа не- булайзера. Соответственно, приведенная ниже методика испытания позволит измерить мас- су действующего вещества, высвобождаемого в первом периоде времени, обычно составля- ющем 1 мин (оценка скорости высвобождения действующего вещества), а также общую массу высвобождаемого вещества. ОБОРУДОВАНИЕ Симулятор дыхания. Для испытания используют коммерчески доступный симулятор дыхания, способный воспроизводить определен- ную модель дыхания, технические характери- стики которого приводятся в таблице 2.1.9.31.-1. Модель дыхания взрослого человека применяют за исключением случаев, когда лекарственный препарат предназначен только для педиатрии. Тогда используют альтернативную модель дыха- ния, как указано в таблице 2.1.9.31.-1. Система фильтров. Для испытания ис- пользуют подходящий валидированный фильтр с низким сопротивлением, обеспечивающий ко- личественный сбор аэрозоля и полноту извле- чения действующего вещества соответствую- щим растворителем. Пустой (не используемый) объем корпуса фильтра не должен превышать 10 % дыхательного объема симулятора дыхания. МЕТОДИКА Фильтр вдоха (А), входящий в состав держа- теля фильтра, присоединяют к симулятору ды- хания (Б) в соответствии с рисунком 2.1.9.31.-1. Наполняют распылитель небулайзера (В) лекар- ственным препаратом в необходимом объеме в соответствии с инструкцией по применению. При необходимости, присоединяют мундштук распылителя к фильтру вдоха с помощью адап- тера мундштука, обеспечивая герметичность соединения. Необходимо удостовериться, что распылитель ориентирован надлежащим для использования образом, для этого может потребоваться изменение наклона симулятора дыхания и держателя фильтра. Симулятор дыха- ния настраивают для получения определенной модели дыхания. Рисунок 2.1.9.31.-1. – Установка для испытания с симу- лятором дыхания A – фильтр вдоха и держатель фильтра; Б – симулятор дыхания; В – распылитель Вначале запускают симулятор дыхания, затем, в начале ингаляционного цикла, – небу- лайзер, который функционирует в течение опре- деленного периода времени. Выбранное время, обычно (60 ± 1) с, должно обеспечить накопле- ние действующего вещества на фильтре вдоха, Таблица 2.1.9.31.-1. – Технические характеристики симулятора дыхания (форма волны синусоидальная) Показатель Технические характеристики взрослый новорожденный младенец ребенок дыхательный объем (мл) 500 25 50 155 частота (цикл/мин) 15 40 30 25 отношение вдох:выдох 1:1 1:3 1:3 1:2 67 достаточное для определения его содержания. Если количество действующего вещества, на- копленное на фильтре вдоха в течение 60 с, недостаточно для проведения испытания, про- должительность промежутка времени для сбора аэрозоля можно увеличить. Если фильтр пропи- тывается лекарственным препаратом, указанное время можно уменьшить. Во избежание пропи- тываемости фильтра при необходимости распы- ление прерывают и заменяют фильтр.
Новый фильтр и держатель фильтра помещают в рабо- чее положение и продолжают процесс до оста- новки распыления. По завершению выбранного периода времени останавливают небулайзер. РЕЗУЛЬТАТЫ С помощью подходящего метода испыта- ния определяют массу действующего вещества, накопленного на фильтре вдоха и держателе фильтра в течение каждого промежутка вре- мени. Определяют скорость высвобождения действующего вещества путем деления массы действующего вещества, накопленного на пер- вом фильтре вдоха, на время сбора. Определяют общую массу высвобождаемого действующего вещества, суммируя массу действующего веще- ства, накопленного на всех фильтрах и держате- лях фильтра. АЭРОДИНАМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РАСПЫЛЯЕМЫХ АЭРОЗОЛЕЙ Размер частиц (капель) лекарственных пре- паратов для распыления определяют при более низких скоростях потока, чем обычно исполь- зуются для порошковых ингаляторов и дозиру- ющих ингаляторов. Как правило, рекомендуют использовать скорость потока 15 л/мин, так как указанное значение приближено к средней ско- рости дыхания здорового взрослого человека (дыхательный объем 500 мл). Хотя лазерные приборы рассеяния света под малым углом (лазерная дифрактометрия) могут обеспечить быстрое измерение распределения по размеру частиц аэрозолей, образуемых небулайзером, указанные способы не обнаруживают действу- ющее вещество; в большей степени они изме- ряют частицы (капли) по размеру независимо от их состава. Изложенное выше применимо для гомогенных растворов, но может приводить к существенным ошибкам, если лекарственный препарат для распыления представляет собой суспензию или если происходит значительное испарение капель, как в определенных типах небулайзеров. Каскадные импакторы позволя- ют однозначно охарактеризовать аэрозоли по массе действующего вещества как функции аэродинамического диаметра. Кроме метода каскадной импакции, может применяться диф- ракция лазерного излучения при условии ва- лидации методики. Для проведения испытания используют каскадный импактор (см. раздел Прибор данной общей фармакопейной статьи), откалиброванный на скорость потока 15 л/мин. Для небулайзеров определение баланса масс способом, аналогичным для порошковых инга- ляторов и дозирующих ингаляторов, не прием- лемо, так как доза фиксируется при непрерыв- ном выходе лекарственного препарата. Опыты по количественному извлечению действующе- го вещества должны выполняться как часть разработки методики с целью ее валидации. В процессе измерения размера частиц (капель) важно контролировать испарение образуемых капель в небулайзерах для предотвращения ошибок. Испарение можно минимизировать, охла- див импактор до температуры около 5 °С, по- местив его в холодильник примерно на 90 мин. Вследствие высокого риска коррозии, вызывае- мой конденсацией солесодержащих капель при охлаждении импактора, прибор должен быть полностью очищен, включая межкаскадные ка- налы, после каждого дня использования. После каждого испытания рекомендуется высушивать все поверхности прибора, например, сжатым воздухом. Не следует сушить сжатым воздухом коллектор с микроотверстиями. ПРИБОР Подробное описание прибора, представляю- щего собой каскадный ступенчатый импактор, оснащенный коллектором с микроотверстиями (импактор нового поколения), и индукционно- го порта представлено в соответствующей об- щей фармакопейной статье и включает инфор- мацию о критических размерах и особенностях квалификации импактора (измерение уровня).
Для обеспечения полного количественного из- влечения действующего вещества из распылен- ного аэрозоля при заданной скорости потока в 15 л/мин в добавление к коллектору с микро- 68 отверстиями используют резервный фильтр. Фильтр размещают ниже микроотверстий (оп- ция внутреннего фильтра) или используют в дер- жателе вне импактора для улавливания любых мелких капель, прошедших последний уровень фракционирования по размеру. Для испытания аэрозолей, образуемых небулайзером, пресепа- ратор не применяют. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК Перегрузка импактора. При разработке и валидации методики важно подтвердить, что объем распыляемой жидкости, отобранной из небулайзера, не перегружает импактор. Визу- альный осмотр поверхностей сбора на уровнях, собирающих наибольшее количество капель, может выявить полосы, если произошла пере- грузка. Данное явление может быть связано и с увеличением массы действующего вещества, собранного на последнем уровне и резервном фильтре. Наиболее эффективным способом из- бежать перегрузки для любой системы является уменьшение времени распыления испытуемого образца (Т0) путем уравновешивания перегрузки и аналитической чувствительности. Обратный захват. Отскок и обратный за- хват капель в систему является маловероятным для капель, образующихся в небулайзере в отли- чие от твердых частиц в ингаляторе. Вследствие этого допускается не закрывать импактор. МЕТОДИКА Собранный импактор и индукционный порт предварительно охлаждают в холодильнике (при температуре около 5 °C) в течение 90 мин и начинают испытание в течение 5 мин после из- влечения импактора из холодильника. Допускает- ся применение других методик для поддержания постоянной температуры импактора (например, холодильный шкаф или холодовая комната) после их валидации. Небулайзер соединяют с регуля- тором подачи газа (обычно воздух или кислород) или используют компрессор при давлении и ско- рости потока, указанных производителем устрой- ства. Принимают меры предосторожности для обеспечения того, чтобы линия подачи газа не от- соединялась от небулайзера под давлением. В не- булайзерпомещаютлекарственныйпрепаратвнеоб- ходимом количестве в соответствии с инструкцией по применению. Импактор достают из холодиль- ника, присоединяют к нему индукционный порт, подключают к выходному отверстию импактора или наружного фильтра источник вакуума, спо- собный откачивать воздух из системы со скоро- стью 15 л/мин, как указано на рисунке 2.1.9.31.- 2. Пропускают поток через импактор. К порту Рисунок 2.1.9.31.-2. – Схема использования импактора нового поколения для определения размера частиц лекарственных препаратов для распыления A – небулайзер (распылитель); Б – порт индукции; В – импактор нового поколения; Г – контрольный клапан; Д – источник вакуума 69 индукции подсоединяют измеритель потока, откалиброванный для измерения выходящего по- тока. Регулируют контрольный клапан, располо- женный между импактором и источником вакуу- ма, для обеспечения постоянного потока через систему со скоростью 15 л/мин (± 5 %). Отсоеди- няют измеритель потока. Удостоверяются, что не- булайзер располагается в таком же положении, что и при использовании его пациентом. Затем присо- единяют мундштук небулайзера к индукционно- му порту, используя при необходимости адаптер мундштука для обеспечения герметичности сое- динения. Включают подачу газа или компрессор небулайзера и производят отбор проб в течение предварительно установленного времени (T0). Зна- чение T0 должно использоваться в аналитической методике на данный лекарственный препарат для сопоставимости показателей массы фракций.
По- сле отбора проб выключают подачу газа или ком- прессор, отсоединяют небулайзер от индукцион- ного порта и отключают источник вакуума. Отсоединяют импактор и с помощью под- ходящего метода анализа определяют массу действующего вещества, собранного в индук- ционном порте, на каждом из уровней и ре- зервном/наружном фильтре в соответствии с описанием импактора нового поколения. Массу действующего вещества, собранную в коллекторе с микроотверстиями, суммируют с массой, со- бранной на резервном/наружном фильтре, и да- лее обрабатывают как единый образец для по- следующих расчетов. Массовую долю фракции (Fm) действующего вещества, собранного на каждой составной части импактора, начиная с индукционного порта и других расположенных в нем по порядку элементов, рассчитывают по формуле: Fm = m M где: m — масса действующего вещества, собранная на каждой составной части импактора; М — общая масса действующего вещества, собранная в системе. Величину Fm представляют в виде диаграм- мы ее значений, соответствующих составным частям измерительного оборудования, начиная от индукционного порта и заканчивая резерв- ным фильтром импактора (рисунок 2.1.9.31.-3). Рисунок 2.1.9.31.-3. – Диаграмма распределения значений массовой доли капель, соответствующих составным частям импактора 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Fm 70 При необходимости допускается объединение значений Fm соседних уровней импактора для представления массовой доли фракции дей- ствующего вещества, собранного на нескольких уровнях, в виде одного значения. Определяют кумулятивное средневзвешен- ное распределение частиц аэрозоля по массе, фракционированных в соответствии с разме- ром с помощью импактора нового поколения. Начиная с фильтра распределяют кумулятив- ную массу фракции действующего вещества в зависимости от эффективного предельного диа- метра частиц фракции соответствующего уров- ня (таблица 2.1.9.31.-2 подходящих диаметров частиц фракции при скорости потока 15 л/мин). Строят график зависимости кумулятивной фракции действующего вещества от эффектив- ного предельного диаметра частиц фракции в подходящем формате, например, логарифми- ческом или пробит-анализа. При необходимости с помощью интерполяции определяют значения массовой доли фракции с диаметром частиц ниже указанного в таблице 2.1.9.31.-2 значения или фракцию с размером частиц между верхним и нижним пределами.При необходимости опре- деляют значения медианной массы аэродинами- ческого диаметра и геометрического стандарт- ного отклонения, если приемлемо. Таблица 2.1.9.31.-2. – Диаметры частиц фракции импактора нового поколения при скорости потока 15 л/мин Уровень Диаметр частиц фракции (мкм) 1 14,1 2 8,61 3 5,39 4 3,30 5 2,08 6 1,36 7 0,98 71 2.1.11. АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 201110001-2023 2.1.11.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕИНА С ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведены примеры методик количественного определения протеина С человека (протеин C) хромогенным методом в конечной точке (метод 1) и клоттинго- вым методом (метод 2). МЕТОД 1. ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД Протеин С представляет собой витамин K-зависимый плазменный белок, который по- сле активации (активированный протеин С (activated protein C, APC)) подавляет свертыва- ние крови путем протеолитического расщепле- ния факторов Va и VIIIa.
Активность протеина С определяют с помощью двухстадийного метода: – на первой стадии протеин С в образце ак- тивируют специфическим активатором, выде- ленным из яда змеи; – на второй стадии активированный протеин С расщепляет специфический хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта (хромофо- ра), который может быть количественно определен методом спектрофотометрии. Стадия 1 Стадия 2 Количественное определение протеина С основано на его способности расщеплять хро- могенный субстрат с образованием окрашен- ного продукта и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Для количественного определения про- теина С применяют как метод определения в ко- нечной точке, так и кинетический метод. Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придержи- ваться инструкции производителя набора. РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с рH 8,4. Растворяют 6,055 г трис(гидроксиметил)амино- метана Р и 16,84 г цезия хлорида Р в воде Р, при необходимости корректируют pH раствора (2.1.2.3) и доводят водой Р до объема 1000,0 мл. Активатор протеина С. Белок, специфично активирующий протеин С, выделяют из яда гадю- ки Agkistrodon contortrix contortrix. Восстанавли- вают и хранят в соответствии с инструкцией про- изводителя. Перед использованием в испытании разводят водой Р до концентрации 0,25 ЕД/мл. Хромогенный субстрат для активирован- ного протеина С. Специфический хромоген- ный субстрат для APC, например, L-пироглу- тамил-L-пролил-L-аргинин-паранитроанилина гидрохлорид (пироGlu-Pro-Arg-pNA·HCl), рас- творяют в воде Р и доводят водой Р до получения концентрации 4,5 ммоль/л. Перед использовани- ем разводят буферным раствором для разведе- ния с pH 8,4 до концентрации 1,1 ммоль/л. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят с использовани- ем воды Р не менее трех отдельных разведений до концентраций в диапазоне 0,050 – 0,200 МЕ/мл в двух повторностях. Аналогичным образом го- товят разведения восстановленного стандартно- го образца. 72 Стадия 1. Смешивают по 0,025 мл каждо- го разведения с 0,050 мл активатора протеи- на С, предварительно нагретых до температуры 37 °C, и инкубируют при той же температуре точно 10 мин. Для каждого разведения прово- дят контрольный опыт, используя воду Р вместо активатора протеина С. Стадия 2. К каждой смеси прибавляют по 0,150 мл разбавленного хромогенного суб- страта, предварительно нагретого до темпера- туры 37 °C, и инкубируют при той же темпера- туре точно 10 мин. При необходимости время инкубации должно быть скорректировано таким образом, чтобы получить линейную зависи- мость образования хромофора от времени. Оста- навливают реакцию добавлением 0,050 мл 50 % (об/об) раствора уксусной кислоты ледяной Р. При расщеплении хромогенного субстра- та под действием APC образуется окрашенный продукт в количестве, пропорциональном кон- центрации протеина С в образце. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм (2.1.2.24). Значение оптической плотности кон- трольного опыта вычитают из значения оптиче- ской плотности испытуемого образца.
Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина С в испытуемом образце с использованием об- щепринятых статистических методов (2.3.12.0). МЕТОД 2. КЛОТТИНГОВЫЙ МЕТОД Активность протеина С устанавливают после расщепления его до APC специфиче- ским активатором, выделенным из яда гадюки Agkistrodon contortrix contortrix. Полученный APC инактивирует факторы Va и VIIIa и таким образом удлиняет активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) системы, в которой присутствуют все факторы свер- тывания на постоянном избыточном уровне, за исключением протеина С, поступающего в систему с добавляемым образцом. Увеличение времени свертывания пропорционально концен- трации протеина С в образце. Количественное определение протеина С, основано на его способности увеличивать вре- мя свертывания и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придержи- ваться инструкции производителя набора. РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с pH 7,4. Изотонический буферный раствор, не содержа- щий хелатирующих соединений. Плазма крови человека, дефицитная по про- теину С. Цитратная плазма крови человека, содержащая протеин С ниже определяемого уров- ня. Восстанавливают и хранят в соответствии с инструкцией производителя. Активатор протеина С. Белок, специфич- но активирующий протеин С, выделяют из яда гадюки Agkistrodon contortrix contortrix. Восста- навливают и хранят в соответствии с инструкци- ей производителя. Активатор свертывания. Используют подходящий реактив для АЧТВ, содержащий фосфолипиды и контактный активатор. Акти- ватор свертывания может быть комбинирован с активатором протеина С. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят с использовани- ем воды Р не менее трех отдельных разведенийдо концентраций в диапазоне 0,010 – 0,150 МЕ/мл в двух повторностях с использованием бу- ферного раствора для разведения с pH 7,4. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца. Смешивают один объем каждого раз- ведения с одним объемом плазмы кро- ви человека, дефицитной по протеину С, и одним объемом активатора протеина С (объ- единенного с реагентом для АЧТВ). Все рас- творы должны быть предварительно нагреты до температуры 37 °C. Прибавляют один объ- ем раствора 3,7 г/л кальция хлорида Р, пред- варительно нагретого до температуры 37 °C, и регистрируют время свертывания. 73 Время свертывания пропорционально концен- трации протеина С в каждом разведении. Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность проте- ина С в испытуемом образце с использованием общепринятых статистических методов (2.3.12.0). 201110002-2023 2.1.11.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕИНА S ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведен пример методики количественного определения протеина S человека (протеин S) клоттинговым методом. Протеин S представляет собой витамин K-зависимый белок плазмы, который действу- ет как кофактор активированного протеина С человека (активированный протеин С (activated protein C, APC)).
Активность протеина S может быть определена по реакции свертывания кро- ви, которая чувствительна к способности про- теина S ускорять инактивацию фактора свер- тывания крови человека Va (фактор Va) под действием APC. Испытание заключается в при- бавлении протеина S к смеси реактивов, содер- жащей APC, фактор Va и плазму крови чело- века, дефицитную по протеину S. Увеличение времени свертывания пропорционально кон- центрации протеина S в образце. Методики, в которых APC добавляется непосредственно как реактив, более предпочтительны по срав- нению с теми, в которых APC генерируется во время проведения испытания путем добавле- ния специфического активатора протеина С, выделенного из яда змеи. Активация сверты- вания инициируется добавлением активирую- щего реактива, такого как тромбопластин или активированный фактор свертывания крови человека X (фактор Ха), вместе с фосфолипи- дами и кальция хлоридом. Во время испытания фактор Va генерируется из фактора V в плазме крови человека, дефицитной по протеину S, с последующей активацией свертывания. Про- цедура испытания должна обеспечивать, чтобы единственным фактором, ограничивающим ре- акцию свертывания, являлся протеин S. Количественное определение протеина S основано на его способности увеличивать вре- мя свертывания, и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина S, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина S человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Методики и реактивы могут отличать- ся в разных наборах, поэтому следует придер- живаться инструкции производителя набора. КЛОТТИНГОВЫЙ МЕТОД РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с рH 7,4. Изотонический буфер, не содержащий хелатиру- ющих соединений, приготовленный следующим образом: растворяют 6,08 г трис(гидроксиме- тил)аминометана Р и 8,77 г натрия хлорида Р в воде Р и при необходимости корректируют pH раствора (2.1.2.3); далее прибавляют 10 г альбумина бычьего Р или альбумина человека Р и доводят водой Р до объема 1000,0 мл. Плазма крови человека, дефицитная по протеину S. Цитратная плазма крови человека с содержанием протеина S ниже определяемо- го уровня и, предпочтительно, не содержащая C4b-связывающего белка. Активатор коагуляции. Реактив применя- ют для инициации свертывания плазмы крови человека, дефицитной по протеину S, а также для обеспечения образования фактора Vа. Акти- ватор может состоять из тканевого фактора, фак- тора Xа или агента, способного прямо активиро- вать фактор X. Такой агент может быть выделен из яда гадюки Рассела (Vipera russelli). Реактив также содержит APC, фосфолипиды и каль- ция хлорид Р, или кальция хлорид может быть добавлен отдельно после определенного перио- да активации. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят не менее трех отдельных разведений до получения концен- траций в диапазоне 0,020 – 0,100 МЕ/мл в двух 74 повторностях с использованием буферного рас- твора для разведения с рН 7,4. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца. Смешивают по одному объему каждого раз- ведения с одним объемом плазмы крови чело- века, дефицитной по протеину S. Все растворы должны быть предварительно нагреты до темпе- ратуры 37 °C.
Прибавляют два объема активато- ра коагуляции, нагретого до температуры 37 °C, и регистрируют время свертывания. Альтернативная процедура может предусма- тривать использование активатора коагуляции без кальция хлорида и требовать точного изме- рения периода активации перед добавлением кальция хлорида и регистрации времени свер- тывания. Время свертывания пропорционально кон- центрации протеина S в каждом разведении. Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина S в испытуемом образце с использованием об- щепринятых статистических методов (2.3.12.0). 201110003-2023 2.1.11.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРА α-1-ПРОТЕИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведена методика количественного определения инги- битора α-1-протеиназы человека (ингибитор α-1-протеиназы), известного также как α-1-анти- трипсин или α-1-антипротеиназа, хромогенным методом. Методика основана на сравнении испытуемо- го образца со стандартным образцом ингибитора α-1-протеиназы человека, калиброванного в мил- лиграммах активного (функционального) инги- битора α-1-протеиназы, по способности инакти- вировать сериновую протеазу – эластазу (свиную панкреатическуюэластазуилиэластазунейтрофилов человека). Различные количества образца, смешива- ют с заданным количеством эластазы, остаточную активность эластазы измеряют с использованием подходящего хромогенного субстрата. ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД РЕАКТИВЫ Трис-альбуминовый буферный раствор. Растворяют 24,23 г трис(гидроксиметил)ами- нометана Р в воде Р, доводят рН раствора до значения 8,0 ± 0,3 (2.1.2.3), используя хлоро- водородную кислоту Р1, и доводят водой Р до объема 1000 мл. К 100 мл полученного рас- твора прибавляют 0,5 мл 20 % раствора альбу- мина человека Р или альбумина бычьего Р. Буферный раствор, содержащий альбумин человека или альбумин бычий, должен быть приготовлен в день его использования; в про- тивном случае, раствор стерилизуют фильтра- цией (0,2 мкм) и хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение двух недель. МЕТОДИКА Готовят в двух повторностях четыре или пять разведений испытуемого образца и стан- дартного образца в подходящем диапазоне кон- центраций ингибитора α-1-протеиназы, исполь- зуя трис-альбуминовый буферный раствор. В лунки микропланшета помещают по 50 мкл разведений стандартного образца или разведений испытуемого образца, затем в ка- ждую лунку прибавляют по 150 мкл раствора свиной панкреатической эластазы (эластаза), разведенной до необходимой концентрации трис-альбуминовым буферным раствором. Ин- кубируют в течение определенного промежутка времени (3 – 10 мин) при температуре от 15 °C до 25 °C. Поскольку активность различных элас- таз может варьировать, для получения подходя- щих изменений оптической плотности при дли- не волны 405 нм в данных конкретных условиях проведения испытания, концентрация эластазы может быть уточнена путем оценки активности в контрольных лунках, содержащих эластазу без ингибитора α-1-протеиназы. В каждую лунку прибавляют по 100 мкл ра- бочего раствора хромогенного субстрата N-сук- цинил-три-L-аланил-4-п-нитроанилида (Suc-Ala- Ala-Ala-pNA) (раствор 4,5 мг/мл хромогенного субстрата в диметилсульфоксиде Р, разведен- ный трис-альбуминовым буферным раствором до рабочей концентрации 0,45 мг/мл). Измерение оптической плотности (2.1.2.24) начинают сразу 75 же и проводят в течение 5 мин и более при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр ми- кропланшетный. Рассчитывают скорость измене- ния оптической плотности (ΔА/мин).
В качестве альтернативы можно использо- вать метод определения в конечной точке, оста- навливая реакцию уксусной кислотой и измеряя оптическую плотность при длине волны 405 нм. Если испытание выполняют в пробирках и для измерения оптической плотности используют спектрофотометр, пропорционально изменяют объемы растворов реактивов. Скорость изменения оптической плотности (ΔА/мин) обратно пропорциональна активности ингибитора α-1-протеиназы. Проверяют достоверность результатов ис- пытания и рассчитывают активность ингиби- тора α-1-протеиназы в испытуемом образце общепринятыми статистическими методами (2.3.12.0). 201110004-2023 2.1.11.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИ-D ЧЕЛОВЕКА Общая фармакопейная статья распростра- няется на методы количественного определения иммуноглобулина анти-D человека (иммуногло- булина анти-D) в лекарственных препаратах им- муноглобулинов человека. МЕТОД 1 Активность иммуноглобулина анти-D определяют путем сравнения количества ис- пытуемого образца, необходимого для аг- глютинации D-положительных эритроцитов, с необходимым для получения такого же эф- фекта количеством стандартного образца, активность которого выражена в международ- ных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобули- на анти-D, устанавливаемую Всемирной орга- низацией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Используют пулы D-положительных эри- троцитов не менее чем от четырех доноров с группой крови 0R1R1, собранные не ранее чем за семь суток до испытания и хранившиеся соответствующим образом. К подходящему объему клеток, предварительно трижды про- мытых раствором 9 г/л натрия хлорида Р, прибавляют равный объем раствора броме- лайнов Р, выдерживают при температуре 37 °С в течение 10 мин. Далее центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость, промыва- ют трижды раствором 9 г/л натрия хлорида Р. Суспендируют 20 объемов эритроцитов в смеси из 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора 300 г/л альбумина бычьего Р и 45 объ- емов раствора 9 г/л натрия хлорида Р. Полу- ченную суспензию охлаждают на ледяной бане при постоянном перемешивании. Готовят подходящие разведения испытуемо- го образца и стандартного образца (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D челове- ка), используя в качестве разбавителя раствор, содержащий 5 г/л альбумина бычьего Р и 9 г/л натрия хлорида Р. Определение обычно проводят по изложен- ной ниже методике, используя соответствую- щий прибор для непрерывного автоматического анализа. МЕТОДИКА Температуру в трубках, за исключением ин- кубационных петель, поддерживают на уровне 15,0 °С. В трубки аппарата, используя насос, подают суспензию эритроцитов со скоростью 0,1 мл/мин и раствор 3 г/л метилцеллюлозы 450 Р со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 мин со скоростью 0,1 мл/мин вводят растворы испы- туемого и стандартного образцов в соответству- ющих разведениях. Перед введением каждого следующего раствора в течение 4 мин вводят разбавитель со скоростью 0,1 мл/мин. Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инку- бируют при температуре 37 °С в течение 18 мин, после чего разбивают скопления эритроцитов пу- тем введения со скоростью 1,6 мл/мин раствора 9 г/л натрия хлорида Р, содержащего для предот- вращения разрушения агрегированных эритроци- тов подходящий смачивающий агент (например, по- лисорбат 20 Р до получения концентрации 0,2 г/л). 76 После оседания агглютинатов образовавшуюся су- спензию дважды декантируют: вначале – со скоро- стью 0,4 мл/мин, затем – со скоростью 0,6 мл/мин.
Не подвергшиеся агглютинации эритроциты лизируют раствором, содержащим 5 г/л окток- синола 10 Р, 0,2 г/л калия феррицианида Р, 1 г/л натрия гидрокарбоната Р и 0,05 г/л калия ци- анида Р, подаваемым со скоростью 2,5 мл/мин. В течении десяти минут обеспечивают условия, необходимые для выхода гемоглобина. Оптиче- скую плотность (2.1.2.24) гемолизата регистри- руют непрерывно при длине волны от 540 нм до 550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, в котором наблюдается линейная за- висимость между концентрацией и получен- ным изменением оптической плотности (ΔА). Исходя из полученных результатов, строят кали- бровочную кривую, линейный участок которой используют для расчета активности испытуемого образца. Активность испытуемого образца рассчиты- вают с использованием общепринятых стати- стических методов (2.3.12.0). МЕТОД 2 Активность иммуноглобулина анти-D опре- деляют методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, проводимого на ти- трационных микропланшетах, покрытых эритро- цитами человека. Метод основан на конкурентном связывании поликлональным иммуноглобулином анти-D и биотинилированными моноклональны- ми анти-D антителами, специфичными в отноше- нии эпитопа D антигена, с эритроцитами человека. Активность испытуемого образца сравнивают со стандартным образцом, активность которого вы- ражена в международных единицах. За международную единицу принимают ак- тивность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобулина анти-D, устанавливаемую Всемирной организа- цией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Реактивы, при отсутствии особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хло- рида Р, 0,76 г динатрия гидрофосфата безвод- ного Р, 0,2 г калия хлорида Р, 0,2 г калия диги- дрофосфата Р и 0,2 г натрия азида Р и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем. Трис-солевой буферный раствор (ТСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хлорида Р и 0,6 г трис(гидроксиметил)аминометана Р, кор- ректируют рН (2.1.2.3) раствором 103 г/л хлоро- водородной кислоты Р до значения 7,2 и дово- дят водой Р до объема 1000 мл. Раствор папаина. При температуре 37 °С перемешивают в течение 30 мин 1 г папаина Р в 10 мл 0,067 М фосфатного буферного рас- твора с рН 5,4 Р, центрифугируют при 10 000 g в течение 5 мин и фильтруют полученный рас- твор через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл филь- трата, 1 мл раствора 48,44 г/л L-цистеина Р и 1 мл раствора 3,72 г/л натрия эдетата Р и до- водят 0,067 М фосфатным буферным раство- ром с рН 5,4 Р до объема 10 мл. Аликвоты за- мораживают при температуре −20 °С или ниже. Эритроциты. Пул D-положительных эри- троцитов получают не менее чем от трех доно- ров с группой крови 0R2R2. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 мин, надосадочную жидкость уда- ляют, подходящий объем осадка эритроцитов нагревают и смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (на- пример, в объемном соотношении 2:1) и инку- бируют при температуре 37 °С в течение 10 мин. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Хранят при температуре 4 °C с подходящим стабилиза- тором не более недели. Биотинилированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкцией производителя. Авидин, конъюгированный со щелочной фос- фатазой, или стрептавидин, конъюгированный со щелочной фосфатазой. Предпочтительно ис- пользовать модифицированный реактив, соче- тающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания.
Используют в соответствии с инструкциями производителя. Раствор субстрата. Используют пара-ни- трофенилфосфат в соответствии с инструкцией производителя. Буферный раствор для фиксации клеток. Растворяют в воде Р 18,02 г глюкозы Р, 4,09 г натрия хлорида Р, 1,24 г борной кислоты Р, 10,29 г натрия цитрата Р и 0,74 г натрия эде- тата Р. Корректируют рН (2.1.2.3) до значения 7,2 – 7,3, используя раствор 40 г/л натрия ги- дроксида Р или раствор 103 г/л хлороводород- 77 ной кислоты Р, и доводят водой Р до объема 1000 мл. Хранят при температуре 4 °С и ис- пользуют холодным. Раствор глутарового альдегида. Непосред- ственно перед применением 750 мкл раствора 250 г/л глутарового альдегида Р прибавляют к 50 мл холодного ФСБ. Титрационные микропланшеты. Плоско- донные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуно- ферментного анализа, с высокой связывающей способностью по отношению к белкам исполь- зуют для покрытия эритроцитами. Планшеты из полистирола или поливинилхлорида с кру- глой или конусообразной формами лунок ис- пользуют для приготовления разведений раство- ров иммуноглобулина. МЕТОДИКА Готовят 0,1 % (об/об) суспензию обработан- ных папаином эритроцитов в холодном буфер- ном растворе для фиксации клеток. В каждую лунку плоскодонного титрационного микро- планшета помещают по 50 мкл суспензии. Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 мин предпочтительно при темпера- туре 4 °С. Не удаляя надосадочную жидкость, к содержимому каждой из лунок осторожно прибавляют по 100 мкл раствора глутарово- го альдегида и выдерживают 10 мин. Содер- жимое лунок сливают путем быстрого пере- ворачивания планшета и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ФСБ. Эту про- цедуру производят вручную или с использо- ванием автоматического устройства для про- мывания планшетов. После удаления ФСБ планшет используют в испытании или хранят при температуре 4 °С не более 1 месяца по- сле прибавления в каждую лунку по 100 мкл буферного раствора для фиксации клеток и за- печатывания полимерной пленкой. Испытуемые растворы. В случае лиофиль- но высушенных лекарственных препаратов их восстанавливают в соответствии с инструкцией по медицинскому применению. Готовят пять по- следовательных двукратных разведений, начи- ная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р в четырех повторностях. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости «доза – ответ». Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС им- муноглобулина анти-D человека) в соответствии с указаниями производителя. Готовят пять по- следовательных двукратных разведений, начи- ная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р, в четырех повторностях. В каждую серию лунок титрационного ми- кропланшета с круглой или конусообразной формами лунок вносят по 35 мкл соответствую- щего разведения испытуемого раствора или рас- твора сравнения. К содержимому каждой лун- ки прибавляют по 35 мкл биотинилированного Brad-5 в концентрации 250 нг/мл. Осушают лунки планшета, покрытого эри- троцитами, путем переворачивания и высу- шивания бумажным полотенцем. Прибавляют в каждую лунку по 250 мкл ФСБ, содержащего 20 г/л альбумина бычьего Р, и выдерживают при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 30 мин.
Осушают лунки планшета, покрытого эри- троцитами, путем переворачивания и высуши- вания бумажным полотенцем, и помещают в ка- ждую серию лунок по 50 мкл соответствующего испытуемого раствора или раствора сравнения, содержащих биотинилированный Brad-5. В качестве отрицательного контроля исполь- зуют 50 мкл ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р. Планшет запечатывают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °C до 25 °C в течение 1 ч. Удаляют жидкость из лунок планшета, по- крытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ТСБ. В каждую лунку прибавляют по 50 мкл авиди- на, конъюгированного со щелочной фосфатазой, или стрептавидина, конъюгированного со щелоч- ной фосфатазой, разбавленного ТСБ, содержащим 10 г/л альбумина бычьего Р. Инкубируют в тече- ние 30 мин при температуре от 15 °С до 25 °С. Удаляют жидкость из лунок планшета, по- крытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ТСБ. В каждую лунку прибавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в темноте при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 10 мин. Для остановки реакции в каждую лун- ку прибавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида Р. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. Для построения кри- вой из значений, полученных для испытуемых и 78 стандартных растворов, вычитают значение, по- лученное для отрицательного контроля. Значе- ния оптической плотности в линейной области калибровочной кривой используют для расчета активности испытуемого образца с использова- нием общепринятых статистических методов (2.3.12.0). МЕТОД 3 Активность анти-D иммуноглобулина че- ловека определяют методом проточной ци- тометрии. Метод основан на специфиче- ском связывании иммуноглобулина анти-D с D-положительными эритроцитами. Актив- ность испытуемого образца сравнивают со стан- дартным образцом, активность которого выра- жена в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобули- на анти-D, устанавливаемую Всемирной орга- низацией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Реактивы, при отсутствии особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хлорида Р, 0,76 г динатрия гидрофосфата безводного Р, 0,2 г калия хлорида Р, 0,2 г калия дигидрофосфа- та Р и 0,2 г натрия азида Р и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем. Раствор ФСБ-БСА (ФСБ-БСА). ФСБ, содер- жащий 10,0 г/л альбумина бычьего Р. Эритроциты. Пул D-положительных эри- троцитов получают от доноров с группой крови 0R1R1 не ранее, чем за две недели до испытания. При необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при температуре 4 °С. Клетки промывают не менее двух раз ФСБ-БСА и го- товят суспензию, содержащую от 1·104 клеток в микролитре до 5·104 клеток в микролитре, с использованием ФСБ-БСА. Пул D-отрицательных эритроцитов получа- ют от доноров с группой крови 0rr и подготавли- вают аналогичным образом. Вторичные антитела. Подходящий фраг- мент анти-IgG-антитела, связанный с флуо- ресцентным красителем, обладающий специ- фичностью в отношении IgG человека или его фрагментов. Хранят и используют в соответ- ствии с инструкцией производителя. Титрационные микропланшеты. Плоско- донные планшеты для иммуноферментного ана- лиза без поверхностной обработки. МЕТОДИКА Испытуемые растворы. Лиофильно высу- шенные лекарственные препараты восстанав- ливают в соответствии с инструкцией по меди- цинскому применению.
Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 – 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимости исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область гра- фика зависимости «доза – ответ». Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D человека) в соответ- ствии с указаниями производителя. Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведе- ний, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 – 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимо- сти исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости «доза – ответ». В каждую лунку титрационного микро- планшета вносят по 50 мкл D-положительных эритроцитов. К содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл соответствую- щего разведения испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрица- тельного контроля в серию соответствую- щих лунок прибавляют по 50 мкл ФСБ-БСА. Для контроля неспецифического связывания вносят по 50 мкл D-отрицательных эритро- цитов в свободные лунки того же микроплан- шета и к содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл наименьшего разведе- ния испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрицательного контроля в серию соответствующих лунок, содержащих по 50 мкл D-отрицательных эритроцитов, вносят по 50 мкл ФСБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при температуре 37 °С в течение 40 мин. Планшет центрифугируют при 50 g в те- чение трех минут, удаляют надосадочную 79 жидкость и промывают лунки 200 – 250 мкл ФСБ-БСА. Планшеты промывают не менее двух раз. Планшеты центрифугируют при 50 g в течение трех минут, удаляют надосадочную жидкость и прибавляют по 50 мкл раствора вто- ричного антитела, полученного разведением с помощью ФСБ-БСА до подходящей концен- трации (рабочий титр вторичных антител зара- нее устанавливают опытным путем). Запечаты- вают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °С до 25 °С в защищенном от света месте в течение 20 мин. По окончании инкубации с вторичными ан- тителами планшет отмывают не менее двух раз путем центрифугирования при 50 g в течение трех минут с 200 – 250 мкл ФСБ. Удаляют надо- садочную жидкость и ресуспендируют эритро- циты в 200 – 250 мкл ФСБ. Суспензию клеток переносят в подходящие пробирки, совместимые с моделью проточно- го цитофлуориметра. При необходимости, для обеспечения подходящей скорости потока объ- ем полученных образцов доводят ФСБ до опти- мального значения. Накопление данных производят не позд- нее 20 мин от окончания пробоподготовки. Для статистического анализа накапливают не менее 10 000 событий без выхода за пределы установленного порогового значения како- го-либо параметра с исключением нецелевых (дебрисных) включений (в том числе мерт- вых клеток). Учитывают медианную интен- сивность флуоресценции и процент положи- тельных клеток. С использованием значения медианной интенсивности флуоресценции в линейной области кривой зависимости «доза – ответ» рассчитывают активность испытуемого образца общепринятыми статистическими ме- тодами (2.3.12.0). 201110006-2023 2.1.11.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ Fс-ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА В общей фармакопейной статье описаны методики определения функционального состо- яния Fс-фрагмента иммуноглобулина методом комплемент-зависимого гемолиза.
Методика 2 является адаптацией методики 1 для микропланшетов при измерении компле- мент-зависимого гемолиза. В статье указаны различия при проведении испытаний методикой 1 и методикой 2. МЕТОД КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМОГО ГЕМОЛИЗА РЕАКТИВЫ Стабилизированная кровь человека. Кровь доноров с группой крови O(I) собирают в кон- тейнеры с антикоагулянтом. Стабилизирован- ную кровь хранят при температуре 4 °C не более 3 недель. Фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,2. Растворяют 1,022 г динатрия гидро- фосфата безводного Р, 0,336 г натрия дигидро- фосфата безводного Р и 8,766 г натрия хлорида Р в 800 мл воды Р и доводят до объема 1000 мл тем же растворителем. Основной раствор магния и кальция. Раство- ряют 1,103 г кальция хлорида Р и 5,083 г магния хлорида Р в воде Р и доводят до объема 25 мл тем же растворителем. Основной раствор барбиталового буфера. Растворяют 207,5 г натрия хлорида Р и 25,48 г барбитала натрия Р в 4000 мл воды Р и до- водят рН раствора до значения 7,3, используя раствор 103 г/л хлороводородной кислоты Р. Прибавляют 12,5 мл основного раствора магния и кальция и доводят водой Р до объема 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при температуре 4 °C в прозрачных емкостях. Альбумин-барбиталовый буферный рас- твор. Растворяют 0,150 г альбумина бычьего Р в 20 мл основного раствора барбиталового буфе- ра и доводят водой Р до объема 100 мл. Готовят непосредственно перед использованием. Раствор таниновой кислоты. Растворяют 10 мг таниновой кислоты Р в 100 мл фосфат- но-солевого буферного раствора с рН 7,2. Гото- вят непосредственно перед использованием. Комплемент морской свинки. Готовят пул сыворотки из крови не менее чем 10 мор- ских свинок. Сыворотку отделяют центри- фугированием при температуре около 4 °C и хранят в небольших количествах при темпера- туре ниже −70 °C. Непосредственно перед нача- лом комплемент-зависимого гемолиза разводят 80 альбумин-барбиталовым буферным раствором до 125 – 200 СН50 /мл и хранят в ледяной бане во время испытания (CH50 (гемолитическая еди- ница активности комплемента) – концентрация комплемента в контрольной сыворотке, вызыва- ющая в данных условиях испытания лизис 50 % эритроцитов). Антиген краснухи. Для определения титра ингибирования гемагглютинации в испытании может быть использован антиген краснухи, титр которого должен быть менее 1:256 гемагглюти- нирующих единиц. ОБРАБОТКА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ТАНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ Эритроциты отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной крови человека. Промывают клетки не менее трех раз фосфатно-солевым буферным раство- ром с рН 7,2 и ресуспендируют в этом же рас- творе до получения концентрации 2 % (об/об). К 14,8 мл фосфатно-солевого буферного рас- твора с рН 7,2 прибавляют 0,2 мл раствора таниновой кислоты и смешивают один объем полученного свежеприготовленного раствора с одним объемом суспензии эритроцитов челове- ка. Инкубируют при температуре 37 °C в течение 10 мин. Клетки отделяют центрифугированием (800 g в течение 10 мин), надосадочную жид- кость удаляют, а клетки однократно промыва- ют фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2. Обработанные таниновой кислотой эритроциты ресуспендируют в фосфатно-соле- вом буферном растворе с рН 7,2 до получения концентрации 1 % (об/об). ФИКСАЦИЯ АНТИГЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ, ОБРАБОТАННЫХ ТАНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ К подходящему объему (Vs) суспен- зии эритроцитов, обработанных танино- вой кислотой, прибавляют антиген краснухи (0,2 мл на 1,0 мл суспензии клеток) и инкуби- руют при температуре 37 °C в течение 30 мин.
Клетки отделяют центрифугированием (800 g в течение 10 мин) и удаляют надосадочную жидкость. Прибавляют альбумин-барбита- ловый буферный раствор в объеме, равном объему удаленной надосадочной жидкости, клетки ресуспендируют, отделяют, как описа- но выше, и повторяют операцию промывки. Клетки ресуспендируют с помощью аль- бумин-барбиталового буферного раствора, используя объем, эквивалентный ¾ Vs, получая таким образом начальный объем (раствор Vi). Смешивают 900 мкл альбумин-барбитало- вого буферного раствора с 100 мкл раствора Vi, получая таким образом объем (Vr), и определяют исходную оптическую плотность при длине вол- ны 541 нм (А). Разводят Vr с коэффициентом раз- ведения, равным А, с помощью альбумин-бар- биталового буферного раствора, получая таким образом конечный скорректированный объем сенсибилизированных человеческих эритроци- тов (Vf = Vr · A) и доводя значение А до 1,0 ± 0,1 для десятикратного разведения. СВЯЗЫВАНИЕ АНТИТЕЛАМИ СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ Готовят последовательно в двух повторно- стях нижеперечисленные растворы, используя для каждого из них отдельную одноразовую кю- вету или пробирку. Испытуемые растворы. При необходимости доводят значение рН испытуемого раствора им- муноглобулина до 7,0. При выполнении методики 1 объемы ис- пытуемого образца разводят альбумин-барби- таловым буферным раствором таким образом, чтобы в 900 мкл раствора содержалось от 30 мг до 40 мг иммуноглобулина. При выполнении методики 2 объемы испы- туемого образца разводят альбумин-барбитало- вым буферным таким образом, чтобы в 1200 мкл раствора содержалось от 15 мг до 30 мг иммуно- глобулина. Растворы сравнения. Готовят так же, как и испытуемые растворы с использованием СО ФЕАЭС иммуноглобулина человека для оцен- ки функционального состояния Fc-фрагмента. Контроль комплемента. Альбумин-барбита- ловый буферный раствор используют в таком же объеме, что и испытуемый раствор. При выполнении методики 1 к содержимо- му каждой кюветы или пробирки прибавляют по 100 мкл сенсибилизированных эритроцитов че- ловека и хорошо перемешивают. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, прибав- ляют 1000 мкл альбумин-барбиталового буферно- го раствора, отделяют клетки центрифугировани- ем (1000 g в течение 10 мин) и удаляют 1900 мкл надосадочной жидкости. Прибавляют 1900 мкл 81 альбумин-барбиталового буферного раствора и повторяют операцию промывки, оставляя объем 200 мкл. Полученные образцы могут храниться в герметично укупоренных кюветах (пробирках) при температуре 4 °C не более 24 ч. При выполнении методики 2 к содержимо- му каждой кюветы или пробирки прибавляют по 300 мкл сенсибилизированных эритроци- тов человека и хорошо перемешивают (конеч- ная концентрация иммуноглобулина в преде- лах от 10 мг/мл до 20 мг/мл). Инкубируют при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 15 мин, прибавляют 1500 мкл альбумин-барбиталового буферного раствора, отделяют клетки центрифу- гированием (1000 g в течение 10 мин) и удаляют надосадочную жидкость. Прибавляют 3000 мкл альбумин-барбиталового буферного раствора и повторяют всю операцию промывки четыре раза, оставляя объем 300 мкл. Полученные об- разцы могут храниться в герметично укупорен- ных кюветах (пробирках) при температуре 4 °C не более 24 ч. КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМЫЙ ГЕМОЛИЗ При выполнении методики 1 для измерения гемолиза к полученному образцу прибавляют 600 мкл предварительно нагретого до темпера- туры 37 °C альбумин-барбиталового буферно- го раствора, тщательно ресуспендируют клет- ки путем пипетирования (не менее пяти раз) и помещают кювету в термостатированный держатель кювет спектрофотометра.
Через 2 мин прибавляют 200 мкл разведенного компле- мента морских свинок 125 – 200 СН50/мл, дву- кратно пипетируют для перемешивания и сразу начинают регистрацию оптической плотности через установленные промежутки времени при длине волны 541 нм с использованием альбу- мин-барбиталового буферного раствора в ка- честве компенсационного раствора. Измерение прекращают при очевидном прохождении точки перегиба графика зависимости оптической плот- ности от времени. При выполнении методики 2 для измере- ния степени гемолиза к полученному образцу прибавляют 900 мкл предварительно нагретого до температуры 37 °C альбумин-барбиталово- го буферного раствора, осторожно ресуспен- дируют клетки путем пипетирования (не ме- нее пяти раз). Микропланшеты должны быть предварительно нагреты до температуры 37 °C. Переносят по 240 мкл каждой суспензии в 4 лунки микропланшета и инкубируют при температуре 37 °C в течение шести минут, осторожно встряхи- вая каждые 10 с. В каждую лунку микропланшета прибавляют по 60 мкл разведенного комплемента морских свинок 150 СН50/мл, тщательно переме- шивают в течение 10 с и начинают регистрацию оптической плотности при длине волны 541 нм при температуре 37 °C; измерение проводят каж- дые 20 с. Измерение прекращают при очевидном прохождении точки перегиба графика зависимо- сти оптической плотности от времени. ОЦЕНКА Для каждой кюветы (пробирки, лунки) определяют угол наклона (S) кривой гемолиза в области точки перегиба путем сегментации участка с наибольшим наклоном на подходя- щие временные отрезки (например, ∆t = 1 мин) и вычисляют значения S между соседними точ- ками пересечений, выраженные как изменения оптической плотности в минуту (∆А/мин). Наи- большее значение S является экспериментально установленным углом наклона кривой гемолиза (Sexp). Кроме того, определяют оптическую плот- ность в начале измерения (As) путем экстраполя- ции кривой, практически линейной и параллель- ной оси времени в течение первых нескольких минут. Корректируют значение Sexp по формуле: S' = Sexp AS Рассчитывают среднее арифметическое зна- чений ' S для каждого образца (испытуемого рас- твора и раствора сравнения). Рассчитывают индекс функционального состояния Fc-фрагмента (IFc) по формуле: IFc = 100 · S _' – S _'c S _'s – S _'c где: S _' — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для испыту- емого раствора; S _'s — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для раствора сравнения; S _'c — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для контро- ля комплемента. 82 Рассчитывают индекс функционального состояния Fc-фрагмента для испытуемого образца: значение должно быть не менее указан- ного для стандартного образца. 201110007-2023 2.1.11.7. ПОДСЧЕТ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК CD34+/CD45+ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТАХ Общая фармакопейная статья описывает методологию определения количества клеток CD34+/CD45+, содержащихся в биологических продуктах, путем проведения иммунного мече- ния и анализа методом проточной цитометрии (2.1.6.16). Под биологическими продуктами в данной общей фармакопейной статье пони- мают биологические лекарственные средства, а также исходные материалы и промежуточные продукты для их производства, содержащие гемопоэтические клетки. Определение выпол- няют на основе одноплатформенного метода с использованием калиброванных флуоросфер. При необходимости проводят предварительный лизис эритроцитов в образцах крови. Метод применим ко всем типам биологиче- ских продуктов. Особенности метода делают его наиболее подходящим для продуктов с очень низким содержанием клеток CD34+/CD45+.
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА НА ОСНОВЕ ПОДСЧЕТА КЛЕТОК CD34+/CD45+ Установлено, что 1 – 3 % клеток костного мозга, выделяющие поверхностный клеточный антиген CD34, способны к восстановлению долгосрочного многостадийного гемопоэза по- сле миелоаблативной высокодозной терапии. Клетки CD34+/CD45+ также присутствуют в незначительном количестве (от 0,01 % до 0,1 %) в периферической крови здоровых людей. Клет- ки CD34+/CD45+ в значительных количествах могут быть мобилизованы из костного мозга в периферическую кровь под действием гемопо- этических цитокинов, таких как гранулоцитар- ный колониестимулирующий фактор, и (или) химиотерапии. Метод, используемый для под- счета клеток CD34+/CD45+, должен соответ- ствовать следующим требованиям: – высокая чувствительность (в связи с ма- лым количеством гемопоэтических стволовых клеток); – точность (для обеспечения клинически значимых результатов); – воспроизводимость (для обеспечения кли- нически надежных результатов); – скорость (для обеспечения проведения ана- лиза в реальном времени). ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ В проточной цитометрии используют ком- мерчески доступные моноклональные антитела, конъюгированные с флуорофором, стандартные процедуры окрашивания и лизиса цельной кро- ви, а также применяют стратегию гейтирования с использованием светорассеяния и иммунофлуо- ресцентного анализа с применением комбина- ции пан-CD34/CD45 моноклональных антител. Жизнеспособность клеток CD34+/CD45+ можно определить с помощью соответствующего окрашивания нуклеиновых кислот красителем, не проникающим через интактную клеточную мембрану (например, 7-аминоактиномицин D). Выбор моноклональных антител Антитела к CD34. Для обнаружения всех вариантов гликозилирования молекулы (напри- мер, клон 8G12 или 581) используют антите- ла к CD34 класса III. Для обнаружения редких эффектов используют антитела, конъюгирован- ные с флуорофорами (например, фикоэритри- ном), имеющими максимальное свечение при использовании проточного цитометра с аргоно- вым лазером. Антитела к CD45. Необходимо использо- вать пан-CD45 антитела, обнаруживающие все изоформы и все гликоформы этой структуры. Обычно используют антитела к CD45, конъю- гированные с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в качестве флуорофора (например, J33, HLe1, 2D1). Контроли изотипов и изоклонов. Для об- наружения неспецифичных сигналов в обла- сти флуоресценции фикоэритрина использу- ют отрицательный контроль. При применении контроля изотипов (моноклональные антитела к нерелевантным антигенам того же изотипа, что и используемые антитела к CD34) фикоэ- ритрин-конъюгированный изотип объединяют с CD45-ФИТЦ (или PerCP). При применении контроля изоклонов неконъюгированные (в из- 83 бытке) и фикоэритрин-конъюгированные моно- клональные антитела, идентичные антителам к CD34, объединяют с конъюгированными анти- телами к CD45. Могут быть использованы аль- тернативные комбинации. Определение абсолютного количества клеток CD34+/CD45+ Калиброванные флуоросферы. В зависимо- сти от применяемого оборудования, внутренний стандарт может представлять собой калиброван- ные сферы, находящиеся в суспензии, или мо- жет быть помещен непосредственно в прилагае- мые производителем пробирки. Абсолютное количество клеток CD34+/CD45+ в миллилитре рассчитывают по формуле: A · C B где: А — количество подсчитанных клеток CD34+/CD45+; В — количество подсчитанных флуоросфер; С — известная концентрация флуоросфер.
Стратегии гейтирования Целью стратегии гейтирования является по- следовательный выбор интересующей популяции и одновременная минимизация интерференции, вызываемой дебрисом (фрагментами клеток) и зрелыми клетками, с которыми антитела могут неспецифически связываться. При использова- нии коммерческих наборов применяют стратегию гейтирования, рекомендованную производителем набора. При использовании собственной методи- ки применяют существующие рекомендуемые стратегии. Стратегия гейтирования, учитываю- щая параметры светорассеяния и флуоресцен- цию, будет обеспечивать правильную идентифи- кацию и подсчет клеток CD34+/CD45+. Количество обрабатываемых событий Для достижения приемлемых правильности и прецизионности анализируют достаточное ко- личество событий, например, не менее 100 собы- тий CD34+ и не менее 60 000 событий CD45+; общее количество клеток может быть выше при условии, если процентное содержание CD34 со- ставляет 0,1 % или менее. ОТБОР И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ ПРОБ Антикоагулянтом при процедуре афереза является цитрат декстроза (состав А). Данный антикоагулянт позволяет проводить на одном и том же испытуемом образце как автоматизиро- ванный подсчет клеток, так и испытание с по- мощью проточной цитометрии. При отборе проб периферической крови в качестве антикоагулян- та, как правило, используют этилендиаминте- трауксусную кислоту. Условия транспортирования проб должны гарантировать постоянство температуры и фи- зическую сохранность проб. ХРАНЕНИЕ ПРОБ Испытанию могут быть подвергнуты свежие (хранившиеся не более 24 ч) пробы продуктов афереза, цельной крови, пуповинной крови или костного мозга. Пробы, хранившиеся более 24 ч и пробы, которые претерпели заморозку и раз- мораживание, окрашивают красителями, позво- ляющими оценить количество жизнеспособных клеток. При приеме проб проверяют температу- ру внутри упаковки. МЕТОДИКА ПРОБОПОДГОТОВКА ИСПЫТУЕМОГО ОБРАЗЦА Перед окрашиванием с помощью монокло- нальных антител необходимо убедиться, что концентрация клеток является подходящей. При необходимости испытуемый образец разводят средой, совместимой с испытуемым образцом и системой для лизиса. Учитывают коэффициент разведения. Рекомендуется проводить испыта- ние с использованием отрицательного контроля. АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Автоматическая стандартизация Для анализа клеток, меченных с применени- ем коммерчески доступных наборов, произво- дители разрабатывают критерии для настройки проточного цитометра. Данные настройки затем автоматически переносят в протокол анализа испытуемых образцов. Для настройки фото- умножительной трубки на заданные значения используют специальные флуоросферы, уста- навливают поправку и проверяют систему с по- мощью контрольных образцов. Настройки системы Пороговое значение: во избежание учета дебри- са (низкий уровень прямого светорассеяния) вместо 84 мелких форм лимфоцитов, на графике светорассея- ния устанавливают порог прямого угла рассеяния. Высоковольтные настройки фотоумно- жительной трубки: должны быть совместимы с анализом поверхностных клеточных мар- керов; устанавливают в каждой лаборато- рии таким образом, чтобы была возможность различить отрицательные и положительные популяции клеток с умеренной плотностью антигенов; напряжение фотоэлектронных ум- ножителей необходимо периодически прове- рять и настраивать в соответствии со стандарт- ными процедурами, принятыми в лаборатории.
Поправка: должна быть применена в случае интерференции в видимом диапазоне спектра (например, ФИТЦ/фикоэритрин), обнаруженной при анализе поверхностных клеточных марке- ров; поправку на цвет анализируют и настраива- ют в соответствии со стандартными процедура- ми, принятыми в лаборатории. Скорость потока: должна подходить для рутин- ного анализа поверхностных клеточных маркеров. Диапазоны гейтирования: области, уста- новленные для образцов CD34/CD45, которые оставляют неизменными для анализа отрица- тельной области. Расчет абсолютного количества клеток CD34+/CD45+ Абсолютное количество клеток CD34+/ CD45+ рассчитывают по формуле: n · D · V где: n — общее количество клеток CD34+/CD45+ в микролитре; D — фактор разведения; V — объем испытуемого образца, в микролитрах Результаты испытания выражают как содер- жание клеток CD34+/CD45+ в процентах, так и абсолютное количество клеток в микролитре. Если применимо, результаты могут быть выра- жены в абсолютном количестве клеток на кило- грамм массы тела реципиента. 201110008-2023 2.1.11.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПО КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИМ КЛЕТКАМ Количество гемопоэтических прогенитор- ных клеток человека определяют с помощью клоногенного анализа, основанного на их спо- собности образовывать колонии или кластеры клеток в полужидких культуральных средах. Определение в клеточном продукте количе- ства клеток, способных к образованию колоний (колониеобразующих клеток, КОК), представляет собой индикатор функциональной способности прогениторных клеток. Измеренное количество КОК коррелирует с количеством прогениторных клеток, присутствующих в образце. ПОВЕРХНОСТНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ Способность КОК формировать гемопоэти- ческие колонии in vitro и (или) восстанавливать систему гемопоэза коррелирует с экспрессией определенных поверхностных клеточных анти- генов. Экспрессия мембранного антигена CD34 является маркером для большинства гемопоэти- ческих стволовых и прогениторных клеток. ОСОБЕННОСТИ ИСПЫТАНИЯ Колонии КОК могут содержать одну или не- сколько линий гемопоэтических клеток, которые идентифицируют в соответствии с классификаци- ей, основанной на кластерах зрелых клеток, при- сутствующих в колонии в конце культивирования в полужидкой среде (например, смешанные коло- ниеобразующие единицы; колониеобразующие единицы гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, макрофагов (КОЕ-ГЭММ); колониеобразующие единицы гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ); колониеобразующие единицы гранулоцитов (КОЕ-Г); колониеобразующие единицы макро- фагов (КОЕ-М); бурстобразующие единицы эри- троцитов (БОЕ-Э); колониеобразующие единицы эритроцитов (КОЕ-Э); колониеобразующие еди- ницы мегакариоцитов (КОЕ-Мег)). 85 Количество и тип факторов роста, внесен- ных во время культивирования, определяют тип и размер колоний, которые будут сформи- рованы. Время, требуемое для дифференцировки in vitro в зрелые клетки, предоставляет допол- нительную информацию о классе гемопоэтиче- ских прогениторных клеток и их относительном пролиферативном потенциале. Время, необходи- мое для формирования in vitro колоний зрелых клеток (взрослого типа) из постнатальных КОК, составляет от 10 сут до 14 сут. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИСПЫТАНИЯ Важнейшим условием для обеспечения каче- ства испытания клоногенности является исполь- зование строго стандартизованных процедур, в валидацию которых следует включать прове- дение внутри- и межлабораторных испытаний. Источники материалов, в том числе реакти- вов, факторов роста и расходных одноразовых материалов, должны быть идентифицированы и документированы.
Основными факторами, влияющими на вари- абельность испытания клоногенности, являются количество внесенных в лунки клеток и иденти- фикация колоний. Для одного и того же испыта- ния может наблюдаться внутрилабораторная ва- риабельность до 15 %. Если необходимо оценить количество КОК в чистой клеточной популяции, можно использовать подход с предельным разве- дением, при котором количество лунок с наблю- даемой клеточной пролиферацией, измеряют с помощью автоматизированной системы. Другой важной причиной вариабельности является использование в испытании матери- алов сложного неопределенного состава (на- пример, эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота или бычьего сывороточного аль- бумина), полученных из пулов исходных мате- риалов и способствующих неспецифической стимуляции клеточной пролиферации. Однако довольно часто встречаются серии материалов с особыми характеристиками, которые селектив- но стимулируют пролиферацию специфических гемопоэтических линий. Для проведения клоногенного анали- за целесообразно использовать материалы с низким содержанием эндотоксинов (ме- нее 0,01 МЕ/мл или менее 0,01 МЕ/мг), по- скольку более высокое их содержание приводит сначала к последовательному изме- нению экспрессии гемопоэтических клонов в культурах, а впоследствии – в целом к инги- бированию клеточной пролиферации и клоноге- неза. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК Количественное определение КОК основа- но на способности прогениторных клеток фор- мировать колонию при внесении в полужидкую культуральную среду или в гель в присутствии определенных факторов роста. В зависимости от цели испытания и способа регистрации ре- зультатов могут использоваться различные типы полужидких сред (например, метилцеллюлоза, коллаген, агар и свернувшаяся плазма). Коммер- чески доступные среды обычно дают более вос- производимые результаты. МАТЕРИАЛЫ Испытания проводят, как минимум, для сле- дующих критических материалов. Факторы роста Для получения наибольшего числа коло- ний из клеточной суспензии, содержащей сме- шанную популяцию гемопоэтических проге- ниторных клеток, требуются факторы роста, стимулирующие как множество линий (напри- мер, Kit-лиганд или фактор стволовых клеток, интерлeйкин 3, гранулоцитарно-макрофагаль- ный колониестимулирующий фактор), так и определенные линии (эритропоэтин, грануло- цитарный колониестимулирующий фактор). Другие компоненты культуральной среды В среды могут быть добавлены сыворотки (в частности, эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота) и (или) альбумин. КУЛЬТУРА КЛЕТОК Клетки Испытуемый образец для культивирования должен быть репрезентативной пробой клеточ- ного продукта. Для этого испытания необхо- димо использовать суспензии клеток. В случае использования аспирации костного мозга такие суспензии могут быть получены, путем про- давливания костного мозга через решетчатые фильтры или через постепенно уменьшающий- ся диаметр игл. Для диспергирования клеточных 86 кластеров в клеточную суспензию, как правило, достаточно повторных продавливаний через иглу размера 21G. ПОСЕВ В ЧАШКУ И ПОДСЧЕТ Суспензию клеток в культуральной среде смешивают с полужидкой средой. Обычно 1 мл смеси вносят в необработанную стерильную чашку Петри (диаметром 35 мм). Из-за вязкости среды смесь не может быть нанесена на чашку с помощью автоматического дозатора, и требуется использование шприцов с иглами большого диаметра (размер 18G и менее). Количество клеток, высеваемых в чашку Пе- три, зависит от концентрации гемопоэтических прогениторных клеток в испытуемом образце.
Количество клеток должно приводить к образо- ванию от 40 до 80 колоний на чашку (диаметром 35 мм), для предотвращения образования одной колонии из двух разных гемопоэтических проге- ниторных клеток. Целевое количество колоний на чашку может быть рассчитано из процентного содержа- ния клеток CD34+ (или из концентрации клеток CD34+ в миллилитре), определенного методом проточной цитометрии (2.1.6.16) или путем ис- пользования различных разведений клеточной суспензии (как правило, проверяют не менее двух концентраций). Чашки инкубируют в аэробных условиях с концентрацией углекислого газа 5 % при температуре 37 °С во влажной (насыщенной) атмосфере в течение 10 – 14 сут и подсчитывают количество колоний с использованием инвер- тированного микроскопа. При манипуляциях с чашками, содержащими колонии, соблюда- ют меры предосторожности, поскольку среда с метилцеллюлозой является вязкой, но не же- леобразной. Наклон чашки может привести к формированию сливающихся и кометообраз- ных колоний, что делает подсчет некорректным. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛОНИЙ Размер и структура колоний зависят от типа зрелых клеток, из которых они образова- ны. Обычно минимальное количество клеток на колонию составляет 50. Присутствие ге- моглобинизированных клеток указывает на на- личие прогениторных клеток эритробластного ряда. Поскольку количество зрелых клеток для каждой линии дифференцировки в значитель- ной степени зависит от факторов роста, добав- ленных к культурам клеток, выполнение диффе- ренцированного подсчета не рекомендуется, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. ИНТЕПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты испытания обычно выражают как среднее арифметическое количества ко- лоний, посчитанных не менее чем в 3 чашках, которое затем выражают в пересчете на 104 или 105 эукариотических жизнеспособных клеток, составляющих культуру. 201110009-2023 2.1.11.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Определение качества суспензий эукари- отических клеток требует точного измерения как концентрации, так и содержания жизнеспо- собных клеток, выраженного в процентах. Эти данные необходимы для процесса принятия ре- шений при производстве клеточных продуктов и поддержания оптимальных условий культивиро- вания. Количество клеток может быть выражено как число клеток на объем клеточной суспензии, а жизнеспособность клеток – как число живых клеток на объем клеточной суспензии. Проце- дура подсчета клеток может быть выполнена вручную (гемоцитометр) или с использованием автоматических устройств (например, счетчик частиц, проточный цитометр). Также могут быть использованы и другие методы. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК РУЧНОЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА Описание прибора и принцип испытания Необходимо следующее оборудование: – гемоцитометр: специальная камера в раз- личных модификациях для микроскопического исследования. Камера состоит из толстого пред- метного стекла и покровного шлифованного стекла, предназначенного для разграничения ка- меры с определенным объемом для каждой моди- 87 фикации. На предметном стекле выгравированы глубокие бороздки, предназначенные для преду- преждения перекрестного заполнения, и нанесе- на сетка, специфичная для каждой модели; – световой микроскоп от 10× до 40× кратно- го увеличения; – пипетки подходящего объема.
Гемоцитометр используют для определения количества клеток в суспензии путем расчета кон- центрации клеток в миллилитре (С), по формуле: С = a · 10n · d где: a — число подсчитанных клеток; d — коэффициент разведения (при необходимости); n — коэффициент, меняющийся в зависимости от объема камеры гемоцитометра. В смешанной популяции распознавание кле- ток проводят по их различиям в размерах или окраске (например, лейкоциты и эритроциты). Подготовка камеры для подсчета и анализ. Покровное стекло устанавливают на предметное стекло. Притирают покровное стекло, избегая на- личия пузырьков воздуха в камере. Готовят подхо- дящее разведение клеточной суспензии в растворе 9 г/л натрия хлорида Р или буферном растворе с добавками для предотвращения гемолиза. Подходящий объем разведенной клеточной суспензии помещают в камеру подсчета. через щель, образующуюся между покровным стеклом и счетной камерой. Клеточная суспензия запол- няет камеру подсчета благодаря капиллярности. Подсчет клеток в гемоцитометре проводят под микроскопом, настраиваемом так, чтобы были отчетливо различимы нанесенная сетка и клетки, распределенные на ней. Подсчитывают количе- ство клеток на сетке и рассчитывают их концен- трацию в разведенных и неразведенных образцах. Для увеличения точности измерения необходи- мо соблюдать следующие меры предосторожности: – используют покровное стекло подходящей толщины; – по возможности, подсчитывают более 100 клеток (в случае необходимости, считают большее количество квадратов); – при обнаружении кластеров клеток (кле- точная суспензия содержит не только единичные клетки, но и их скопления) суспензию ресуспен- дируют, отбирают образец и снова подсчитывают; – для надлежащего подсчета клеток следует избегать неполного заполнения или переполне- ния счетной камеры. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА Счетчики частиц, основанные на изменении проводимости Электронные счетные устройства измеряют размер и число частиц в растворе. Перед ис- пользованием счетчики частиц калибруют рас- твором с известной концентрацией и размером частиц. Для подсчета частиц большего размера, применяют пробирки, оснащенные другими ка- либровочными насадками. Подобные приборы не позволяют различать нежизнеспособные и жизнеспособные клетки. Поскольку фрагменты клеток (дебрис) могут производить импульсы, которые вызывают ошибки, счетные устройства также оснащают пороговым контролем, позво- ляющим подсчитывать только большие частицы. Прибор должен быть пригоден для подсчета клеточных продуктов (с точки зрения линейно- сти, точности, и т.д.). Счетчики частиц, основанные на проточной цитометрии (2.1.6.16) Проточный цитометр калибруют по стандарт- ным частицам известной концентрации и разме- ра для подсчета абсолютного количества клеток в объеме. Для приборов с двумя электродами, погруженными в счетную камеру с постоянным размером и возможностью проведения измерений в фиксированном объеме, повторную калибровку проводят только при необходимости. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК Приведенные методы определения процента жизнеспособных клеток основаны на окраши- вании клеток красителями и анализе суспензии клеток с помощью ручного или автоматизиро- ванного методов подсчета. В зависимости от типа клеток и используемых методов подсчета результаты могут отличаться. РУЧНОЙ МЕТОД Принцип испытания Испытание основано на проницаемости ци- топлазматических мембран: нежизнеспособные 88 (мертвые или поврежденные клетки) абсорбиру- ют краситель и окрашиваются, жизнеспособные клетки не окрашиваются.
Испытание дает инфор- мацию о целостности мембраны, но его резуль- таты не обязательно отражают функциональную активность клетки. Мембраны недавно трипси- низированных или размороженных жизнеспособ- ных клеток способны абсорбировать краситель. Краситель Наиболее часто используемым красителем для определения жизнеспособности клеток, является трипановый синий, но также могут быть использованы и другие подходящие краси- тели, такие как эритрозин В или нигрозин. Трипановый синий – кислотный краситель (Mr 961), анион с четырьмя сульфонатными группами, легко связывающимися с белками, поэтому концентрация белка в испытуемом образце должна быть настолько низкой, насколько возможно. Условия проведения испытания Фиксация окраски клеток сильно зависит от значения рН, поэтому необходимо проведение окрашивания при рН в пределах от 6,6 до 7,6. Оптимальная фиксация осуществляется при зна- чении рН 7,5. Другие условия, такие как концен- трация красителя и время окрашивания, должны быть валидированы. Условия хранения красителя. Обычно используют 0,4 % или 0,5 % раствор три- панового синего в стерильном подходящем фосфатно-солевом буферном растворе. Хранят в защищенном от воздействия света и воздуха месте. Подготовка к испытанию и анализ. Суспензию клеток, разведенную до необходи- мой концентрации в подходящем фосфатно-со- левом буферном растворе, окрашивают, напри- мер, с использованием раствора трипанового синего с конечной концентрацией от 0,1 % до 0,2 %. Аккуратно перемешивают. Инкубируют не более 2 ‒ 4 мин при комнатной температу- ре. Вновь аккуратно перемешивают, помещают подходящий объем в счетную камеру и прово- дят подсчет клеток. Определяют процент жизнеспособных кле- ток как отношение числа неокрашенных клеток к общему количеству клеток, подсчитанному с использованием оптического микроскопа, счи- тая все окрашенные клетки нежизнеспособными. Жизнеспособность клеток (V) в процентах рассчитывают по формуле: V = n · 100 N где: n — число неокрашенных (жизнеспособных) клеток; N — общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных). Время инкубации не должно превышать 4 мин, так как впоследствии число окрашенных клеток может значительно увеличиться. В связи с этим для повторного определения необходимо подготовить новый образец. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ Проточная цитометрия Принцип испытания. Испытание основано на способности определенных красителей про- никать через поврежденные мембраны и связы- ваться с ДНК путем интеркалирования между основаниями, вследствие чего флюоресцен- цию нежизнеспособных клеток можно зареги- стрировать с помощью проточной цитометрии (2.1.6.16). Нежизнеспособные клетки оцени- вают по различиям, выявляемым при окраши- вании клеток, тогда как жизнеспособные клет- ки остаются неокрашенными. Анализ обычно выполняют с использованием 7-аминоактино- мицина D (7-ААД) или пропидий-йодида, до- пустимо использование других подходящих красителей. Красители. Мембранопроникающие веще- ства, например, 7-ААД и пропидий-йодид, мо- гут быть использованы в качестве красителей для определения жизнеспособности клеток. 7-ААД является аналогом актиномицина D, у которого в положении 7 хромофора за- менена аминокислотная группа. 7-ААД ин- теркалирует между цитозиновыми и гуани- новыми основаниями ДНК. Спектральные свойства 7-ААД позволяют использовать его как краситель для анализа методом проточ- ной цитометрии. Максимум поглощения ком- плекса 7-ААД/ДНК расположен в зеленом ди- апазоне спектра и является подходящим для определения количества клеток с помощью цитометра, оснащенного аргоновым лазером (длина волны возбуждения 488 нм).
Насыщен- ная красная флуоресцентная эмиссия 7-ААД (от 635 нм до 675 нм) обуславливает воз- можность его применения в комбинации 89 с антителами, конъюгированными с флуо- ресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) и фи- коэритрином (ФЭ), поскольку, в отличие от пропидий-йодида, комплекс 7-ААД/ДНК имеет минимальное спектральное наложение с ФИТЦ и ФЭ. Пропидий-йодид связывается с двухнитевой ДНК путем интеркалирования между парами оснований с небольшими предпочтениями или без них и со стехиометрией, соответствующей одной молекуле красителя на 4 ‒ 5 пар основа- ний ДНК. Флуоресценция образовавшегося ком- плекса красителя с нуклеиновыми кислотами увеличивается в 20 ‒ 30 раз, при этом максимум возбуждения флуоресценции смещается при- близительно на 30 ‒ 40 нм в красную область, а максимум эмиссии флуоресценции (615 нм) – приблизительно на 15 нм в синюю область. Хотя способность пропидий-йодида к оптическому поглощению довольно низка, он проявляет до- статочно большой Стоксовский сдвиг (разница длин волн максимумов спектров поглощения и флуоресценции), что позволяет одновременно обнаруживать нуклеиновые кислоты и антитела, меченные флуоресцеином при условии исполь- зования подходящих оптических фильтров. Условия хранения растворов красителей нукле- иновой кислоты. При температуре от 2 °С до 8 °С. Подготовка к испытанию и анализ. В случае гемопоэтических клеток краситель может быть добавлен после маркирования CD45+ на клет- ках для лучшего разделения клеток от клеточных фрагментов (дебриса) и тромбоцитов на осно- ве установления области соответствия объектов по боковому светорассеянию (SS) и мечения CD45+. Условия инкубации клеточной суспензии с красителем должны быть валидированы. Инкубацию выполняют при температуре от 15 °С до 25 °С, в защищенном от света условиях. При необходимости выполняют ли- зис эритроцитов, используя, например, аммония хлорид. Если в проведении лизиса нет необхо- димости, прибавляют только буферный раствор. Процентное содержание жизнеспособных клеток определяют непосредственно с помощью проточного цитометра и анализа положительных клеток (нежизнеспособные клетки) на SS/7-ААД или SS/пропидий-йодид цитограммах графиках. Положительные контроли могут состоять из стабилизированных клеток (нежизнеспособ- ные клетки), смешанных со свежими жизнеспо- собными клетками в необходимом соотношении. Цифровое изображение окрашенных клеток Цифровое изображение позволяет автома- тизировать методы с использованием световой микроскопии. Суспензию клеток и раствор кра- сителя смешивают непосредственно в приборе. Система, которая позволяет проводить аспира- цию образца, работу с реактивами и последу- ющую очистку оборудования, полностью авто- матизирована. Как только клеточная суспензия была отобрана и смешана с раствором красите- ля, она подается в проточную ячейку для ана- лиза. Окрашенная клеточная суспензия проте- кает через камеру, где стробоскопический свет позволяет фотокамере фотографировать прохо- дящие через счетную камеру клетки. Изображе- ние оцифровывается, и число нежизнеспособ- ных или жизнеспособных клеток подсчитывают с использованием программного обеспечения. 201110010-2023 2.1.11.10. АЛЮМИНИЙ В АДСОРБИРОВАННЫХ ВАКЦИНАХ И АЛЛЕРГЕНАХ МЕТОДИКА 1 Испытуемый образец. В колбу для минера- лизации вместимостью 50 мл помещают соот- ветствующее количество гомогенизированного образца, содержащего от 5 мг до 6 мг алюминия. Прибавляют 1 мл серной кислоты Р, 0,1 мл азотной кислоты Р и несколько стеклянных ша- риков. Полученный раствор нагревают до вы- деления плотного белого дыма.
Если на данной стадии наблюдается обугливание, прибавляют несколько капель азотной кислоты Р и продол- жают кипячение до исчезновения окраски. Смесь охлаждают несколько минут, с осторожностью прибавляют 10 мл воды Р и кипятят до получе- ния прозрачного раствора. Охлаждают, прибав- ляют 0,05 мл раствора метилового оранжевого Р и нейтрализуют раствором натрия гидрок- сида концентрированным Р (приблизительно 6,5 – 7 мл). Если образуется осадок, его раство- ряют, прибавляя по каплям достаточный объем серной кислоты разбавленной Р. Переносят рас- твор в коническую колбу вместимостью 250 мл, промывая колбу для минерализации 25 мл воды Р. Прибавляют 25,0 мл 0,02 М раствора натрия эдетата, 10 мл ацетатного буферно- 90 го раствора с рН 4,4 Р, несколько стеклянных шариков и осторожно кипятят 3 мин, прибав- ляют 0,1 мл раствора пиридилазонафтола Р и титруют горячий раствор 0,02 М раствором меди сульфата до изменения окраски раствора на пурпурно-коричневую. Параллельно проводят контрольный опыт. 1 мл 0,02 М раствора натрия эдетата соот- ветствует 0,5396 мг Al. МЕТОДИКА 2 Испытуемый образец. В круглодонную кол- бу вместимостью 100 мл помещают соответству- ющее количество гомогенизированного образца, содержащего около 1 мг алюминия, прибавля- ют 2 мл раствора серной кислоты разбавлен- ной Р, перемешивают и нагревают до кипения. Во избежание выпаривания жидкости в колбу после закипания раствора периодически вносят при перемешивании от 2 до 5 раз по 5 мл воды Р и продолжают нагревать до полного растворе- ния осадка. Полученный раствор охлаждают до температуры от 15 °С до 25 °С, переносят в коническую колбу вместимостью 250 мл, про- мывая круглодонную колбу 25 мл воды Р. Прибавляют 10 мл ацетатного буферного раствора с рН 4,5 Р и 10,0 мл 0,01 М раствора натрия эдетата, перемешивают и нагревают до кипения. Полученный раствор охлаждают до температуры от 15 °С до 25 °С, прибавляют 25 мл этанола (96 %) Р, 1 мл раствора 0,25 г/л дитизона Р в ацетоне Р, перемешивают и ти- труют 0,01 М раствором цинка сульфата до из- менения окраски на красную. Параллельно проводят контрольный опыт. 1 мл 0,01 М раствора натрия эдетата соот- ветствует 0,2698 мг Al. 201110011-2023 2.1.11.11. ФЕНОЛ В ИММУНОСЫВОРОТКАХ, ВАКЦИНАХ И АЛЛЕРГЕНАХ Испытуемый раствор. Гомогенизирован- ный испытуемый образец разводят водой Р до объема, необходимого для получения раствора фенола с концентрацией около 15 мкг/мл. Растворы сравнения. Готовят ряд рас- творов сравнения с фенолом Р, содержащих 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл, 20 мкг/мл и 30 мкг/мл фенола соответственно. К 5,0 мл испытуемого раствора и 5,0 мл каждого из растворов сравнения прибавляют по 5,0 мл буферного раствора с рН 9,0 Р, 5,0 мл раствора аминопиразолона Р и 5,0 мл раствора калия феррицианида Р. Выдерживают получен- ные растворы 10 мин и измеряют их оптическую плотность (2.1.2.24) при длине волны 546 нм. Строят калибровочную кривую и рассчиты- вают содержание фенола в испытуемом образце. 201110012-2023 2.1.11.12. БЕЛОК В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упа- ковки с испытуемым образцом количественно переносят в мерную колбу подходящего объе- ма и доводят водой Р для получения раствора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. 1,0 мл полученного раствора помещают в сте- клянную пробирку, прибавляют 0,15 мл раство- ра 400 г/л трихлоруксусной кислоты Р, встря- хивают, выдерживают 15 мин, центрифугируют 10 мин при скорости вращения 5000 об/мин и отбрасывают надосадочную жидкость. К по- лученному осадку прибавляют 0,4 мл раствора 4,2 г/л натрия гидроксида Р. Растворы сравнения.
0,100 г альбумина бычьего Р растворяют в 100,0 мл раствора 4,2 г/л натрия гидроксида Р (основной раствор с концентрацией белка 1 г/л). 1,0 мл основного раствора доводят раствором 4,2 г/л натрия гидроксида Р до объема 20,0 мл (рабочее раз- ведение 1 с концентрацией белка 50 мг/л). 1,0 мл основного раствора доводят раствором 4,2 г/л натрия гидроксида Р до объема 4,0 мл (рабочее разведение 2 с концентрацией белка 250 мг/л). В 3 стеклянные пробирки помещают по 0,10 мл, 0,20 мл и 0,40 мл рабочего разведения 1, а в 3 другие стеклянные пробирки – по 0,15 мл, 0,20 мл и 0,25 мл рабочего разведения 2. До- водят объем раствора в каждой пробирке до 0,40 мл, используя раствор 4,2 г/л натрия ги- дроксида Р. Компенсационный раствор. Готовят, исполь- зуя 0,40 мл раствора 4,2 г/л натрия гидроксида Р. В каждую пробирку прибавляют по 2,0 мл медно-тартратного раствора Р3, встряхивают и выдерживают 10 мин. Далее в пробирки при- бавляют по 0,2 мл смеси из равных объемов фос- 91 форномолибденово-вольфрамового реактива Р и воды Р, приготовленной непосредственно перед использованием. Закрывают пробирки, перемешивают, переворачивая их, и дают отстояться в темном месте 30 мин. Синяя окра- ска остается стабильной 60 мин. При необходи- мости центрифугируют для получения прозрач- ных растворов. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длине волны 760 нм относитель- но компенсационного раствора. Строят калибровочную кривую зависимости значений оптической плотности шести раство- ров сравнения от соответствующего содержания белка и с ее помощью определяют концентра- цию белка в испытуемом растворе. 201110013-2023 2.1.11.13. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упаковки с испытуемым образцом количественно переносят в мерную колбу подходящего объема и доводят водой Р для получения раствора поли- сахарида с концентрацией около 5 мг/мл. При необходимости разводят испытуемый раствор до достижения значения оптической плотности, подходящего для используемо- го прибора. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) раствора при длине волны 260 нм. Оптическая плотность раствора 1 г/л нуклеи- новой кислоты при длине волны 260 нм равна 20. 201110014-2023 2.1.11.14. ФОСФОР В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упаковки с испытуемым образцом количественно перено- сят в мерную колбу подходящего объема и дово- дят водой Р для получения раствора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. Раствор разводят до концентрации фосфора около 6 мкг/мл. Пере- носят 1,0 мл полученного раствора в пробирку из термостойкого стекла вместимостью 10 мл. Растворы сравнения. 0,2194 г калия диги- дрофосфата Р растворяют в воде Р и доводят тем же растворителем до объема 500,0 мл (ос- новной раствор с концентрацией фосфора 0,1 мг/мл). 5,0 мл полученного раствора доводят водой Р до объема 100,0 мл (разбавленный раствор с концентрацией фосфора 0,005 мг/мл). Переносят 0,5 мл, 1,0 мл и 2,0 мл разбавленного раствора в 3 пробирки из термостойкого стекла. Компенсационный раствор. Готовят в про- бирке из термостойкого стекла, используя 2,0 мл воды Р. В каждую пробирку прибавляют по 0,2 мл серной кислоты Р. Пробирки нагревают в мас- ляной бане при температуре 120 °C в течение 1 ч, а затем при температуре 160 °C до появ- ления белого дыма (около 1 ч). Прибавляют по 0,1 мл хлорной кислоты Р и нагревают при температуре 160 °C до обесцвечивания раство- ра (около 90 мин). Охлаждают и прибавляют в пробирки по 4,0 мл воды Р и 4,0 мл реакти- ва аммония молибдата Р.
Нагревают в водяной бане при температуре 37 °C в течение 90 мин, охлаждают и доводят водой Р до объема 10,0 мл. Синяя окраска растворов остается стабильной в течение нескольких часов. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длине волны 820 нм относитель- но компенсационного раствора. Строят калибровочную кривую зависимости оптической плотности трех растворов сравне- ния от соответствующего содержания фосфора и с ее помощью определяют концентрацию фос- фора в испытуемом растворе. 201110015-2023 2.1.11.15. O-АЦЕТИЛ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упа- ковки с испытуемым образцом количествен- но переносят в мерную колбу подходящего объема и доводят водой Р для получения рас- твора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. Разводят раствор так, чтобы объемы, используемые в испытании, содержали от 30 мкг до 600 мкг ацетилхолина хлорида (O-ацетил). Помещают 0,3 мл, 0,5 мл и 1,0 мл полученно- го раствора в двух повторностях в 6 пробирок 92 (3 реагирующих раствора и 3 корректирующих раствора). Растворы сравнения. 0,150 г ацетилхолина хлорида Р растворяют в воде Р и доводят тем же растворителем до объема 10,0 мл (основной раствор с концентрацией ацетилхолина хлорида 15 г/л). 1,0 мл основного раствора непосред- ственно перед использованием доводят водой Р до объема 50,0 мл (рабочее разведение 1 с кон- центрацией ацетилхолина хлорида 300 мкг/мл). 1,0 мл основного раствора непосредственно перед использованием доводят водой Р до объема 25,0 мл (рабочее разведение 2 с концентрацией ацетилхолина хлорида 600 мкг/мл). Помеща- ют 0,1 мл и 0,4 мл рабочего разведения 1 в двух повторностях (реагирующий и корректирующий растворы) в 4 пробирки, 0,6 мл и 1,0 мл рабочего разведения 2 в двух повторностях (реагирующий и корректирующий растворы) в другие 4 пробирки. Компенсационный раствор. Готовят, исполь- зуя 1,0 мл воды Р. Объем раствора в каждой пробирке доводят водой Р до 1,0 мл. В пробирки с корректирую- щим раствором и компенсационным раствором прибавляют по 1,0 мл раствора 412 г/л хлорово- дородной кислоты Р и далее – по 2,0 мл раство- ра гидроксиламина щелочного Р. Выдерживают точно 2 мин для протекания реакции и прибав- ляют в пробирки с реагирующим раствором по 1,0 мл раствора 412 г/л хлороводородной кисло- ты Р. В каждую пробирку прибавляют по 1,0 мл раствора 100 г/л железа (III) хлорида Р в раство- ре 10,3 г/л хлороводородной кислоты Р, закры- вают пробирки пробками и энергично встряхи- вают для удаления пузырьков. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длине волны 540 нм относитель- но компенсационного раствора. Из значения оптической плотности каждого реагирующего рас- твора вычитают значение оптической плотности соответствующего корректирующего раствора. Строят калибровочную кривую зависимости скорректированных значений оптической плот- ности четырех растворов сравнения от соответ- ствующего содержания ацетилхолина хлорида и с ее помощью определяют концентрацию ацетилхолина хлорида в испытуемом растворе для каждого исследуемого объема. Рассчиты- вают среднее по трем значениям концентрации ацетилхолина хлорида. 1 моль ацетилхолина хлорида (181,7 г) соот- ветствует 1 моль O-ацетила (43,05 г). 201110016-2023 2.1.11.16. ГЕКСОЗАМИНЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упа- ковки с испытуемым образцом количественно переносят в мерную колбу подходящего объе- ма и доводят водой Р для получения раствора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. Разводят раствор так, чтобы объемы, исполь- зуемые в испытании, содержали от 125 мкг до 500 мкг глюкозамина (гексозамина).
Помеща- ют 1,0 мл полученного раствора в градуирован- ную пробирку. Растворы сравнения. 60 мг глюкозамина гидрохлорида Р растворяют в воде Р и дово- дят тем же растворителем до объема 100,0 мл (основной раствор с концентрацией глюкоза- мина 0,500 г/л). Помещают 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл и 1,0 мл основного раствора в 4 градуи- рованные пробирки. Компенсационный раствор. Готовят, исполь- зуя 1,0 мл воды Р. Ацетилацетоновый реактив. Готовят не- посредственно перед использованием. Сме- шивают один объем ацетилацетона Р и 50 объемов раствора 53 г/л натрия карбоната безводного Р. Диметиламинобензальдегида раствор. Го- товят непосредственно перед использованием. Растворяют 0,8 г диметиламинобензальдеги- да Р в 15 мл этанола (96 %) Р и прибавляют 15 мл хлороводородной кислоты Р. Объем раствора в каждой пробирке дово- дят водой Р до 1,0 мл. В пробирки прибавляют по 1,0 мл раствора 824 г/л хлороводородной кислоты Р, закрывают пробками, выдерживают в водяной бане 1 ч и охлаждают до температу- ры от 15 °С до 25 °С. Далее в пробирки при- бавляют по 0,05 мл раствора 5 г/л тимолфта- леина Р в этаноле (96 %) Р. Добавляют раствор 200 г/л натрия гидроксида Р до появления го- лубого окрашивания, а затем раствор 103 г/л хлороводородной кислоты Р до обесцвечивания раствора. Объем раствора в каждой пробирке доводят водой Р до 10,0 мл (нейтрализованные гидролизаты). Во вторую серию градуированных проби- рок объемом 10 мл помещают по 1,0 мл каждо- го нейтрализованного гидролизата. В пробирки 93 прибавляют по 1,0 мл ацетилацетонового реак- тива. Пробирки закрывают пробками, выдер- живают в водяной бане при температуре 90 °C в течение 45 мин и охлаждают до температу- ры от 15 °С до 25 °С. В пробирки прибавляют по 2,5 мл этанола (96 %) Р и 1,0 мл раствора диметиламинобензальдегида, доводят объем растворов в пробирках этанолом (96 %) Р до 10,0 мл. Пробирки закрывают, содержи- мое перемешивают, переворачивая пробирки, и выдерживают в темном месте 90 мин. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длине волны 530 нм относитель- но компенсационного раствора. Строят калибровочную кривую зависимо- сти значений оптической плотности четырех растворов сравнения от соответствующего со- держания гексозамина и с ее помощью опреде- ляют концентрацию гексозамина в испытуемом растворе. 201110017-2023 2.1.11.17. МЕТИЛПЕНТОЗЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упа- ковки с испытуемым образцом количественно переносят в мерную колбу подходящего объе- ма и доводят водой Р для получения раствора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. Разводят раствор так, чтобы объемы, исполь- зуемые в испытании, содержали от 2 мкг до 20 мкг рамнозы (метилпентозы). Помещают 0,25 мл, 0,50 мл и 1,0 мл полученного раствора в 3 пробирки. Растворы сравнения. 0,100 г рамнозы Р растворяют в воде Р и доводят тем же раствори- телем до объема 100,0 мл (основной раствор с концентрацией метилпентозы 1 г/л). Непосред- ственно перед использованием 1,0 мл основно- го раствора доводят водой Р до объема 50,0 мл (рабочее разведение с концентрацией метилпен- тозы 20 мг/л). В 5 пробирок помещают 0,10 мл, 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл и 1,0 мл рабочего разведения. Компенсационный раствор. Готовят, исполь- зуя 1,0 мл воды Р. Объем раствора в каждой пробирке доводят водой Р до 1,0 мл. Пробирки помещают в ледя- ную баню, прибавляют по каплям при постоян- ном помешивании по 4,5 мл охлажденной смеси, состоящей из одного объема воды Р и 6 объ- емов серной кислоты Р.
Пробирки нагревают до температуры от 15 °С до 25 °С и далее про- должают нагревание на водяной бане в течение нескольких минут. Охлаждают до температуры от 15 °С до 25 °С. В каждую пробирку прибавля- ют по 0,10 мл приготовленного непосредствен- но перед использованием раствора 30 г/л цис- теина гидрохлорида Р. Пробирки встряхивают и выдерживают 2 ч. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длинах волн 396 нм и 430 нм. Для каждого раствора рассчитывают разницу между значением оптической плотности, изме- ренным при длине волны 396 нм, и ее значени- ем, измеренным при длине волны 430 нм. Строят калибровочную кривую зависимости значений оптической плотности пяти растворов сравнения от соответствующего содержания метилпентозы и с ее помощью определяют кон- центрацию метилпентозы в испытуемом раство- ре для каждого исследуемого объема. Рассчиты- вают среднее по трем значениям концентрации метилпентозы. 201110018-2023 2.1.11.18. УРОНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое упа- ковки с испытуемым образцом количественно переносят в мерную колбу подходящего объе- ма и доводят водой Р для получения раствора полисахарида с концентрацией около 5 мг/мл. Разводят раствор так, чтбы объемы, используе- мые в испытании, содержали от 4 мкг до 40 мкг глюкуроновой кислоты (уроновых кислот). По- мещают 0,25 мл, 0,50 мл и 1,0 мл полученного раствора в 3 пробирки. Растворы сравнения. 50 мг натрия глюкуро- ната Р растворяют в воде Р и доводят тем же растворителем до объема 100,0 мл (основной раствор с концентрацией глюкуроновой кис- лоты 0,4 г/л). Непосредственно перед исполь- зованием 5,0 мл основного раствора разводят водой Р до объема 50,0 мл (рабочее разведение 94 с концентрацией глюкуроновой кислоты 40 мг/л). В 5 пробирок помещают 0,10 мл, 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл и 1,0 мл рабочего разведения. Компенсационный раствор. Готовят, исполь- зуя 1,0 мл воды Р. Объем в каждой пробирке доводят водой Р до 1,0 мл. Помещают пробирки в ледяную баню и при постоянном перемешивании прибавляют в каждую пробирку по каплям по 5,0 мл буры раствора Р. Закрывают пробирки пробками и выдерживают в водяной бане 15 мин. Охлаж- дают до температуры от 15 °С до 25 °С. В про- бирки добавляют по 0,20 мл раствора 1,25 г/л карбазола Р в этаноле Р. Закрывают пробир- ки пробками и выдерживают в водяной бане 15 мин. Охлаждают до температуры от 15 °С до 25 °С. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов при длине волны 530 нм. Строят калибровочную кривую зависимости значений оптической плотности пяти растворов сравнения от содержания глюкуроновой кисло- ты и с ее помощью определяют концентрацию глюкуроновой кислоты в испытуемом растворе для каждого исследуемого объема. Рассчиты- вают среднее по трем значениям концентрации глюкуроновой кислоты. 201110019-2023 2.1.11.19. СИАЛОВАЯ КИСЛОТА В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ Испытуемый раствор. Содержимое одной или нескольких упаковок с испытуемым образ- цом количественно переносят в мерную колбу подходящего объема и доводят водой Р для по- лучения раствора полисахарида с концентра- цией около 250 мкг/мл. Переносят с помощью шприца 4,0 мл полученного раствора в ультра- фильтрационную ячейку вместимостью 10 мл, пропускающую молекулы с относительной мо- лекулярной массой менее 50 000. Дважды про- мывают шприц водой Р, промывную жидкость переносят в ту же ультрафильтрационную ячей- ку. Проводят ультрафильтрацию при постоян- ном перемешивании в присутствии азота Р под давлением около 150 кПa.
Наполняют ячей- ку водой Р каждый раз, когда объем жидкости в ней уменьшается до 1 мл, до тех пор, пока не профильтруется 200 мл, а оставшийся в ячей- ке объем не будет составлять около 2 мл. Остав- шуюся жидкость переносят с помощью шприца в мерную колбу вместимостью 10 мл. Ячейку трижды промывают водой Р порциями по 2 мл. Промывную жидкость переносят в ту же мер- ную колбу и доводят водой Р до объема 10,0 мл (испытуемый раствор). В две пробирки помеща- ют по 2,0 мл испытуемого раствора. Растворы сравнения. Используют растворы сравнения, указанные в частной фармакопейной статье. Готовят 2 серии из трех пробирок. В про- бирки каждой серии помещают 0,5 мл, 1,0 мл и 1,5 мл раствора сравнения, соответствующего типу вакцины, предназначенной для испытания, и объем в каждой пробирке доводят водой Р до 2,0 мл. Контрольный раствор. Готовят с использо- ванием воды Р по 2,0 мл в двух пробирках. В каждую пробирку прибавляют по 5,0 мл резорцина реактива Р. Пробирки нагревают при температуре 105 °С в течение 15 мин, ох- лаждают в холодной воде и помещают в ледя- ную баню. В пробирки прибавляют по 5,0 мл изоамилового спирта Р, содержимое тщательно перемешивают и выдерживают в ледяной бане 15 мин. Пробирки центрифугируют и держат их в ледяной бане до проведения измерения. Измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) верхнего слоя при 580 нм и 450 нм, используя изоамиловый спирт Р в качестве компенсацион- ного раствора. Для каждой длины волны рассчитывают среднее из значений оптической плотности, полученных для двух идентичных растворов. Вычитают среднее значение оптической плотно- сти контрольного раствора из средних значений, полученных для других растворов. Строят кривую зависимости разницы между значениями оптической плотности при 580 нм и 450 нм растворов сравнения от содержания сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты) и с ее помощью определяют кон- центрацию сиаловой кислоты в испытуемом растворе. 95 2.2. РЕАКТИВЫ 96 202010001-2023 2.2.1.1. РЕАКТИВЫ ДОПОЛНЕНИЕ Натрия карбоната раствор Р2. Раствор 40 г/л натрия карбоната безводного Р в 0,2 М растворе натрия гидроксида. Папаин. [9001-73-4]. Протеолитический фермент, получаемый из млечного сока зеленых плодов и листьев Carica papaya L. Активность фермента должна быть подтверждена. 2.2.1. РЕАКТИВЫ, СТАНДАРТНЫЕ РАСТВОРЫ, БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ 97 2.3. ОБЩИЕ ТЕКСТЫ 98 203010005-2023 2.3.1.5. МЕТОДЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ СТЕРИЛЬНОСТИ ПРОДУКТОВ Стерильность – отсутствие жизнеспособ- ных микроорганизмов, определяемое уровнем обеспечения стерильности с содержанием жиз- неспособных микроорганизмов в количестве не более 10-6. Стерильность является критическим показателем качества для широкого спектра ле- карственных средств, например: – лекарственных препаратов, которые долж- ны быть стерильными по причине способа их введения, таких как лекарственные препара- ты для парентерального и офтальмологического применения, а также некоторые лекарственные препараты для ингаляционного применения, ле- карственные препараты для орошения и лекар- ственные препараты для внутриматочного вве- дения; – лекарственных препаратов, наносимых на значительно поврежденную кожу (раневую по- верхность), таких как лекарственные препараты для наружного применения в виде мягких лекар- ственных форм; – субстанции для фармацевтического при- менения, предназначенные для производства стерильных лекарственных препаратов без последующей стерилизации (в асептических условиях). Стерильные продукты получают в соответ- ствующих условиях и упаковывают в подхо- дящую упаковку.
Рекомендуется, чтобы выбор упаковки позволял применять оптимальный процесс стерилизации продукта. Упаковка и система укупорки должны обеспечивать сохранение стерильности продукта в течение всего срока годности (срока хранения). Условия процесса стерилизации выбира- ют таким образом, чтобы достигалась макси- мальная степень стерильности, совместимая с лекарственным средством, и, если примени- мо, выбирают процесс, в котором продукт сте- рилизуется в его конечной упаковке (финишная стерилизация). При использовании полностью валидированного метода финишной стерили- зации насыщенным паром, сухим жаром или ионизирующим излучением, при наличии раз- решения уполномоченного органа, может осу- ществляться выпуск продукции по параметрам (то есть выпуск партии стерильного продукта на основе данных процесса без передачи об- разца для испытания на стерильность). Если финишная стерилизация невозможна, произ- водство осуществляют в асептических условиях или применяют стерилизующую фильтрацию. Для дополнительной гарантии обеспечения сте- рильности, если применимо, проводят подхо- дящую дополнительную обработку (например, нагревание) продукта в его конечной упаковке. Так как достижение стерильности каждой единицы из группы объектов, подвергнутых процессу стерилизации, не может быть ни га- рантировано, ни подтверждено, важно изучить влияние выбранной процедуры стерилизации на продукт (включая конечную упаковку), что- бы быть уверенным в эффективности процесса и сохранности продукта, а также валидировать процедуру перед ее применением на практике. Недостаточное соблюдение валидированного процесса приводит к риску получения несте- рильного и (или) некачественного продукта. Общая фармакопейная статья содержит ука- зания по валидации, условиям и контролю про- цессов стерилизации. Описанные методы при- меняют главным образом для инактивации или удаления бактерий и грибов (дрожжей и плесне- вых). Для биологических продуктов животного или человеческого происхождения или в тех случаях, когда такой материал использовался в процессе производства, в ходе валидации необходимо под- твердить, что процесс пригоден для удаления или инактивации любого вирусного заражения. Допол- нительные указания приведены в общей фармако- пейной статье 2.3.1.3. Вирусная безопасность. Эффективность процесса стерилизации зависит от используемого метода, условий обра- ботки (например, времени, температуры, влаж- ности), уровня и типа контаминации микроор- ганизмами до стерилизации и состава продукта. Инактивация микроорганизмов физическими или химическими средствами происходит согласно экспоненциальному закону, поэтому всегда суще- ствует ненулевая вероятность того, что микроорга- низм может выдержать процесс стерилизации. 2.3.1. ОБЩИЕ ТЕКСТЫ ПО МИКРОБИОЛОГИИ 99 Уровень обеспечения стерильности Для методов, описанных ниже, при необ- ходимости, указывают уровень обеспечения стерильности, выражающий для конкретного процесса стерилизации вероятность выживания микроорганизмов в продукте после воздействия процесса. Например, уровень обеспечения сте- рильности 10-6 означает вероятность наличия не более одной единицы нестерильного продук- та из 1 · 106 простерилизованных единиц про- дукта. Уровень обеспечения стерильности для конкретного продукта устанавливают с помо- щью соответствующей валидации процесса сте- рилизации.
Контаминация микроорганизмами характеризуется количеством, типом и устой- чивостью любых присутствующих микроорга- низмов, поэтому микробиологический монито- ринг и установление соответствующих пределов необходимы для всех компонентов, входящих в состав стерильного лекарственного препара- та. Меры, предназначенные для уменьшения контаминации микроорганизмами, такие как фильтрация перед стерилизацией, будут в значи- тельной степени способствовать обеспечению стерильности. Компоненты в составе продукта могут влиять на поведение микроорганизмов, присутствующих в продукте, что в свою очередь может влиять на эффективность процесса сте- рилизации. Например, активность воды (Aw), pH и присутствие веществ с антимикробной актив- ностью могут повлиять на устойчивость любых присутствующих микроорганизмов. Активность воды или компоненты, входящие в состав про- дукта (включая присутствие отдельных компо- нентов питательных сред), могут оказать вли- яние на количество микроорганизмов и, таким образом, на эффективность процесса мембран- ной фильтрации. МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ Стерилизация может осуществляться одним из методов, описанных ниже. Модификации или комбинации этих методов могут быть исполь- зованы при условии, что выбранный процесс стерилизации валидирован и обеспечивает как ее эффективность, так и сохранность продукта, включая целостность упаковки. Мониторинг критических параметров процесса проводят для всех методов стерилизации для подтверждения, что любые ранее установленные требования или условия соблюдаются на протяжении всего процесса стерилизации всей серии (партии) про- дукта. Это применимо во всех случаях, включая стандартные условия стерилизации. Руковод- ство по валидации процесса стерилизации па- ром с использованием F0 концепции описано в общей фармакопейной статье 2.3.1.6. Приме- нение F-концепций при термической стерилиза- ции. Для разработки и валидации процессов сте- рилизации, а также для мониторинга процессов газовой стерилизации используют биологиче- ские индикаторы стерилизации. Указания по ис- пользованию биологических индикаторов при- ведены в общей фармакопейной статье 2.3.1.7. Биологические индикаторы стерилизации. После окончания цикла стерилизации долж- ны быть приняты меры, предотвращающие кон- таминацию микроорганизмами простерилизо- ванных продуктов. СТЕРИЛИЗАЦИЯ НАСЫЩЕННЫМ ПАРОМ (АВТОКЛАВИРОВАНИЕ) Принцип Стерилизация насыщенным водяным паром достигается путем теплообмена при конденса- ции воды из фазы насыщенного пара на поверх- ности стерилизуемых объектов. Если объекты (открытые или завернутые в материал, пропу- скающий воздух и пар) стерилизуются в пря- мом контакте с паром, увлажняющий эффект конденсата усиливает стерилизующий эффект. Для прямого воздействия пара важно, чтобы объ- екты были полностью пропитаны насыщенным паром, то есть не содержащим воздух и другие неконденсирующиеся газы. В случае стерилиза- ции в закрытой упаковке камера стерилизатора служит в качестве паровой рубашки. Конденса- ция на поверхности упаковки служит высокоэф- фективным механизмом для передачи энергии, но не оказывает дополнительного стерилизую- щего воздействия. При стерилизации в закрытой упаковке стерилизующий эффект определяется условиями, достигнутыми в закрытой упаков- ке, где стерильными должны быть как продукт, так и свободное пространство в упаковке.
Оборудование Стерилизация паром выполняется в автокла- вах, то есть в сосудах под давлением, предна- значенных для непрерывной подачи или генери- рования пара и удаления конденсата из камеры для поддержания давления и температуры в пре- делах контролируемых уровней. 100 Для оборудования, используемого в циклах стерилизации с прямым воздействием пара, долж- на быть обеспечена подача насыщенного пара, свободного от неконденсируемых газов. В автокла- вах, предназначенных для стерилизации объектов в закрытых емкостях, для достижения теплопере- дачи могут использоваться паровоздушные смеси или распыление перегретой воды. Для достижения однородных условий внутри камеры и загрузки применяют подходящие, прошедшие квалифика- цию автоклавы. Принципы работы должны соот- ветствовать объектам, подлежащим стерилизации и конфигурации загрузки. Пригодность оборудова- ниядлястерилизуемыхобъектовиегопроизводитель- ность в выбранном цикле должны быть подтверж- дены при проведении квалификации эксплуатации автоклава. Регистрируют температурные профили в наиболее медленно нагревающихся точках. Для обеспечения эффективного управле- ния процессом стерилизации автоклавы долж- ны быть оснащены датчиками температуры и давления надлежащей чувствительности, рас- положенными в соответствующих положениях. Для подтверждения соблюдения условий сте- рилизации профили температуры и давления в камере записывают для каждого цикла, при этом должен быть по крайней мере один неза- висимый температурный датчик, контролирую- щий температуру загрузки в наиболее медленно нагревающейся точке или в закрытой упаковке, нахо- дящейся в наиболее медленно нагревающейся точке. Охлаждающая вода, подаваемая в каме- ру в конце процесса стерилизации закрытых емкостей, должна быть надлежащего качества во избежание отрицательного влияния на стерильность объектов стерилизации. Цикл стерилизации Циклы стерилизации выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с стери- лизуемыми объектами и конфигурацией загруз- ки. В тех случаях, когда воздух вытесняется из камеры под действием силы тяжести, объек- ты, подлежащие автоклавированию, не должны препятствовать удалению воздуха и должны размещаться внутри автоклава таким образом, чтобы предотвратить образование недоступных воздушных карманов. В случае удаления воздуха с помощью циклов вакуумирования, сопрово- ждаемых импульсами пара, необходимо убе- диться в том, что данный процесс не воздейству- ет на стерилизуемые объекты. Стерилизация насыщенным паром может быть не приемлема для чувствительных к давлению продуктов в за- крытых упаковках. Чтобы сбалансировать дав- ление внутри камеры и в закрытой упаковке, в камеру могут подаваться паровоздушные сме- си. Проникновение пара обеспечивается путем выбора подходящих циклов для удаления возду- ха из пористых или полых тел. При разработке цикла стерилизации проникновение пара вери- фицируют, например, с использованием физиче- ских или химических показателей, а биологиче- скую эффективность цикла – с использованием биологических индикаторов (2.3.1.7). Должны быть определены соответствующие схемы загрузки. Эффективность цикла Стандартными условиями для данного ме- тода стерилизации являются продолжитель- ность 15 мин, температура насыщенного пара (120 – 122) °C, определенная в самом холодном месте камеры, и давление 120 кПа. В зависимости от продукта или объема загрузки на основании разработки и валидации могут применяться иные комбинации времени и температуры. Ми- нимальная температура, приемлемая для паро- вой стерилизации, составляет 110 °С.
Мини- мальное значение F0, рассчитанное в наиболее медленно нагревающейся точке загрузки, со- ставляет не менее 8 мин. Расчет эффективности стерилизации согласно F0-концепции проводят в соответствии с общей фармакопейной ста- тьей 2.3.1.6. Применение F-концепций при тер- мической стерилизации. Расчет эффективности для физического параметра (Fphys) коррелирует с биологической эффективностью (Fbio). Величи- на Fbio выражает летальность микроорганизмов в минутах при условии использования процес- са с разрушением биологического индикатора. Значение Fbio рассчитывают по формуле: Fbio = D121 · (lgN0 – lgN) где: D121 — значение величины D для биологи- ческого индикатора при темпера- туре 121 °С, продолжительность, обеспечивающая снижение числа жизнеспособных микроорганиз- мов до 10 % от их исходного числа (до экспозиции), в минутах; N0 — количество живых микроорганиз- мов в биологическом индикаторе до экспозиции; 101 N — количество живых микроорганиз- мов в биологическом индикаторе после экспозиции. При валидации цикла стерилизации опре- деляют позиции загрузки, наиболее трудные для стерилизации, и проверяют биологическую эффективность путем размещения биологиче- ских индикаторов в этих позициях. Оценивают защищенность спор от стерилизующего эффек- та и принимают соответствующие меры. Зна- чение Fbio, определенное для наиболее трудной для стерилизации позиции, используют при определении параметров выбранного цикла, необходимых для надежного достижения уровня обеспечения стерильности с содержанием жиз- неспособных микроорганизмов в количестве не более 10-6. Рутинный контроль Цикл автоклавирования контролируют физическим определением профилей давле- ния в камере и температуры по крайней мере в самом холодном месте камеры. Для каждого цикла стерилизации регистрируют давление, время и температуру и по возможности рассчи- тывают значение F0. СУХОЖАРОВАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ Принцип Стерилизация сухим жаром – метод терми- ческой стерилизации, основанный на передаче тепла стерилизуемым объектам. Тепло может передаваться посредством конвекции, излуче- ния или прямой передачи. Оборудование Сухожаровую стерилизацию проводят в шка- фу с принудительной циркуляцией воздуха или с использованием другого оборудования, предна- значенного для данной цели, например, туннеля. Цикл стерилизации Стерилизатор загружают таким образом, чтобы заданная или требуемая температура достигалась для всей загрузки. Информацию о температуре внутри стерилизатора во время цикла стерилизации получают с помощью чув- ствительных к температуре элементов, которые подходящим образом размещены внутри или на соответствующих объектах, расположенных в предварительно определенной самой холодной части загруженного стерилизатора. На протяже- нии каждого цикла подходящим образом реги- стрируют время и температуру. Эффективность цикла Стандартными условиями для данного ме- тода стерилизации являются продолжитель- ность 2 ч, минимальная температура 160 °С. Другие комбинации времени и температуры могут использоваться, если подтверждено, что выбранный процесс обеспечивает адекватный и воспроизводимый уровень летальности ми- кроорганизмов при работе с установленными допусками. Используемые процедуры и условия производства должны быть такими, чтобы уро- вень обеспечения стерильности был не более 10-6 содержания жизнеспособных микроорга- низмов. Процессы сухожаровой стерилизации валидируют с использованием комбинаций тем- пературного картирования и испытаний с биоло- гическими индикаторами (2.3.1.7).
Сухой жар при температуре выше 220 °C в течение валидированного времени часто исполь- зуют для депирогенизации стеклянной посуды. В этом случае при валидации в качестве критерия оценки эффективности может быть использован показатель снижения термостойкого эндотоксина на 3 единицы по шкале десятичного логарифма, а биологические индикаторы не требуются. Рутинный контроль Циклы стерилизации сухим жаром контро- лируют путем определения температурных про- филей по крайней мере в самом холодном месте камеры. Для каждого цикла регистрируют время и температуру. РАДИАЦИОННАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ Принцип Радиационный метод стерилизации осу- ществляют путем воздействия на объект иони- зирующего излучения в виде гамма-излучения от подходящего изотопного источника (напри- мер, кобальта-60), пучка электронов, генерируе- мого подходящим ускорителем электронов, или рентгеновских лучей, возникающих в результа- те бомбардировки подходящих целей генериру- емыми электронами. Ионизирующее излучение может быть использовано для финишной сте- рилизации лекарственных препаратов, микро- биологической инактивации тканей и клеток или стерилизации материалов или упаковки, ис- пользуемых в асептических процессах. Низкоэ- нергетические электроны могут использоваться для поверхностной стерилизации материалов при входе в изоляторы, используемые при про- изводстве стерильных продуктов. 102 Эффективность цикла Стандартная поглощенная доза для данно- го метода стерилизации составляет от 10 кГр до 50 кГр. Другие дозы могут быть использо- ваны, если во время валидации стерилизую- щей дозы подтверждено, что выбранная доза обеспечивает адекватный и воспроизводимый уровень летальности при рутинном процес- се в установленных допустимых пределах. Используемые процедуры и условия произ- водства должны быть такими, чтобы уровень обеспечения стерильности был не более 10-6 содержания жизнеспособных микроорганизмов. Для разработки и валидации процесса стерили- зации тканевых и клеточных продуктов могут быть применены биологические индикаторы. Они также могут потребоваться для продуктов, потенциально предотвращающих инактивацию спор микроорганизмов. Рутинный контроль Во время процесса стерилизации достав- ленную стерилизующую дозу контролируют с помощью дозиметрической системы, просле- живаемой до национального эталона. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ГАЗОМ (ПАРОФАЗНАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ) Принцип Стерилизация газом может использовать- ся для стерилизации первичных упаковочных материалов, оборудования и некоторых лекар- ственных препаратов. Важно обеспечить проникновение газа и вла- ги в стерилизуемый материал и в последующем процессе удаления газа – снижение содержания любых остатков газа или побочных продуктов реакции взаимодействия с газом до уровня, не вызывающего токсического эффекта при при- менении лекарственного препарата. Стерилизующие агенты Существуют основные категории газообраз- ных стерилизующих агентов, отличающихся своим антимикробным действием – алкилирую- щие агенты и окислители. Алкилирующие агенты – высокореак- тивные соединения, взаимодействующие со многими функциональными группами и компонентами, такими как аминные, сульф- гидрильные и гидроксильные группы в белках и пуриновые основания в нуклеиновых кис- лотах. К ним относится оксид этилена, ока- зывающий цитотоксическое, канцерогенное и мутагенное действие. Окислители – высокореактивные токсичные соединения. К ним относятся водорода пероксид и надуксусная кислота. Разработка и валидация процессов стерилизации Стерилизация газом выполняется путем воздействия на продукт стерилизующего агента в герметичной камере при определенных усло- виях.
Типичный процесс газовой стерилизации состоит из трех фаз: (предварительное) кон- диционирование, стерилизация и аэрация. Па- раметры, необходимые для этих фаз с целью достижения требуемого уровня обеспечения стерильности, устанавливают в процессе разра- ботки. Для определения оптимальных условий стерилизации используют комбинацию физиче- ских и биологических методов. Метод стерили- зации не должен нарушать функциональность продукта и (или) упаковки. Цикл стерилизации Для контроля температуры, влажности и концентрации газа может потребоваться специальное оборудование как в процессе вали- дации, так и процессе рутинной работы. Эффективность цикла Валидация должна подтвердить эффектив- ность определенного процесса относительно инактивации микроорганизмов для комбинации продукта и загрузки в стерилизаторе. Леталь- ность микроорганизмов при стерилизации газом может быть определена с использованием соот- ветствующего подхода: после градуированных по времени экспозиций скорость инактивации тест-микроорганизмов (значение величины D) может быть установлена путем построения кри- вой выживаемости или с использованием мето- да фракционно-негативного анализа. Биологические индикаторы должны об- ладать как минимум такой же устойчивостью к стерилизующему агенту, как и микробиологи- ческие контаминанты стерилизуемого продукта. Они должны быть размещены внутри продукта в местах, где условия стерилизации наиболее труднодостижимы. Эффективность процесса зависит от ряда па- раметров, включая концентрацию газа, темпера- туру, влажность, время экспозиции, конфигура- цию загрузки и характеристики продукта и его 103 упаковочных материалов. Влияние на эффек- тивность процесса любого изменения одного или нескольких из данных параметров должно быть исследовано. Рутинный контроль Регистрируют соответствующие параметры процесса, включая результаты испытания с ис- пользованием биологического индикатора. ХИМИЧЕСКАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ РАСТВОРАМИ Принцип Химическая стерилизация растворами при- меняется для стерилизации изделий, в конструк- ции которых использованы термолабильные материалы (например, полимерные или корро- зийно-стойкие материалы) и для которых в связи с их особенностями невозможно использовать другие способы стерилизации. Предметы, под- лежащие стерилизации, погружаются в раствор стерилизующего агента (химического веще- ства), после чего он должен быть удален спосо- бом, предохраняющим стерилизуемый предмет от повторной контаминации микроорганизма- ми. Повторная контаминация выходит за рамки обычного рассмотрения процесса стерилизации, но при химической стерилизации растворами принято включать этап удаления стерилизую- щего агента (независимо от того, достигается ли это физическими или химическими средствами) в общий процесс стерилизации вместе с любы- ми необходимыми дополнительными этапами для предотвращения повторной контаминации микроорганизмами. Конструкция изделия долж- на обеспечивать достаточный доступ стерилизу- ющего раствора и промывной жидкости ко всем стерилизуемым поверхностям изделия. Стерилизующие агенты Химическую стерилизацию проводят с ис- пользованием растворов кислот, оснований, аль- дегидов и сильных окислителей, которые при со- ответствующих условиях способны уничтожать бактерии и грибы, включая как вегетативные клетки, так и споры (например, растворы водо- рода пероксида и надкислоты). Эффективность стерилизации изделий зависит от концентрации стерилизующего агента, времени стерилизации и температуры стерилизующего раствора.
Поскольку общепризнанных биологических индикаторов для химической стерилизации рас- творами не существует, использование обычных мезофильных спорообразующих микроорганиз- мов, таких как Bacillus atrophaeus или Bacillus subtilis, является обычной практикой, так как они, вероятно, представляют собой изоляты бионагрузки для наихудшего случая. Использу- емые растворы различаются по стабильности в процессе стерилизации, эффективному диапа- зону pH, концентрации, температуре, требуе- мому времени контакта и возможному взаимо- действию с материалами. При выборе наиболее подходящего стерилизующего агента произво- дители должны учитывать его влияние на ма- териалы, компоненты упаковки, оборудование, как и во всех других процессах стерилизации. Производителям следует учитывать, что данные агенты являются высокотоксичными, и соответ- ствующие меры безопасности должны соблю- даться на всех этапах разработки цикла стери- лизации, валидации и рутинного использования. Цикл стерилизации Процесс стерилизации проводят в закрытых емкостях из стекла, полимерного материала или емкостях, покрытых неповрежденной эмалью, при полном погружении изделия в раствор на время стерилизации. После этого изделие промы- вают стерильной водой в асептических условиях. СТЕРИЛИЗУЮЩАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ Принцип Стерилизующая фильтрация используется для уменьшения содержания жизнеспособных и нежизнеспособных микроорганизмов и других частиц в газах и жидких продуктах, которые не могут быть подвергнуты стерилизации нагрева- нием или облучением. Как правило, такие продук- ты содержат субстанции для фармацевтического применения, которые не могут быть подвержены термической стерилизации в виду особенностей их строения и физико-химических свойств. В отличие от других методов стерилизации принцип стерилизующей фильтрации заключа- ется не в инактивации, а удержании микроорга- низмов фильтрами. Оборудование Стерилизующую фильтрацию осущест- вляют, используя мембранные фильтры в виде плоского фильтрующего материала (дисков) в соответствующих держателях или в виде кар- триджей. Оценка размера пор основана на кор- реляции между удерживающей способностью фильтра и результатами проверки целостности 104 фильтра. Эффективность процесса фильтрации зависит от многих факторов, например, фор- мы, размера пор, структуры, свойств поверхно- сти, структуры и расположения фильтрующего элемента, взаимодействия матрицы фильтра с продуктом, приложенного давления, потока и продолжительности процесса. Характери- стики фильтра должны быть определены при валидации для каждого конкретного продукта. Подходящие процедуры проверки целостности фильтра (например, измерение диффузионного потока, определение «точки пузырька» или ис- пытание на проникновение воды под давлением) используются в соответствии с рекомендациями производителей фильтров. В испытаниях при разработке должны быть подтверждены хими- ческая и физическая совместимость мембран с продуктом, подлежащим фильтрованию, и условия процесса фильтрации. Размер филь- тра должен соответствовать объему фильтруе- мого продукта и биологической нагрузке. Для стерилизации технологических газов устанавливают подходящую частоту проверок физической целостности фильтра. Эффективность фильтрации При валидации процесса стерилизации не- обходимо подтвердить, что процесс фильтрации (обычно в уменьшенной модели) способен пол- ностью удерживать микробную нагрузку подхо- дящего тест-микроорганизма, составляющую как минимум 1·107 КОЕ/см2 эффективной поверх- ности фильтра. Данное испытание должно мак- симально точно имитировать реальный процесс фильтрации.
По возможности испытание про- водят, используя продукт и указанные условия фильтрации. Если это невозможно, например, вследствие антимикробных свойств продукта, в испытании должна использоваться среда, мак- симально имитирующая продукт. Уровень филь- трации определяют как величину логарифма сни- жения контаминации микроорганизмами. Для процессов, использующих систему фильтрации с номинальным размером пор не более 0,22 мкм, рекомендуется суспензия Brevundimonas diminuta (ATCC 19146, NCIMB 11091 или CIP 103020). Суспензия Brevundimonas diminuta должна быть приготовлена так, чтобы содержать преимущественно одиночные клетки наименее возможного размера. Другие микро- организмы, например изоляты из бионагрузки, выделенные из рассматриваемого продукта или процесса, могут использоваться, если они пред- ставляют более серьезную угрозу для системы стерилизующей фильтрации, чем Brevundimonas diminuta. Для систем фильтрации с номиналь- ным размером пор 0,1 мкм или менее можно использовать суспензию Acholeplasma laylawii (ATCC 23206). Рекомендуется, чтобы процесс фильтра- ции проводился по возможности ближе к точке наполнения (месту фасовки). Стерилизация мембранных фильтров Мембранные фильтры могут стерилизовать- ся в автономном режиме или в составе линии. При стерилизации в автономном режиме проверяют проникновение пара и надлежащую защиту фильтра от контаминации. Фильтр после стерилизации устанавливают в асептических условиях на производственную линию согласно валидированной процедуре. При стерилизации фильтров в составе производственной линии обеспечивают про- никновение пара через фильтрующее обору- дование и для предотвращения повреждения мембраны контролируют перепад давления на фильтре. Процесс фильтрации Стерилизация мембранной фильтрацией осу- ществляется путем пропускания продукта через микропористую мембрану с номинальным разме- ром пор не более 0,22 мкм. Для каждой серии (партии) продукта перед стерилизацией определяется уровень контамина- ции микроорганизмами и применяются параме- тры процесса, установленные и утвержденные при разработке и валидации процесса фильтрации. Если с целью повышения эффективности про- цесса фильтрации используют несколько фильтров для уменьшения бионагрузки, фильтр, ближайший к точке наполнения в первичную упаковку, харак- теризуется как стерилизующий фильтр. Для предотвращения повторной контамина- ции продукта должны обеспечиваться стериль- ность и целостность оборудования после точки фильтрации, соблюдаться квалифицированные условия окружающей среды и валидированные процедуры асептического производства. Рутинный контроль Процессы фильтрации контролируют со- гласно определенным физическим и микробио- логическим параметрам, установленным в ходе процесса валидации: контаминация микроор- ганизмами до стерилизации, результаты испы- тания на целостность фильтра перед фильтра- 105 цией, продолжительность фильтрации, объем фильтруемой жидкости, результаты испытания на дифференциальное давление и целостность фильтра после фильтрации. ПРОИЗВОДСТВО В АСЕПТИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Принцип Целью асептического производства является поддержание стерильности продукта, состояще- го из компонентов, каждый из которых был под- вергнут стерилизации одним из вышеуказанных методов. Это достигается с помощью условий и процедур, предотвращающих контаминацию микроорганизмами. Асептическое производство может включать стадии асептического наполнения (асептическо- го розлива), лиофилизации в асептических ус- ловиях, асептического смешивания ингредиен- тов с последующим асептическим наполнением и укупоркой.
Разработка и валидация асептического производства Для сохранения стерильности компонентов и продукта необходимо уделять особое внимание: – состоянию производственной среды; – персоналу; – критическим поверхностям; – процедурам стерилизации упаковки и средств укупорки и передаточным процедурам; – максимальному сроку хранения продукта до наполнения в первичную упаковку. При валидации процесса осуществляют над- лежащие проверки всех процедур, указанных выше, а также периодическое моделирование процесса производства в асептических условиях с использованием питательной среды, которую затем инкубируют и проверяют на контамина- цию микроорганизмами. Кроме того, подходя- щий образец каждой серии (партии) любого про- дукта, полученного в результате асептического процесса, проверяют на стерильность (2.1.6.1). 203010006-2023 2.3.1.6. ПРИМЕНЕНИЕ F-КОНЦЕПЦИЙ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ Общая фармакопейная статья приводится для информации. Термическая стерилизация может быть про- ведена двумя методами: – стерилизация насыщенным паром (влаж- ная термическая стерилизация с использова- нием насыщенного пара или воды, нагретых до температуры стерилизации); – сухожаровая стерилизация с использовани- ем горячего воздуха с низким содержанием влаги. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Величина D (или величина десятичного умень- шения) – время в минутах, необходимое для обе- спечения снижения численности жизнеспособных тест-микроорганизмов при заданной температуре до 10 % от исходной численности тест-микроорга- низмов. Данная величина значима только для точно установленных экспериментальных условий. Величина z – изменение температуры в гра- дусах Цельсия, приводящее к изменению значе- ния величины D в 10 раз (величина z обозначает термоустойчивость микроорганизмов к измене- ниям температуры). Значение величины z рассчитывают по фор- муле: z = T2 – T1 lg D1 – lgD2 где: D1 — значение величины D при температуре Т1 в минутах; D2 — значение величины D при температуре Т2 в минутах; T — температура в градусах Цельсия. Величина F процесса термической стерили- зации (F0 для стерилизации насыщенным паром или FH для сухожаровой стерилизации) – харак- теризует летальность микроорганизмов с теоре- тическим значением величины z, приведенным в таблице 2.3.1.6.-1, и выражается в цифровых 106 величинах, эквивалентных времени в минутах, при стандартной температуре, достигнутой в стерилизационной загрузке. Общее значение величины F процесса, включающего стадию нагревания и охлажде- ния, можно рассчитать путем интегрирования (объединения) установленных норм летально- сти тест-микроорганизмов относительно вре- мени в дискретных температурных интервалах выше минимальной температуры, приведенной в таблице 2.3.1.6.-1. Значение величины F процесса рассчитыва- ют по формуле: F0 = D121 · ( lgN0 – lgN ) FH = D160 · ( lgN0 – lgN ) где: D121— значение величины D контрольных спор тест-микроорганизмов (2.3.1.7) при температуре 121 °С; D160— значение величины D контрольных спор тест-микроорганизмов (2.3.1.7) при температуре 160 °С; N0 — исходное число жизнеспособных микроорганизмов; N — конечное число жизнеспособных микроорганизмов. Для циклов стерилизации насыщенным паром и сухожаровой стерилизации, соответствующее значение величины F используют для подтвержде- ния того, что стабильно достигается требуемый уровень обеспечения стерильности не более 10-6 содержания жизнеспособных микроорганизмов. 203010007-2023 2.3.1.7. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ 1.
ВВЕДЕНИЕ В общей фармакопейной статье приведе- ны подходы к использованию биологических индикаторов, предназначенных для оценки эф- фективности процесса финишной стерилизации и процессов стерилизации упаковки и предме- тов, вступающих в непосредственный контакт со стерильной промежуточной продукцией, ак- тивной фармацевтической субстанцией, нерас- фасованной продукцией (далее – продуктом). Общая фармакопейная статья не распростра- няется на использование биологических инди- каторов для валидации процесса стерилизации иных объектов, не вступающих в непосред- ственный контакт со стерильным продуктом. Биологические индикаторы – системы, содержащие жизнеспособные тест-микроорга- низмы (обычно споры бактерий) и предназна- ченные для проверки требуемой эффективности процесса стерилизации. Биологические индикаторы применяют для разработки и валидации процессов стери- лизации. Данные индикаторы не предназначены для рутинного мониторинга, если иное не указано в данной общей фармакопейной статье. Биологические индикаторы промышлен- ного производства обычно содержат стандар- тизированную стабильную популяцию спор Таблица 2.3.1.6.-1. – Параметры для стерилизации насыщенным паром и сухожаровой стерилизации Стерилизация F Параметры стерилизации теоретическое значение величины z (°C) стандартная температура (°C) минимальная температура (°C) стерилизация насыщенным паром F0 10 121 110 сухожаровая стерилизация FH 20 160 140 107 подходящих бактерий, полученных из четко охарактеризованного и надлежащим обра- зом поддерживаемого штамма спорообразую- щих бактерий. Бактериальные споры являются устойчивыми формами жизнеспособных ми- кроорганизмов, которые можно производить и стандартизировать, а также хранить длитель- ный период времени при соблюдении соответ- ствующих условий. Эффективность стерилизации и пригодность биологических индикаторов можно подтвердить с помощью сокращенного цикла стерилиза- ции, при проведении которого небольшая часть тест-микроорганизмов в биологическом индика- торе способна выжить. При этом использование полного валидированного цикла стерилизации будет приводить к гибели жизнеспособных ми- кроорганизмов (см. раздел 4.1.2 данной общей фармакопейной статьи). 2. ТИПЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ ДЛЯ ПРОЦЕССОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ В зависимости от характера процесса стери- лизации могут использоваться разные типы био- логических индикаторов: – носители, инокулированные тест-микро- организмами; – автономные биологические индикаторы; – предметы или продукты, инокулированные тест-микроорганизмами. Перед использованием биологического ин- дикатора пользователь должен удостовериться, что характеристики биологического индика- тора отвечают установленным требованиям. С этой целью пользователь должен убедиться, что производство биологического индикатора осуществляется в рамках соответствующей си- стемы качества (например, посредством аудита), или проверить характеристики биологического индикатора самостоятельно или в независимой контрактной лаборатории (см. Предметы или продукты, инокулированные тест-микроорга- низмами). Носитель, инокулированный тест-микро- организмами, представляет собой носитель (удерживающий материал, например, полоска фильтровальной бумаги, стеклянная пластин- ка, полимерная пробирка), инокулированный определенной популяцией бактериальных спор. Данный вид биологического индикатора в боль- шинстве случаев находится в защитной оболоч- ке. После стерилизации носитель асептически переносят в подходящую питательную среду и инкубируют в течение достаточного периода времени при соответствующей температуре.
Тип носителя (оболочка, если используется) может влиять на устойчивость бактериальных спор и должен быть совместим с выбранным про- цессом стерилизации (например, полоски филь- тровальной бумаги в оболочке из подходящей бумаги часто используют для стерилизации па- ром и этиленоксидом, в то время как металли- ческие диски, упакованные в нетканый материал, – для стерилизации парами водорода пероксида). Автономные биологические индикаторы представляют собой, например: – систему, состоящую из инокулированного тест-микроорганизмом носителя и контейнера (например, ампулы) с питательной средой, под- ходящей для используемого тест-микроорга- низма. Система спроектирована таким образом, что стерилизующий агент вступает в контакт с носителем, содержащим инокулированные тест-микроорганизмы (например, через фильтр), а процесс стерилизации не оказывает неблаго- приятного воздействия на ростовые свойства питательной среды. После стерилизации носи- тель приводят в контакт с питательной средой простыми манипуляциями. Данный тип биоло- гических индикаторов может использоваться для оценки процессов стерилизации влажным паром, включая подтверждение проникновения пара в систему; – контейнер (например, ампулу), содержа- щую популяцию тест-микроорганизма в подхо- дящей питательной среде. После стерилизации контейнер инкубируют без дальнейших манипу- ляций. Данный тип биологического индикатора чувствителен только ко времени воздействия и температуре и может использоваться главным образом для контроля стерилизации водных жидкостей. Для удобства и упрощения обнару- жения роста тест-микроорганизмов среда может содержать индикатор (например, pH-индикатор). Автономные биологические индикаторы могут не подходить для валидации определен- ных процессов стерилизации. Предметы или продукты, инокулированные тест-микроорганизмами представляют собой предметы (например, резиновые пробки) или продукты, на или в которые инокулированы подходящие тест-микроорганизмы (например, 108 родов Bacillus или Clostridium) в тех случаях, когда для оценки эффективности стерилиза- ции отсутствуют биологические индикаторы промышленного производства. В этом случае пользователь может приготовить биологический индикатор, который представляет собой охарак- теризованную надлежащим образом суспензию спор, инокулированную на предмет или в про- дукт, подлежащие стерилизации. Как правило, тест-микроорганизмы ино- кулируют на или в предмет (продукт) в виде стандартизированной суспензии спор промыш- ленного производства или в виде охарактери- зованной суспензии спор, приготовленной из изолятов, полученных в процессе мониторинга окружающей среды или других микробиологи- ческих испытаний с четко определенной про- цедурой, обеспечивающей удовлетворительное спорообразование. Для суспензий спор должны быть определе- ны значение величины D (время для уменьше- ния количества тест-микроорганизмов в 10 раз (на 90 %) в указанных условиях) и при необхо- димости – значение величины z. Также значения величин D и z (если необходимо) спор должны определяться для тест-предметов или продук- тов, инокулированных тест-микроорганизмами, поскольку они могут отличаться от значений для спор в суспензии (см. раздел 4.1 данной общей фармакопейной статьи). По окончании цикла стерилизации биоло- гический индикатор проверяют на наличие или отсутствие живых тест-микроорганизмов или проводят подсчет живых тест-микроорганизмов с использованием подходящего валидированно- го микробиологического метода. 3.
ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ При поставке каждой серии биологического индикатора пользователю должна быть пред- ставлена следующая информация: – род и виды тест-микроорганизмов (вклю- чая номер коллекции типовых культур, если применимо); – уникальный номер, по которому может быть восстановлена история изготовления (например, номер серии); – количество жизнеспособных спор, выра- женное с точностью до одного десятичного зна- ка десятичного логарифма; – используемый метод восстановления; – тип носителя; – тип первичной упаковки (например, оболочка); – состав среды для восстановления, при необходимости (например, в случае автономных биологических индикаторов); – тип индикатора роста (например, индика- тор pH), при необходимости; – тип процесса стерилизации и условия, для которых был охарактеризован биологический индикатор; – устойчивость (величина D) для серии готового биологического индикатора к указан- ным процессам стерилизации в течение все- го отмеченного срока годности; значение вели- чины D должно быть указано в применимых единицах (например, время или доза) и выра- жаться с точностью до одного десятичного знака и 95 % доверительным интервалом, по возможности; – метод (метод кинетики летальности или метод фракционного негативного анализа), используемый для определения устойчивости (значения величины D); – параметры для проверки, например, усло- вия воздействия, количество повторных испыта- ний, среда и условия инкубации, используемые для восстановления после воздействия и др.; – значение величины z (если применимо) для биологического индикатора, выраженное в еди- ницах температуры с точностью до одного де- сятичного знака, включая диапазон температур, используемый для определения величины z; – условия хранения и дата истечения срока годности. 3.1. СПЕЦИФИКАЦИЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ Выбор биологического индикатора зави- сит от особенностей процесса стерилизации (влажный пар, сухой жар, газ или ионизирую- щее излучение). Выбор заключается в подборе штамма тест-микроорганизмов, типа биоло- гического индикатора, значения величины D и начального количества спор. Кроме того, ис- пытуемый штамм должен быть более устойчив к конкретному методу стерилизации, чем ми- кроорганизмы, потенциально контаминирую- щие продукт. 3.2. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА Контроль качества биологических инди- каторов заключается в проверке на чистоту и подлинность и оценке количества жизне- 109 способных клеток. Биологический индикатор должен соответствовать спецификациям поль- зователя. Пользователи, применяющие биоло- гические индикаторы вне рекомендаций произ- водителя, должны тщательно подбирать их по параметрам для конкретного процесса стерили- зации. Чистота Исследование тест-микроорганизмов на под- ходящей питательной среде, инкубированной в соответствующих условиях, не должно выяв- лять никаких признаков контаминации посто- ронними микроорганизмами. Идентификация При необходимости проверяют морфологию колоний и однородность популяции. Количество жизнеспособных микроорганизмов Подсчет жизнеспособных микроорганизмов производят в соответствии с инструкциями про- изводителя или любым другим валидированным методом. 3.3. ПРИГОДНОСТЬ Пользователь должен убедиться, что биоло- гический индикатор инактивирован до ожидае- мой степени выживаемости микроорганизмов в конкретном диапазоне условий стерилизации. 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССОВ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ 4.1. ПАРАМЕТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ ДЛЯ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ 4.1.1.
Величина z Процессы стерилизации можно проводить при температурах ниже стандартной 121 °C (при более длительном времени воздействия) или более высоких температурах (при бо- лее коротком времени воздействия). Величи- на z (разность температур, которая приводит к 10-кратному изменению значения величи- ны D биологического индикатора) использу- ется при сравнении эффективности двух ци- клов, работающих при разных температурах. Для определения величины z значение вели- чины D должно быть определено при трех или более значениях температуры. Предполагаемая температура процесса должна быть в пределах диапазона трех значений температур. Строят кривую зависимости десятичного логарифма значения величины D от температуры, выра- женной в градусах Цельсия. Величина z рав- на отрицательной обратной величине наклона кривой, построенной с помощью регрессион- ного анализа. 4.1.2. Установление параметров цикла стерилизации при валидации Характеристики процесса стерилизации (например, комбинация времени и температуры, требуемый уровень обеспечения стерильности или требуемая величина F0) являются основой для выбора биологического индикатора (тип биологического индикатора, тест-микроорга- низм и начальное количество жизнеспособных тест-микроорганизмов). Инактивация тест-микроорганизмов в ус- ловиях стерилизации может быть описана кинетикой летальности с учетом статисти- ческих вероятностей. Для ряда единиц био- логических индикаторов с исходной популя- цией тест-микроорганизмов на единицу N0 и заданным значением величины D рассчи- тывают время выживания и время гибели. Время выживания (ts) – время воздействия в минутах, по истечении которого во всех единицах биологического индикатора ожи- даемо присутствие выживших тест-микро- организмов (в среднем 100 выживших спор на единицу биологического индикатора), ко- торое рассчитывают по формуле (1): ts = D · ( lgN0 – 2) (1) Время гибели (tk) – время воздействия в ми- нутах, в течение которого все единицы биоло- гического индикатора ожидаемо должны быть инактивированы (в среднем 10-4 выживших спор на единицу биологического индикатора), кото- рое рассчитывают по формуле (2): tk = D · ( lgN0 + 4) (2) Целью валидации является подтвержде- ние эффективности стерилизации, ожидаемой на основании физических параметров процесс а, эквивалентной биологической эффективности стерилизации. C этой целью время экспозиции при валидации (tvl) не должно превышать значе- ние tk. Если выбрано слишком высокое значение tvl, даже относительно большое увеличение зна- чения величины D приводит к появлению еди- 110 ниц биологического индикатора без выживших тест-микроорганизмов. В данном случае неоп- тимальные условия стерилизации не будут об- наружены. Считается целесообразным выбрать значение tvl не выше требуемого, чтобы ожидать 1 из 1000 единиц биологических индикаторов с выжившими тест-микроорганизмами. Однако не должно быть выбрано слишком малое значе- ние tvl. Если выбрать tvl таким образом, что 50 % единиц биологического индикатора будут содер- жать выжившие тест-микроорганизмы, измене- ния в условиях стерилизации (например, время, температура) все еще могут привести к тому, что 100 % единиц биологического индикатора будут содержать выжившие тест-микроорганизмы, и испытание будет недействительным.
По этим причинам значение tvl выбирают таким образом, чтобы ожидаемая теоретическая выживаемость тест-микроорганизмов находилась между 10-1 и 10-3, и рассчитывают по формуле (3): D · ( lgN0 + 1) ≤ tvl ≤ D · ( lgN0 + 3) (3) В целом, биологические индикаторы под- вергаются предполагаемому процессу сте- рилизации, но для процессов стерилизации с избыточно высокой эффективностью рас- четная эффективность цикла может быть та- кой, что значение tk окажется превышено с большим запасом. В таких случаях валида- ция проводится с сокращенными циклами сте- рилизации. Сокращенные циклы могут быть короче во времени (например, полупериод) или проводиться при более низкой темпера- туре. В последнем случае значения величины z для тест-микроорганизма при фактических условиях стерилизации должны быть извест- ны. Сокращенный цикл выбирают так, чтобы температура была не более чем на одно зна- чение величины z ниже контрольной темпера- туры процесса стерилизации. Биологические индикаторы соответствующей устойчивости для этого цикла показывают ожидаемую вы- живаемость тест-микроорганизмов в диапазо- не между нижним значением tvl и значением tk (см. формулу (3)). Решение не проводить дан- ное испытание должно быть обоснованным. В зависимости от значения величины D тест-микроорганизма и выбранного значения tvl в биологических индикаторах содержание выживших тест-микроорганизмов можно ожи- дать с низкой частотой (не более 1 из 10). Если подтверждается, что частота биологических индикаторов, содержащих выжившие тест-ми- кроорганизмы, находится в пределах ожидаемого диапазона и не связана с неподходящими услови- ями стерилизации, процесс может быть одобрен. При валидации полного цикла стерилиза- ции все биологические индикаторы должны быть инактивированы, что доказывает снижение количества тест-микроорганизмов не менее чем в 106 раз. В этом случае, исходя из устойчиво- сти используемых спор, можно сделать вывод, что процесс обеспечил достаточную летальность для достижения требуемого уровня стерильности. 4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ (АВТОКЛАВИРОВАНИЯ) Для оценки процесса паровой стерилиза- ции наиболее широко используемыми биологи- ческими индикаторными тест-микроорганиз- мами являются Geobacillus stearothermophilus. Указанные значения величины D121°C для спор в зависимости от условий споруляции, мате- риала носителя, на который инокулированы споры, первичной упаковки, окружающей но- ситель с инокулированными спорами, и окру- жающей среды во время стерилизации нахо- дятся, как правило, в диапазоне от 1,5 мин до 4,5 мин. Подходящими штаммами микроорганизмов являются ATCC 7953, NCTC 10007, CIP 52.81, NCIMB 8157 и ATCC 12980 (эквивалент NRRL B-4419). Могут быть использованы другие штаммы, если подтверждена эквивалентность их характеристик. Доказано, что популяция Geobacillus stearothermophilus в количестве 105 или 106 может не подходить для процессов сте- рилизации при значении F0 между 8 и 15, поэ- тому может быть использовано меньшее число спор (103 или 104) или другие тест-микроорга- низмы. Если используют тест-микроорганиз- мы, отличные от Geobacillus stearothermophilus (например, Bacillus subtilis ATCC 35021), для гарантии пригодности для процесса оценивают их устойчивость. 4.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА СУХОЖАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ Для оценки процессов стерилизации сухим жаром, проводимых при температурах от 160 °C 111 до 180 °C подходят споры Bacillus atrophaeus (например, ATCC 9372, NCIMB 8058, NRRL B-4418 или CIP 77.18).
Если используют тест-ми- кроорганизмы, отличные от Bacillus atrophaeus, для подтверждения пригодности оценивают их устойчивость к процессу стерилизации, как описано в разделе 4.1.2 данной общей фармако- пейной статьи. Как правило, биологические индикаторы, пригодные для стерилизации сухим жаром, имеют значение величины D160 в диапазоне от 1 мин до 5 мин. При воздействии стан- дартного цикла продолжительностью 2 ч при температуре 160 °C биологический индикатор со значением величины D160, равным 2,5 мин, бу- дет инактивирован на 48 по шкале десятичного логарифма. Для процессов стерилизации сухим жаром при расчетах эквивалентности эффектив- ности цикла (FH-расчеты) обычно значение ве- личины z принимается около 20 °C. FH представ- ляет собой эквивалентное время в минутах при температуре 160 °C, достигаемой в продукте при его стерилизации в первичной упаковке. Для биологического индикатора со значением вели- чины D160, равным 5 мин, значение величины D150 составит около 16 мин, инактивация в кон- трольном цикле – 7,5 единиц по шкале десятич- ного логарифма. Использование процесса стери- лизации при температуре, сниженной на 10 °C по сравнению с заданной температурой, мо- жет выдать ожидаемую 1 из 30 единиц биоло- гических индикаторов, имеющих выжившие тест-микроорганизмы. 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА СТЕРИЛИЗАЦИИ ГАЗОМ (ПАРОФАЗНОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ) Использование биологических индикаторов необходимо для разработки, валидации и мони- торинга всех процессов газовой стерилизации. Газовая стерилизация является многофактор- ным процессом, где концентрация газа, влаж- ность, температура, время и характеристики по- верхности взаимодействуют сложным образом. В настоящее время в процессе газовой стерили- зации используют этиленоксид, водорода перок- сид и надуксусную кислоту или их комбинации. Обеззараживание поверхности газом ши- роко используют для медицинских приборов, изоляторов, камер и др. Использование биоло- гических индикаторов для данных целей не рас- сматривается в рамках Фармакопеи Союза, при этом приведенная информация общей фармако- пейной статьи может пригодиться при валида- ции процессов дезинфекции. Для стерилизации этиленоксидом рекомен- дуется использование спор Bacillus atrophaeus (например, ATCC 9372, NCIMB 8058, NRRL B-4418 или CIP 77.18). Могут быть исполь- зованы другие штаммы, если подтверждена эквивалентность их характеристик. Количество жизнеспособных спор должно быть не менее 106 на носитель. Тест-микроорганизмы должны иметь величину D, соответствующую процес- су валидации. Данные биологические индика- торы обычно используют в рутинной практике в каждом цикле стерилизации, что позволяет контролировать эффективность процесса. Для процессов с испарением водорода перок- сида подходит Geobacillus stearothermophilus. Пользователь несет ответственность за уста- новленные условия цикла стерилизации и при- годности любого используемого биологического индикатора. 6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА РАДИАЦИОННОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ Для проверки стерилизующей дозы при радиационной стерилизации нет необходимо- сти использования биологических индикаторов, если не указано иное. Однако использование биологических индикаторов может потребовать- ся для разработки и валидации процесса стери- лизации ионизирующим излучением некоторых продуктов, например, содержащих клетки или ткани, или продуктов, потенциально способных обеспечить защиту для спор. Рекомендуются к использованию споры Bacillus pumilus (напри- мер, ATCC 27142, NCTC 10327, NCIMB 10692 или CIP 77.25).
Допускается использование дру- гих штаммов, если подтверждена эквивалент- ность их характеристик. 7. ВЫБОР БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ ДЛЯ ПРОЦЕССА СТЕРИЛИЗАЦИИ Кроме физических параметров стерилиза- ции, описанных в общей фармакопейной ста- тье 2.3.1.5. Методы обеспечения стерильности 112 продуктов, эффективность процесса стерили- зации зависит от большого числа переменных, например, от количества и устойчивости конта- минирующих микроорганизмов, проникновения стерилизующего агента, времени, температуры, концентрации, pH, содержания влаги и химиче- ского состава стерилизуемого продукта. Для валидации процесса стерилизации выби- рают физические условия, при которых ожидают достижения уровня обеспечения стерильности не более 10-6 содержания жизнеспособных микро- организмов (2.3.1.5). В процессе проверки физи- ческих условий подтверждают их однородность для всех частей и положений загрузки. Целью валидации является подтверждение корреляции между прогнозируемым влиянием физических условий, применяемых в ходе процесса, и наблю- даемым биологическим воздействием (эффектом) на биологические индикаторы. Использование параметров процесса, подтвердивших требуемый биологический эффект, обеспечит стерильность полученного продукта при рутинном процессе. Выбор используемого биологического инди- катора зависит от: – природы стерилизующего агента (напри- мер, тепла, газа или излучения); – ожидаемой эффективности обработки (например, от значения величины Fphys, рассчи- танной по параметрам процесса); – условий процесса (например, температу- ры, времени, относительной влажности, концен- трации газа, дозы облучения); – характеристик продукта или предметов, подлежащих стерилизации (например, продукт в первичной упаковке, упаковочный материал, другие объекты: посуда, трубки или насосы). При разработке процесса стерилизации оце- нивают продукт и его загрузку для определения наиболее труднодоступных для стерилизующего агента мест (например, холодные участки загруз- ки, система упаковка – укупорка, труднопроходи- мые участки). При выборе оптимальной схемы биологической проверки для процесса стерилиза- ции, условия стерилизации, положения в загрузке и продукт должны быть подобраны по возможно- сти ближе к наихудшему случаю. 203010008-2023 2.3.1.8. ЗАМЕНА МЕТОДОВ IN VIVO НА МЕТОДЫ IN VITRO ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВАКЦИН В общей фармакопейной статье приведены рекомендации по внедрению методов in vitro вместо существующих методов in vivo в случа- ях, когда непосредственное сравнение испыта- ний не применимо по причинам, не имеющим отношения к пригодности одного или более ме- тодов in vitro, но не приведены детали валида- ции методик испытаний. Общая фармакопейная статья в первую очередь, применима к вакцинам, но представленные принципы замены подходят и для других биологических препаратов, таких как иммунные сыворотки. ВВЕДЕНИЕ Методы испытаний, используемые для рутин- ного контроля качества вакцин, предназначены для мониторинга постоянства процесса производ- ства и обеспечения сопоставимости характери- стик качества между промышленными сериями и сериями, которые были признаны безопасными и эффективными в клинических исследованиях. Испытания безопасности и активности вак- цин in vivo исторически играли центральную роль в обеспечении качества вакцин, но прису- щая результатам испытаний in vivo вариабель- ность может делать их менее подходящими для мониторинга стабильности процесса производ- ства и для оценки потенциального влияния из- менений в производстве на качество, чем над- лежащим образом разработанные испытания in vitro.
Методы для испытаний in vitro (вклю- чая иммунологические, молекулярные, биохи- мические) вместо испытаний in vivo разраба- тывают в случае, когда проведение испытаний in vivo должно быть ограничено по этическим соображениям или не обеспечивает получение значимых результатов. Использование соот- ветствующих методов in vitro не только сокра- щает использование животных, сохраняя или даже улучшая научную значимость испытаний, но также существенно снижает вариабельность испытаний, время и необходимые ресурсы, а также повышает прогнозируемость выпуска безопасных и эффективных вакцин. 113 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ Одной из проблем замены методов in vivo, связанной с их вариабельностью, на более ста- бильные методы in vitro является требование обеспечения сопоставимости испытаний. В некоторых случаях это может вызвать трудно- сти, так как результаты повторных испытаний в рамках многоцентровых международных ис- следований могут быть несопоставимы из- за изменчивости, присущей методам in vivo. Многие из давно применяемых методов ис- пытаний безопасности и активности вакцин in vivo, как правило, доказали свою пригодность и необходимость в обеспечении безопасности и эффективности вакцин. Так как требования к валидации методов появились позднее мно- гих методов испытаний, формальное сравне- ние испытаний один-к-одному затруднительно, а, в некоторых случаях, даже невозможно. По- скольку прецизионность, воспроизводимость, пределы обнаружения и количественного опре- деления не устанавливались для метода in vivo, становится трудно оценить сопоставимость од- ного метода с другим. Так как в соответствии с разделом 1. Общие сведения Фармакопеи Союза фармакопейные методики считаются валидированными, в настоящее время ввиду не- обходимости использования большого количе- ства лабораторных животных, не только непрак- тично и чрезмерно дорого, а также неэтично проводить их ретроспективную валидацию. При рассмотрении перехода от системы кон- троля качества на основе in vivo к системе кон- троля качества на основе in vitro важно понимать возможности испытания in vivo. Надлежащим образом проведенные испытания активности in vivo на лабораторных животных дают воз- можность измерить сложные функциональные реакции, но не обязательно предсказывают фак- тические ответы в целевой группе. Кроме того, испытания in vitro могут имитировать опреде- ленные элементы функциональных реакций in vivo с более низкой вариабельностью и более высокой чувствительностью. Другая проблема состоит в том, что, когда испытание in vivo для данного лекарственного препарата должно быть заменено испытанием in vitro, параметры качества лекарственного пре- парата, вероятно, будут оцениваться по-другому. Например: определение содержания антигена или функциональный ответ (нейтрализация ви- руса или токсина) в биологическом испытании in vitro вместо оценки эффективности in vivo; определение нуклеотидной или аминокислот- ной последовательности вместо нейровиру- лентности in vivo или ослабленного фенотипа; определение отсутствия геномов посторонних агентов методами молекулярной биологии вме- сто определения отсутствия микроорганизмов в тестах in vivo; определение связывания токсина и ферментативной активности вместо опреде- ления специфической токсичности in vivo. Как правило, доказательство соответствия между двумя методами испытаний не является науч- но обоснованным и не всегда прогнозируемо. Даже, если результаты двух испытаний по кри- терию «годен – не годен» совпадают, корреля- ция между двумя количественными методами в диапазоне испытания все еще может быть низ- кой.
Методы или стратегия испытания in vitro должны гарантировать, что ключевые параме- тры качества, необходимые для уверенности в постоянстве безопасности и эффективности лекарственного препарата, должным образом контролируются. Несмотря на то, что общая фармакопейная статья приводит подходы по замене существу- ющих методов испытаний зарегистрированных лекарственных препаратов, важно при разра- ботке лекарственного препарата учитывать воз- можность использования для контроля качества методов in vitro, и что использование испытаний in vivo не является обязательным. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ЗАМЕНЫ МЕТОДОВ IN VIVO Основное внимание при внедрении любых предложенных методов in vitro в рамках системы контроля качества должно быть уделено науч- ной значимости испытаний in vitro для контроля соответствующих характеристик качества. Кро- ме того, любые методы in vitro должны соответ- ствовать современным требованиям валидации. Испытания in vivo для вакцин обычно заменя- ют испытаниями in vitro после многоцентровых совместных исследований, но для отдельных лекарственных препаратов это не является обя- зательным условием. Также не является обяза- тельным требованием иметь одни и те же ис- пытания, широко применимые к определенной группе лекарственных препаратов. В некоторых случаях, для оценки ключевых качественных 114 и количественных характеристик, измеряемых су- ществующим методом, может потребоваться заме- нить его более чем одним испытанием in vitro. ИСПЫТАНИЕ АКТИВНОСТИ В случае, когда невозможно установить соответствие между результатами методов in vitro и in vivo из-за низкой разрешающей спо- собности и (или) высокой вариабельности испы- тания in vivo, можно использовать следующий подход. Предполагают, что испытуемый лекар- ственный препарат имеет надлежащим образом установленный профиль безопасности и эффек- тивности при промышленном производстве. Испытания in vitro должны позволять обна- руживать различия, при соответствующем науч- но обоснованном контроле производственного процесса. Это должно быть подтверждено дан- ными о способности предлагаемых испытаний контролировать ключевые характеристики каче- ства вакцины и отражать соответствие между ка- чеством серий, подлежащих выпуску, и сериями, признанными безопасными и эффективными в ходе клинических исследований или рутинных испытаний. Разработка соответствующих спец- ификаций с использованием методов in vitro позволит обеспечивать постоянство процесса производства. При разработке испытаний для кон- троля качества вакцины необходимо учитывать, что они должны отражать как содержание антигена, так и его функциональность. Если используется один метод, он должен предпочтительно изме- рять содержание и целостность антигена путем таргетного связывания эпитопов, относящихся к защите, обеспечиваемой вакциной. Например, моноклональное антитело или моноклональные антитела против эпитопа или эпитопов как ос- новные мишени для создания нейтрализующих антител. Эпитоп или эпитопы предпочтительно должны быть конформационными, чтобы можно было провести испытание, указывающее на ста- бильность (например, вакцина для профилактики бешенства). В некоторых случаях единственный метод in vitro не может адекватно отражать и со- держание, и функциональность. В таком случае используют несколько испытаний, как, например, для конъюгированных полисахаридных вакцин, где используют соответствующие измерения раз- мера молекул, целостности конъюгата, общих и свободных полисахаридов. Для проведения количественных измерений методом in vitro необходимы образцы, которые различаются по величине ответа.
В большин- стве случаев образцы, активность которых ниже минимальной утвержденной в спецификации при использовании метода in vivo, не доступ- ны для использования, потому что постоянство состава лекарственного препарата, как прави- ло, хорошо поддерживается, а активность меж- ду сериями существенно не отличается и (или) точность испытания in vivo такова, что он не может дифференцировать серии, если разница не очень велика. Первоначальную оценку испы- тания проводят с образцами различных концен- траций, после чего можно проводить испытание образцов, подвергавшихся воздействию различ- ных типов стрессовых условий, чтобы дополни- тельно установить возможность новым методом оценивать стабильность лекарственного препа- рата. Невозможность подтвердить соответствие между методами in vitro и in vivo не обязатель- но означает, что метод in vitro не пригоден. Во многих случаях метод in vitro позволяет обна- руживать изменения в лекарственном препара- те, которые не могут быть обнаружены методом in vivo. В таких случаях метод in vitro может считаться лучшим для мониторинга стабильно- сти процесса производства и может быть более подходящим для оценки влияния изменений в производстве на качество вакцины. ИСПЫТАНИЯ НА БЕЗОПАСНОСТЬ Специфическая токсичность Метод обнаружения остаточных токсичных компонентов in vitro должен быть специфичным и более чувствительным, чем существующий метод in vivo. По возможности следует исполь- зовать полнофункциональную систему in vitro (например, линию токсин-чувствительных кле- ток). Если функциональная система in vitro не- доступна, стратегия испытания in vitro может быть основана на последовательном определе- нии (измерении) более одного параметра, где это необходимо, так, чтобы они отражали способ воздействия рассматриваемых токсичных ком- понентов. Например, использование испытаний на основе иммунологических и биохимических методов для определения связывания рецептора и (или) активности фермента. В большинстве случаев, когда необходимо заменить испытание in vivo, будут доступны данные о чувствительно- сти этой модели для обнаружения рассматривае- мого токсина. Новые методы in vitro могут быть охарактеризованы с использованием метода 115 добавок и использованием архивных сведений об испытаниях in vivo для подтверждения их до- статочной чувствительности. Такие испытания в сочетании с соответствующими временными и температурными условиями также могут быть использованы для подтверждения отсутствия реверсии специфического токсина. Метод массового параллельного секвенирования молекулы взамен испытания на нейровирулентность Существующее испытание на нейровиру- лентность in vivo может быть заменено геноти- пическим методом оценки нуклеотидной или аминокислотной последовательности вирусной вакцины in vitro. Для любого метода генотипи- рования in vitro необходимы глубокие знания о молекулярных маркерах, ответственных за ослабление живой вирусной вакцины (напри- мер, пероральная вакцина для профилактики полиомиелита живая). И тогда для мониторинга соответствия серий вакцины можно использо- вать определение наличия требуемых маркеров молекулярной аттенуации и процентного содер- жания мутантов с помощью таких методов, как массовое параллельное секвенирование. Новые методы молекулярной биологии для обнаружения посторонних вирусных агентов Обнаружение посторонних вирусных аген- тов в банках клеток, посевном материале (по- севной культуре вируса), биомассе вируса в настоящее время проводят с использованием ряда методов in vivo и in vitro на разных этапах производственного процесса.
Доступны новые чувствительные методы молекулярной биоло- гии с широкими возможностями обнаружения, в том числе: методы массового параллельного секвенирования или высокопроизводительного секвенирования, полимеразная цепная реакция с вырожденными праймерами для семейств ви- русов или методы случайного праймирования (связанные или не связанные с секвенировани- ем), гибридизация с множеством олигонуклео- тидов, масс-спектрометрия. Использование этих новых методов молекулярной биологии позво- лило установить пробелы в существующей стра- тегии испытаний, так как были выявлены ранее необнаруживаемые вирусные контаминанты в готовом нерасфасованном продукте, банках клеток, из которых он был произведен, и на про- межуточных стадиях производства. Новые мето- ды молекулярной биологии (например, массовое параллельное секвенирование или высокопро- изводительное секвенирование) обнаруживают геномы вирусов, в то время как существую- щие методы in vivo основаны на наблюдениях за эффектами вирусов на экспериментальных животных. При замене методов in vivo новыми методами молекулярной биологии необходимо сравнение специфичности и чувствительности новых и существующих методов. Для этого соз- дают соответствующую группу репрезентатив- ных хорошо охарактеризованных модельных вирусов для оценки способности нового метода обнаруживать вирусы, которые обнаруживают- ся (или не обнаруживаются) методами in vivo, и для определения того, что их чувствительность не хуже чувствительности методов in vivo. Этот последний аспект является особенно сложным, так как новые методы молекулярной биологии обнаруживают характеристики вирусного конта- минанта, отличные от обнаруживаемых методом in vivo (геном для методов молекулярной биоло- гии по сравнению с инфекционным вирусом для методов in vivo), а также отсутствуют данные по валидации для методов in vivo или имеются в ограниченном объеме. Результат новых ме- тодов молекулярной биологии не является окончательным, так как обнаружение гено- ма или фрагментов генома не обязательно указывает на присутствие инфекционного вируса. 116 203190002-2023 2.3.19.2. ПРОДУКТЫ С РИСКОМ ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГУБЧАТОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ ЖИВОТНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Продукты с риском передачи возбудителей губчатой энцефалопатии животных представля- ют собой продукты, полученные из тканей или секретов животных, восприимчивых к губчатой энцефалопатии, за исключением эксперимен- тально вызванных заболеваний. Требования общей фармакопейной статьи распространяются на все субстанции для фар- мацевтического применения и лекарственные препараты: – полученные от таких животных; – содержащие активные фармацевтические субстанции или вспомогательные вещества, полученные от таких животных; – произведенные с использованием продук- тов (например, сырья, исходных материалов или реактивов, включая питательные среды), полученных от таких животных. ПРОИЗВОДСТВО Производство должно осуществляться в соответствии с требованиями общей статьи 2.3.19.3. Минимизация риска контаминации лекарственных средств инфекционными аген- тами прионных заболеваний. 203190003-2023 2.3.19.3. МИНИМИЗАЦИЯ РИСКА КОНТАМИНАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ИНФЕКЦИОННЫМИ АГЕНТАМИ ПРИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Настоящая общая фармакопейная статья приводится для информации. Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (transmissible spongiform encephalopathies, TSE, далее ‒ ТГЭ) представляют собой группу хро- нических нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся накоплением аномальных изоформ клеточного гликопротеина (приона).
Прион или белковая инфекционная частица (proteinacious infectious particle, prion), или при- онный белок (prion protein, PrP) представляет собой измененную изоформу белка (за счет ано- мальной трехмерной структуры). Инфекцион- ная изоформа PrPTSE способна превращать нор- мальный белок PrPc в инфекционную изоформу, изменяя его конформацию (третичную структу- ру). Аномальная изоформа РrР (PrPTSE) отлича- ется от нормальной РrР (РrРc) устойчивостью к протеазе и денатурации высокой температу- рой. Именно PrPTSЕ является инфекционным агентом, вызывающим развитие ТГЭ. К заболеваниям ТГЭ относят: – губчатую энцефалопатию (ГЭ) крупного рогатого скота (КРС); – скрейпи овец и коз; – хроническую изнуряющую болезнь у се- мейства оленьих (олени и лоси); – трансмиссивную энцефалопатию норок, выращиваемых на фермах; – губчатую энцефалопатию кошачьих (особен- но у домашних кошек и больших животных семей- ства кошачьих, содержащихся в неволе); – губчатую энцефалопатию экзотических копытных в зоопарках. Виды животных, естественно восприим- чивые к заражению агентами ГЭ или воспри- имчивые к заражению путем введения внутрь, за исключением человека и приматов, определя- 2.3.19. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА 117 ют как ТГЭ-релевантные виды животных. К ним относят КРС, овец, коз. У человека ГЭ включают различные формы болезни Крейтцфельда-Якоба, Куру, болезнь (синдром) Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, фатальную семейную бессонницу. В настоящее время известно три варианта возникновения прионных заболеваний: прямое заражение, наследственные и спорадические (возникающие спонтанно) формы. Способ- ность к трансмиссии зависит от происхождения (вида животных), штамма приона, дозы, путей введения и, у некоторых видов, принимающей аллели PRNP гена в результате мутаций в гене PRNP, обусловливающих образование PrPTSE из PrPc (наследственные формы). Определен- ный комплекс естественных барьеров огра- ничивает межвидовое распространение ТГЭ, но при соответствующих условиях видовые барьеры могут быть преодолены. Прионная форма белка чрезвычайно ста- бильна и накапливается в пораженной ткани, вызывая ее повреждение и в конечном счете гибель. Стабильность прионной формы белка означает, что прионы устойчивы к денатура- ции под действием химических и физических агентов. Возбудитель ГЭ КРС исключитель- но резистентен ко всем мерам борьбы, обычно инактивирующим такие инфицирующие агенты, как бактерии, вирусы, включая термическую об- работку. Обычные меры инактивации неэффек- тивны в отношении ГЭ КРС. В настоящее время наиболее эффективным способом борьбы с ГЭ является исключение из использования матери- алов, полученных из ТГЭ-релевантных видов животных. Однако использование продуктов животного происхождения необходимо для про- изводства некоторых лекарственных препара- тов, что делает полное исключение риска невоз- можным. В связи с этим меры, принимаемые для управления риском передачи ГЭ КРС, сводятся к минимизации риска, а не его исключению. 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Общая фармакопейная статья распростра- няется на все сырье и материалы, имеющие животное или человеческое происхождение, используемые в процессе производства лекар- ственных средств и (или) входящие в состав лекарственных средств. Рекомендации общей фармакопейной статьи также применимы к ма- териалам, непосредственно контактирующим с лекарственным средством или оборудованием, применяемым в производстве лекарственного средства, что обусловливает риск контаминации.
Требования к снижению риска передачи воз- будителей ГЭ животных устанавливаются упол- номоченным органом в соответствии с правом Союза и критериями оценки статуса страны, установленными Всемирной организацией здо- ровья животных (World Organisation for Animal Health, WOAH). 2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2.1. ИСХОДНОЕ СЫРЬЕ И ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ Материалы, получаемые от ТГЭ-релевантных видов животных, используемые для получения активных фармацевтических субстанций, вспо- могательных веществ и адъювантов, исходного сырья, исходных материалов и реактивов, и при- меняемые в производстве лекарственных средств должны оцениваться на риск передачи ГЭ. В качестве источника материалов рекомен- дуется использовать молодых животных. Материалы, такие как чистящие агенты, смягчители и смазывающие вещества, с кото- рыми контактирует лекарственное средство при стандартном технологическом процессе, или на последней стадии, или в первичной упаковке, должны быть получены из производных твер- дых жиров при строгом соблюдении физико-хи- мических процессов, описанных в разделе 5 данной общей фармакопейной статьи. Сырье и материалы животного происхожде- ния, используемые в производстве лекарствен- ных средств, в том числе при получении посев- ного материала и банков клеток, должны иметь подтверждающие документы о минимизации риска передачи ГЭ или документы о результатах оценки риска передачи ГЭ. 2.2. ПОСЕВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ, БАНКИ КЛЕТОК И ПРОДУКТЫ ФЕРМЕНТАЦИИ Посевные материалы и банки клеток, исполь- зуемые для производства лекарственных препа- ратов, должны оцениваться на риск передачи ГЭ. Риск передачи ГЭ возможен для посевных материалов и банков клеток, используемых в производстве: – вакцинных антигенов; – лекарственных препаратов, полученных 118 с использованием биотехнологических процессов; – других лекарственных препаратов, в про- цессе производства которых используются си- стемы посевных материалов или банков клеток, уже утвержденных для производства компонен- тов зарегистрированного лекарственного препа- рата. Если материалы, полученные от ТГЭ-реле- вантных видов животных, используют в процессах получения продуктов ферментации или посевных материалов и банков клеток, они должны полно- стью соответствовать требованиям права Союза. 2.3. ПРИНЦИПЫ МИНИМИЗАЦИИ РИСКА При наличии у производителя выбора пред- почтительным является использование мате- риалов, полученных не от ТГЭ-релевантных видов животных или источника неживотного происхождения. Использование материалов, полученных от ТГЭ-релевантных видов живот- ных, вместо материалов не от ТГЭ-релевантных видов животных или материалов неживотно- го происхождения, должно быть обоснованно. Если необходимо использование материалов от ТГЭ-релевантных видов животных, должны быть приняты все необходимые меры по мини- мизации риска передачи ГЭ. В настоящее время доступные диагности- ческие наборы для выявления ГЭ-инфекции in vivo отсутствуют. Диагноз основывается на посмертном подтверждении характерных мозго- вых повреждений при помощи гистологических данных и (или) обнаружением PrPTSE методом Вестерн-блоттинга или иммунологических ана- лизов. Также для подтверждения наличия ин- фекционного агента ГЭ используют введение подозрительной ткани чувствительным видам лабораторных животных. Однако вследствие длительных инкубационных периодов всех агентов ГЭ результаты испытаний in vivo полу- чают только по истечении месяцев или лет.
Способность иммунохимических испыта- ний к обнаружению PrPTSE в посмертных образ- цах выявлять зараженных животных зависит от времени забора образца по отношению к сроку заражения, типа собранной ткани, полученной инфекционной дозы в сопоставлении со срока- ми наступления клинических проявлений забо- леваний. Хотя скрининг источников среди животных при помощи in vitro испытаний может предот- вратить использование животных на поздних стадиях инкубационного периода заболевания и обеспечить информацией об эпидемиологиче- ском статусе данной страны или региона, испы- тания, пригодные для однозначного подтвержде- ния незараженности животного, отсутствуют. Минимизация риска передачи ГЭ базирует- ся на следующих взаимодополняющих параме- трах: – источники заражения животного проис- хождения и их географическое происхождение; – природа материала животного происхож- дения, используемого в производстве, и выпол- нение процедур по предупреждению перекрест- ной контаминации продуктами с более высоким уровнем риска; – процессы производства, включая наличие системы качества, гарантирующие однород- ность и контролируемость продукта. 2.4. ИСТОЧНИКИ ЗАРАЖЕНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ГЭ КРС представляет собой одну из груп- пы заболеваний, которые поражают целый ряд млекопитающих. Заболевания, известные как ГЭ или прионные болезни, являются след- ствием накопления аномальных прионных про- теинов в головном мозге и нервной системе. В качестве источника сырья и (или) материа- лов, используемых при получении продуктов для производства лекарственных препаратов, долж- ны быть животные, пригодные для применения в качестве продуктов питания человека и выдер- жавшие до и после убоя проверку на соответствие требованиям права Союза или аналогичным тре- бованиям третьих стран, за исключением матери- алов, полученных от живых животных, которые должны быть признаны здоровыми по результа- там клинического обследования. 2.4.1. География источников заражения 2.4.1.1. Материалы от крупного рогатого скота Всемирная организация здоровья животных устанавливает критерии для оценки состояния стран в отношении ГЭ КРС в Международ- ном кодексе здоровья животных. Страны или регионы классифицируют следующим образом: Категория А ‒ страны или регионы с незна- чительным риском ГЭ КРС; Категория В ‒ страны или регионы с контро- лируемым риском ГЭ КРС; Категория С ‒ страны или регионы с неопре- деленным риском ГЭ КРС. 119 Таблица 2.3.19.3.-1. ‒ Категории тканей животных в отношении их инфекционности Категория IА Ткани с высокой инфекционностью ткани центральной нервной системы (ЦНС), достигающих высоких титров инфекционности на поздних стадиях ГЭ, и некоторые ткани, анатомически связанные с ЦНС Категория IB Ткани с низкой инфекционностью периферические ткани с положительными тестами на инфекционность и (или) PrPTSE по меньшей мере на одну форму ГЭ Категория IC Ткани с неопределяемой инфекционностью ткани, при исследовании которых на инфекционность отсутствовала какая-либо определяемая инфекционность и (или) были получены отрицательные результаты на PrPTSE В общей фармакопейной статье используют классификацию ГЭ КРС, основанную на прави- лах Всемирной организации здоровья животных. Животные, при наличии выбора произво- дителя, должны быть получены из стран с не- значительным риском ГЭ КРС (категория А), если использование продуктов из стран с более высоким риском ГЭ КРС не является оправдан- ным. При использовании животных из стран с неопределенным риском ГЭ КРС всегда долж- но быть представлено обоснование. 2.4.1.2.
Овцы и козы (мелкий рогатый скот) Во многих странах мира в природе зареги- стрированы клинические случаи заболевания мелких жвачных животных скрейпи. В связи с тем, что ГЭ у овец и коз может быть ошибочно принята за скрейпи, в качестве меры предосто- рожности при анализе источников продуктов, полученных от мелкого рогатого скота, учи- тывается масштаб распространения в стране как ГЭ КРС, так и скрейпи, а также тип тканей, из которых получены материалы. Для овец вследствие опасений, касающих- ся возможности их заражения ГЭ при созда- нии стад, свободных от ГЭ, можно рассматри- вать возможность использования генотипов, показывающих устойчивость к инфекции ГЭ и (или) скрейпи. Однако возможность того, что генотипы, устойчивые к скрейпи, окажут- ся подвержены ГЭ (экспериментальное введе- ние внутрь) или атипичной скрейпи (случаи в природе), также должна быть принята во внимание. Козы являются недостаточно изученными в отношении генотип-специфиче- ской чувствительности. Материал от мелкого рогатого скота пред- почтительно получать из стран с длительной историей отсутствия скрейпи. Если матери- ал получен из других источников, необходимо соответствующее обоснование. 2.4.2. Стада КРС с незначительным риском ГЭ КРС (скрытый риск) Наиболее безопасным источником являют- ся страны с незначительным риском (страны категории А). В настоящее время невозможно измерить сте- пень снижения географического риска ГЭ для ко- ров из стад КРС с незначительным риском (скры- тый риск). Однако предполагается, что снижение такого риска представляется существенное. Получение материалов от изолированных стад КРС при оценке риска необходимо рассматривать с учетом категории страны по классификации Все- мирной организации здоровья животных. 2.5. ЧАСТИ ТЕЛА ЖИВОТНЫХ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЖИДКОСТИ И СЕКРЕТЫ КАК ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ У инфицированных ГЭ животных органы и секреты имеют разный уровень инфекционно- сти. Если необходимо использовать материалы от ТГЭ-ревалентных видов животных, выбирают материалы с наиболее низкой категорией риска. Независимо от стадии заболевания ткани группируют в 3 основные категории в отно- шении их инфекционности, представленные в таблице 2.3.19.3.-1. Ткани категории IА и материалы, полу- ченные из них, не должны использоваться в производстве лекарственных препаратов, за исключением случаев, когда возможность их использования обоснована (см. раздел 4 дан- ной общей фармакопейной статьи). Несмотря на то, что в группе тканей с низ- кой инфекционностью (категория IВ) почти всегда имеются некоторые ткани с более низким уровнем риска (например, кровь) по сравнению с другими (например, лимфоретикулярные тка- ни), данные об уровнях инфекционности этих 120 тканей слишком ограничены, чтобы выделить в этой категории подкатегории с различным уровнем риска. Также очевидно, что отнесение определенной ткани к той или иной категории может зависеть от заболевания или вида живот- ных и подлежит пересмотру по мере появления новых данных. Категории в таблице 2.3.19.3.-1 являются ориентировочными, поэтому важно отметить следующее: – в определенных ситуациях может прои- зойти перекрестная контаминация тканей с раз- личной категорией инфекционности. На веро- ятность риска будут влиять условия получения тканей, в частности, наличие контакта тканей с низкой инфекционностью или тканей с неопре- деляемой инфекционностью (категории IВ и IС) с тканями с высокой инфекционностью (катего- рия IА).
Степень перекрестной контаминации некоторых тканей может быть увеличена, если в процессе убоя зараженных животных исполь- зуют проникающие или непроникающие проце- дуры разрушения головного мозга и (или) рас- пиливания головного или спинного мозга. Риск перекрестной контаминации будет меньше при заборе биологических жидкостей организма с минимальным повреждением ткани и удале- нии клеточных компонентов, и при сборе эм- бриональной крови без контаминации другими материнскими или эмбриональными тканями, включая плаценту, амниотическую и алланто- исную жидкости. Перекрестную контаминацию определенных тканей с тканью категории IА предотвратить очень трудно или невозможно (например, череп), что требует учета при оценке риска; – для определенных классов материалов ис- пользуемая техника убоя с разрушением (распи- ливанием) может быть критична для снижения потенциального риска вследствие вероятности попадания частиц мозга в периферические ор- ганы, в частности, в легкие. Техника разруше- ния (распиливания) должна быть описана, так же как и процедуры удаления тканей с высокой инфекционной активностью. Должны быть под- робно описаны процедуры сбора тканей и (или) органов животных, подлежащих использова- нию, и принимаемые меры по предупреждению перекрестной контаминации материалом более высокого риска; – риск контаминации органов и тканей по- тенциально опасными в отношении ГЭ материа- лами центральной нервной системы (ЦНС) при использовании для убоя КРС техники оглуше- ния зависит от следующих факторов: – содержание инфекционных возбудителей ГЭ КРС в мозгу умерщвленного животного; – степень повреждения головного мозга; – диссеминация (уровень контаминации) кусочками головного мозга тела животного. Указанные факторы следует оценивать во взаимосвязи с источником происхождения животных по классификации, возрастом живот- ных в случае использования КРС и посмертны- ми исследованиями их с помощью валидирован- ных методик. Основные принципы, описанные выше, также применимы к овцам и козам. Риск возникновения перекрестной конта- минации будет зависеть от некоторых дополни- тельных факторов, включая: – меры, предпринятые для предупрежде- ния контаминации во время сбора тканей; – уровень контаминации (количество конта- минирующих тканей); – количество и тип материалов, собираемых одновременно. Производители должны оценивать риск с учетом вероятности перекрестной контами- нации. Обобщенные современные данные о распре- делении инфекционности и PrPTSE у коров с ГЭ и у овец и коз со скрейпи представлены в табли- цах, приведенных в приложении к данной общей фармакопейной статье. Информация в табли- цах основана исключительно на наблюдениях за случаями заболеваний в природе или экспе- риментальном инфицировании при заражении во внутрь (у КРС), и не содержит в себе дан- ных о моделях со штаммами, вызывающими ГЭ и адаптированными к экспериментальным жи- вотным (пассажи могут значительно и непред- сказуемо изменить их фенотип в сравнении с имеющимися в природе возбудителями забо- левания). При оценке риска необходимо учитывать классификацию тканей, приведенную в табли- цах приложения к данной общей фармакопей- ной статье. 2.6. ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ В качестве источника материалов реко- мендуется использовать молодых животных, поскольку инфекционная активность при ГЭ 121 у КРС нарастает в инкубационный период, для- щийся нескольких лет. Дополнительно следует отметить, что воз- растные критерии зависят также от географи- ческого происхождения. Возраст является более важным показателем для материалов из стран с более высоким риском (страны категорий B и C). 2.7.
ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ПРОЦЕСС Оценка общего снижения возможного риска в лекарственных препаратах в отношении ГЭ должна проводиться с учетом мер по контролю: – источника сырья и исходных материалов; – производственного процесса. Контроль источников материалов является очень важным критерием по обеспечению прием- лемой безопасности продукта вследствие имею- щихся данных о резистентности возбудителей ГЭ к большинству инактивирующих процедур. Контроль производственного процесса и его серийности (то есть формирование серий, разде- ление партий, процедуры очистки между произ- водством разных серий) должен осуществляться в рамках соответствующей системы качества. Необходимо выполнять процедуры, обеспе- чивающие прослеживаемость материалов, про- ведение внутренних аудитов и аудитов постав- щиков сырья и исходных материалов. Определенные технологические процедуры могут значительно снизить риск контаминации ГЭ, например, процедуры, используемые при производстве материалов из жиров (см. раздел 5 данной общей фармакопейной статьи). Так как жесткая обработка не может быть применена ко многим материалам, процессы физического удаления материала, обогащенного прионами, такие как осаждение и фильтрация, более при- емлемы, чем химическая обработка. Должно быть представлено описание производственно- го процесса, включая внутрипроизводственный контроль, а также обсуждены меры, позволяю- щие снизить или исключить контаминацию ГЭ. В случае участия в производственном процессе нескольких производственных площадок долж- ны быть четко указаны стадии, выполняемые на каждой площадке. Должны быть описаны все принимаемые меры по обеспечению мони- торинга исходного материала каждой производ- ственной серии. Процесс очистки Процедура очистки технологического обо- рудования может быть трудновалидируемой на способность удаления агентов ГЭ. Имеются сообщения о том, что после работы с препара- тами с высоким титром возбудителей ГЭ коли- чество возбудителей инфекции, поддающееся обнаружению, может быть адсорбировано на поверхности нержавеющей стали. Удаление всех адсорбированных белков при помощи 1 М раствора натрия гидроксида или хлорсодержа- щих дезинфектантов (например, 20 000 ррm хлора в течение 1 ч) считается приемлемым методом в случаях, когда оборудование, под- вергшееся воздействию потенциально конта- минированного материала, не может быть заме- нено. Мягкая обработка щелочью предельной концентрации или стабилизированной хлорной известью в комбинации с моющими средства- ми, проводимая при заданных температурах, показывает способность удаления прионов, как и в классических процедурах очистки с исполь- зованием натрия гидроксида и хлора. Систе- ма, основанная на обработке парами водорода пероксида, также применима для инактивации возбудителей ГЭ. Такие новые процедуры бо- лее совместимы с деликатными материалами и могут быть пригодны для практического ис- пользования. Если при производстве продукции исполь- зуют материалы с риском ГЭ, должны быть введены в действие процедуры очистки, в том числе меры контроля, для минимизации риска перекрестной контаминации между производ- ственными сериями. Это особенно важно, если материалы из разных категорий риска обраба- тывают на той же производственной площадке и том же оборудовании. Если при производстве продукта используют материалы категории IА, должно быть применено специальное оборудо- вание, при отсутствии других указаний.
Для разработки и утверждения новых проце- дур дезактивации необходимы дальнейшие ис- следования с целью снижения риска перекрест- ной контаминации материалов и оборудования, которые несовместимы с процедурами, рекомен- дованными Всемирной организацией здравоох- ранения. Валидация процедур удаления и (или) инактивации Исследования по валидации процедур уда- ления и (или) инактивации ГЭ трудно подда- ются оценке. Необходимо принимать во вни- мание природу материала и его применимость в естественном состоянии, дизайн исследования 122 (включая уменьшение масштаба технологиче- ских процессов) и методики обнаружения возбу- дителя (in vitro или in vivo). В настоящее время проведение работ по валидации не требуется. Однако, если имеются утверждения о безопас- ности продукта в отношении ГЭ, основанные на способности производственных процессов удалять или инактивировать возбудителей ГЭ, они должны быть подтверждены соответствую- щими экспериментальными исследованиями. Процесс производства по возможности дол- жен быть разработан с учетом имеющейся ин- формации о методах, считающихся пригодными для инактивации или удаления возбудителей ГЭ. Для некоторых видов продукции (см. раздел 5.3 данной общей фармакопейной статьи), у кото- рых валидированный процесс удаления и (или) инактивации затруднен в применении, может потребоваться оценка, которую следует основы- вать на исходном материале и любых опублико- ванных данных о риске ГЭ. 3. ОЦЕНКА РИСКА МАТЕРИАЛОВ ИЛИ СУБСТАНЦИЙ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ И ИЗГОТОВЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Всесторонняя оценка риска для лекарствен- ного препарата должна содержать оценку риска для всех материалов, полученных от ТГЭ-ре- левантных видов животных, и по возможности оценку снижения содержания возбудителей ГЭ или их инактивации на технологических стадиях производства субстанции для фармацевтическо- го применения или готового продукта и должна показать, что все факторы риска ГЭ были учте- ны и риск был минимизирован. Выбор и обоснование порядка контроля материала, полученного от ТГЭ-релевантных животных, осуществляется производителем с учетом последних данных научно-техническо- го прогресса. Окончательное решение о соответ- ствии установленным требованиям принимает уполномоченный орган. 4. ОЦЕНКА СООТНОШЕНИЯ «ПОЛЬЗА – РИСК» Для решения вопроса о приемлемости лекарственного средства, содержащего материа- лы от ТГЭ-релевантных животных, или в про- изводстве которого используют материалы жи- вотного происхождения, необходимо учитывать следующие факторы: – путь введения лекарственного препарата; – количество материала животного проис- хождения, входящего в состав лекарственного средства; – максимальная терапевтическая доза (су- точная доза и продолжительность лечения); – показания к применению лекарственного препарата и его клиническая эффективность; – наличие видового барьера. Ткани с высокой инфекционностью (тка- ни категории IА) и продукты, полученные из них, не должны использоваться в производстве лекарственных средств, исходных материалов и полупродуктов (включая активные фармацев- тические субстанции, вспомогательные вещества и реактивы) при отсутствии другого обоснования. Их применение в производстве активных фарма- цевтических субстанций допускается в исключи- тельных обстоятельствах, если представлены: ‒ надежное обоснование необходимости их использования; ‒ положительная оценка соотношения «польза – риск» согласно предполагаемому при- менению.
Субстанции для фармацевтического приме- нения, производимые из материалов категории IА, если их использование обосновано, должны быть получены от животных из стран с незначи- тельным риском (категория А). 5. ПОЛОЖЕНИЯ ПО ОТДЕЛЬНЫМ МАТЕРИАЛАМ 5.1. КОЛЛАГЕН Коллаген представляет собой фибрилляр- ный белковый компонент соединительной ткани млекопитающих, который получают из костей, шкур и кожи, спилок шкур, связок и сухожилий. Документация для коллагена, подтверждаю- щая соответствие требованиям данного раздела, должна быть представлена с учетом положений разделов 2 – 4 данной общей фармакопейной статьи. Кроме того, должно быть рассмотрено следующее: – для коллагена, полученного из костей, при- меняют требования, установленные для желати- на (см. ниже). Однако в процессе производства коллагена в отличие от производства желатина 123 вероятна более низкая возможность инактивации прионов, поэтому источник получения материала является более критичным по риску передачи ГЭ; – коллаген, произведенный из таких тканей, как шкура, кожа, связки и сухожилия, обыч- но не обладает существенным риском в отно- шении ГЭ, если возможность контаминации потенциально зараженными материалами, на- пример попадание крови и (или) тканей ЦНС, при их заготовке исключена. Поэтому шкуры представляют более безопасное сырье для им- плантатов человека, полученных из коллагена. Вместе с тем перекрестное загрязнение мозго- вой тканью, произошедшее во время убоя и вы- сохшее у поверхности кожи, является трудноу- странимым, что представляет дополнительный аспект, требующий учета при оценке безопасно- сти данного исходного материала. Процесс производства коллагена может включать несколько общих стадий с получени- ем желатина, например, обработка щелочью, натрия сульфатом, кальция гидроксидом и на- трия гидроксидом или ферментативная обработ- ка. Тем не менее, даже эти общие стадии могут различаться по продолжительности и значениям рН, что может привести к существенным разли- чиям в их инактивирующей способности. Для поддержания безопасности продукта в процессе производства коллагена должен присутствовать этап оценки риска, базирующийся на сходстве этапов обработки коллагена и инактивации жела- тина. Кроме этапов обработки существуют также различия в конечном использовании материала и, следовательно, в их оценке риска (желатин ши- роко используется для приема внутрь, коллаген же часто применяется в форме хирургических имплантатов). Данный аспект также следует учи- тывать при окончательной оценке риска. 5.2. ЖЕЛАТИН Желатин представляет собой природный растворимый белок, гелеобразующий или негелеобразующий, полученный частичным гидролизом коллагена, производимого из ко- стей, шкур и кожи животных. Документация, подтверждающая соответ- ствие желатина данному разделу, должна быть представлена с учетом положений разделов 2 – 4 данной общей фармакопейной статьи. Источники материала Желатин, входящий в состав лекарственных средств, может быть произведен из костей или шкур. Шкуры, при условии предупреждения во время заготовки перекрестной контаминации потенциально зараженными материалами, пред- ставляют собой более безопасный исходный ма- териал, чем кости. Шкуры как исходный материал. Шкуры, ис- пользуемые для производства желатина, пред- ставляют собой более безопасный источник материала, чем кости. При этом настоятельно рекомендуется обеспечить условия, предупре- ждающие перекрестную контаминацию потен- циально зараженными материалами во время заготовки. Кости как исходный материал.
При исполь- зовании костей для производства желатина для обеспечения безопасности конечного продукта необходим контроль по дополнительным пара- метрам. При получении желатина из костей КРС необходимо контролировать качество исходных материалов и выполнять следующие условия: – череп и позвоночник, содержащий спинной мозг, должны быть исключены из состава сырья (исходное сырье и исходный материал) незави- симо от возраста и страны происхождения КРС; – позвонки должны быть удалены из исход- ного сырья и исходного материала от КРС с воз- растом старше 30 мес (страны категории В или С); – желатин для парентерального использования должен быть произведен из костей, полученных из стран категории А и В. Желатин для приема внутрь может быть произведен из костей, полу- ченных из стран категории А, В и С; – желатин должен быть произведен одним из способов, описанных ниже. Способы производства Шкуры. При производстве желатина из шкур не требуется особых конкретных способов и ус- ловий переработки, если выполняются все про- цедуры для предупреждения перекрестной кон- таминации как при заготовке шкур, так и в ходе производственного процесса. Кости. Если в качестве исходного материа- ла используют кости, способ производства будет являться вторым параметром, обеспечивающим безопасность желатина: – желатин может быть произведен из костей КРС от источников в странах категории А, В или С в соответствии с условиями, описанны- ми в разделе 5.2 данной общей фармакопейной статьи, с использованием кислот и щелочей, или нагревания, или давления; – при проведении оценки риска должен быть 124 принят во внимание производственный процесс в соответствии с описанием в разделе 3 дан- ной общей фармакопейной статьи. В валида- ционных экспериментах показано, что исполь- зование в производстве желатина как кислот, так и щелочей позволяет инактивировать и (или) удалять агенты ГЭ. Исследования показали, что дополнительная обработка костей и (или) оссе- ина щелочью (рН 13) в течение 2 ч значительно повышает способность процесса производства инактивировать и (или) удалять ГЭ. Введение в технологический процесс стадий фильтрова- ния, ионообменной хроматографии и ультравы- сокотемпературной стерилизации также повы- шает степень безопасности желатина; – при стандартном щелочном способе произ- водства для получения костной ткани (оссеина) кости мелко измельчают, обезжиривают горячей водой и деминерализуют раствором хлороводо- родной кислоты (не менее 4 % при рН не более 1,5) в течение не менее 2 сут. Затем проводят щелочную обработку насыщенным раствором кальция гидроксида (рН не менее 12,5) в тече- ние 20 сут; – кости КРС могут быть переработаны с помо- щью кислотного способа (предварительная обра- ботка кислотой), при котором оссеин вымачивает- ся при рН не более 3,5 в течение не менее 10 ч; – как к кислотному, так и щелочному спосо- бам производства желатина применима высоко- температурная обработка (стерилизация) при тем- пературе не менее 138 °С в течение не менее 4 с; – при производственном процессе с исполь- зованием нагревания и давления, высушенные, измельченные и обезжиренные кости автоклави- руют с помощью насыщенного пара при давле- нии более 3 бар и температуре не менее 133 °С в течение не менее 20 мин с последующей экс- тракцией белков горячей водой. Заключительные стадии при использовании процессов кислотной, щелочной или темпера- турной обработки под давлением практически одинаковы и включают экстракцию желатина, промывание, фильтрацию и концентрирование. 5.3.
МАТЕРИАЛЫ ИЗ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ Эмбриональная (фетальная) сыворотка КРС широко используется при работе с клеточ- ными культурами. Фетальная сыворотка КРС должна быть получена из плодов, извлеченных на скотобойнях у здоровых коров, пригодных для употребления в пищу человеком. Матка должна быть полностью удалена, эмбриональ- ная кровь собирается в закрытую систему для сбора крови в специально предназначенном для этого месте или зоне в асептических условиях путем сердечной пункции. Сыворотку новорожденных телят получают у телят в возрасте до 20 сут; сыворотку телят - у животных в возрасте менее 12 мес. Донорскую сыворотку КРС получают у животных в возрасте не более 36 мес, при этом наличие отрицатель- ного статуса стада в отношении ГЭ должно быть четко определено и задокументировано. Во всех случаях для предупреждения пере- крестной контаминации тканями с более высо- ким риском, сыворотка должна быть собрана обученным персоналом согласно определенным процедурам, регламентируемым соответствую- щими нормативными документами. С целью подтверждения соответствия мате- риалов из крови КРС и ее компонентов требова- ниям общей фармакопейной статьи документа- ция на них должна быть представлена с учетом положений разделов 2 – 4 данной общей фар- макопейной статьи (таблица 2.3.19.3.-2). Кроме того, следует учитывать следующее. Прослеживаемость Должна быть обеспечена прослеживаемость каждой серии сыворотки или плазмы до ското- бойни. Скотобойни должны иметь и хранить списки ферм, откуда поступили животные. Если сыворотка получена у живых животных, для ка- ждой серии сыворотки должны вестись записи, обеспечивающие прослеживаемость ее проис- хождения с соответствующей фермы. Географическое происхождение В связи с тем, что уровень инфекционности ГЭ тканей КРС более высокий, чем в отноше- нии скрейпи, в качестве меры предосторожности кровь КРС должна быть получена из стран кате- гории А. Кровь КРС из стран категории В также является приемлемой при условии, что нет риска перекрестной контаминации крови тканями моз- га при убое животных в возрасте более 21 мес. Методы оглушения Если образцы получают от убитых жи- вотных, метод убоя играет важную роль в обеспечении безопасности материала. Было установлено, что оглушение пистолетом с выдви- гающимся ударным стержнем с прокалыванием или без прокалывания спинного мозга, так же как пневматическим ударным аппаратом, осо- 125 Таблица 2.3.19.3.-2. – Концепция для определения соответствия требованиям крови (сыворотки) крупного рогатого скота и ее компонентов Продукт Фетальная сыворотка Донорская телячья сыворотка Донорская сыворотка взрослого животного Телячья сыворотка Взрослая сыворотка Сыворотка/ плазма/ компоненты сыворотки взрослого животного Компоненты сыворотки взрослого животного Компоненты сыворотки взрослого животного географическое происхождение КРС категории А и В категории А и В категории А и В1 категории А и В категория А категория В категория А категория В возраст КРС нерожденный < 1 год < 36 мес < 1 год не ограничен < 21 мес2 не ограничен < 30 мес убой/перекрестная контаминация крови материалами ЦНС нет риска перекрестной контаминации риск перекрестной контаминации доказательство снижения содержания прионов в процессе производства нет нет да3 Примечание. 1 Если источник из стран категории В, КРС должен быть из четко определенных и документированных стад. 2 Более старший возраст может быть разрешен, если перекрестное загрязнение крови материалами ЦНС исключено (например, халяльный убой).
3 Доказательство снижения содержания прионов может не требоваться, если перекрестное загрязнение крови материалами ЦНС исключено (например, халяльный убой). 126 бенно с введением воздуха, может разрушить мозг и привести к распространению тканей мозга через кровоток. Непроникающее оглуше- ние (без пенетрации) больше не рассматривают в качестве альтернативы оглушению с проник- новением (с пенетрацией). Незначительный риск можно ожидать от электронаркоза, но даже это не обеспечивает полную безопасность, пото- му что, в случае неудачи, животные, возможно, будут подвергнуты дополнительному оглуше- нию. Методы оглушения должны быть описаны в процессе сбора крови КРС. Если при убое скота в странах категории В возможен риск перекрестного заражения крови КРС тканью мозга, должны применяться такие меры безопасности как ограничение возраста скота и (или) уменьшение содержания инфекци- онных агентов в процессе производства. Возраст Для стран категории B в качестве меры безо- пасности для крови КРС и ее компонентов при- меняют ограничение возраста до 21 мес, если производство не предполагает существенного снижения содержания агентов ГЭ. Возрастное ограничение до 30 мес считается достаточным для компонентов крови, если значительное сни- жение содержания агентов ГЭ можно подтвер- дить, как описано ниже. Снижение содержания ГЭ агентов в процессе производства Возможность производственного процес- са уменьшать и (или) устранять агенты ГЭ для компонентов крови должна быть оценена в экспериментальных исследованиях. Оценка может быть основана на собственных или лите- ратурных данных в случаях, когда можно пока- зать их актуальность для конкретного производ- ственного процесса. Если невозможно сделать вывод о сопоставимости способностей к сниже- нию, производителям рекомендуется провести исследования по конкретным продуктам. Иссле- дования с использованием биохимических ана- лизов могут быть достаточными при наличии научных доказательств о корреляции анализов с данными об инфекционности. В исследовани- ях рисков, связанных с использованием крови, загрязненной тканями мозга, могут применяться препараты, полученные из головного мозга. 5.4. МАТЕРИАЛЫ ИЗ ТВЕРДОГО ЖИРА Твердый жир получают из тканей подкож- ных, брюшных и межмышечных областей и костей. В качестве исходного материала для изготовления производных жира используют твердый жир, соответствующий санитарным правилам, касающихся субпродуктов животного происхождения, не предназначенных для упо- требления человеком. Безопасным в странах c неопределенным риском ГЭ КРС является жир с максимальным количеством нерастворимых примесей 0,15 % и продукты из такого жира. Материалы, по- лученные из такого твердого жира, глицерин и жирные кислоты, не представляют риск в отношении передачи ГЭ в случае использова- ния в производственном процессе жестких усло- вий обработки. Материалы, произведенные при использо- вании следующих технологических процессов, будут соответствовать требованиям данного раз- дела, независимо от географического происхожде- ния и природы тканей, из которых они получены: – трансэтерификация или гидролиз при темпе- ратуре не менее 200 °С в течение не менее 20 мин под давлением (производство глицерина, жирных кислот и сложных эфиров жирных кислот); – омыление с помощью 12 М раствора натрия гидроксида (производство глицерина и мыла): – серийный процесс: при температуре не ниже 95 °С в течение не менее 3 ч; – непрерывный процесс: при температуре не ниже 140 °С под давлением в течение не менее 8 мин или эквивалентная обра- ботка; – перегонка при температуре 200 °С.
Производные твердых жиров, произве- денные в соответствии с такими условиями, не представляют какого-либо риска в отноше- нии передачи ГЭ и следовательно соответствуют требованиям данного раздела. Производные твердых жиров, произведен- ные в других условиях, должны соответствовать требованиям данного раздела. 5.5. УГОЛЬ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Уголь животного происхождения получают путем обугливания тканей животных, таких как кости, при температуре выше 800 °С. Исходный материал для производства угля животного происхождения должен соответство- вать санитарным правилам, касающимся субпро- дуктов животного происхождения, не предна- значенных для употребления человеком, при 127 отсутствии другого обоснования. Независимо от географического происхождения и природы ткани нормативные требования к углю живот- ного происхождения должны быть рассмотрены в соответствии с данным разделом. Уголь, произведенный в соответствии с описанными условиями, не представляет како- го-либо риска в отношении передачи ГЭ и сле- довательно будет соответствовать требованиям данного раздела. Уголь, произведенный в других условиях, дол- жен соответствовать требованиям данного раздела. 5.6. МОЛОКО И МАТЕРИАЛЫ ИЗ МОЛОКА В свете современных научных знаний и не- зависимо от географического происхождения, молоко КРС не представляет никакого риска по заражению ГЭ. Некоторые материалы, включая лактозу, экстрагируют из молочной сыворотки или оста- точной жидкости при производстве сыра после свертывания (коагуляции). При коагуляции мо- жет использоваться сычужный фермент телят (экстракт сычуга) или сычужный фермент, полу- ченный от других жвачных животных. Производные коровьего молока, произведен- ные в описанных ниже условиях, не представ- ляют риска ГЭ и следовательно соответствуют требованиям: – молоко должно быть получено от здоро- вых животных в тех же условиях, что и молоко, пригодное для употребления человеком; – никакие другие материалы от жвачных животных, за исключением сычужного фермен- та телят, не используют при получении таких производных (например, гидролизатов казеина с использованием панкреатических ферментов). Производные молока, полученные другим способом или с использованием производных сычужного фермента от других видов жвачных животных, должны соответствовать требовани- ям данного раздела. 5.7. МАТЕРИАЛЫ ИЗ ШЕРСТИ Материалы из шерсти и волос жвачных животных, такие как ланолин и ланолиновые спирты (спирты шерстяного воска), полученные из волос, должны соответствовать требованиям данного раздела при условии, что шерсть и во- лосы получены от живых животных. Материалы из шерсти и волос умерщвлен- ных жвачных животных, предназначенных для употребления в пищу, не представляют како- го-либо риска ГЭ, если получены с использова- нием в производственном процессе параметров рН, температуры и продолжительной обработки, соответствующих как минимум одному из ука- занных ниже условий: – обработка при рН не менее 13 (первона- чальная, соответствует концентрации натрия гидроксида не менее 0,1 М) при 60 ºС в течение не менее 1 ч. Это происходит обычно на стадии щелочной обработки органического материала; – молекулярная дистилляция при высокой тем- пературе более 220 ºС при пониженном давлении. Материалы из шерсти, полученные в других условиях, должны соответствовать требованиям данного раздела. 5.8. АМИНОКИСЛОТЫ Аминокислоты могут быть получены путем гидролиза материалов из различных источников.
Исходный материал для производства амино- кислот должен отвечать санитарным правилам, касающимся субпродуктов животного происхож- дения, не предназначенных для потребления че- ловеком, при отсутствии другого обоснования. Аминокислоты не представляют риска ГЭ, если их производство включает следующие ста- дии технологического процесса: – обработку материала при рН от 1 до 2, далее при рН не менее 11 с последующей тер- мообработкой при 140 ºС в течение 30 мин при давлении 3 бар; – фильтрование полученных аминокислот после обработки; – анализ чистоты проводится с помощью валидированной и чувствительной методики, позволяющей оценить содержание всех остаточ- ных негидролизованных макромолекул в уста- новленных допустимых пределах. Аминокислоты, полученные в других усло- виях, должны соответствовать требованиям дан- ной общей фармакопейной статьи. 5.9. ПЕПТОНЫ Пептоны представляют собой частичные ги- дролизаты белка, полученные в результате фер- ментативного или кислотного расщепления. Пептоны используют в микробиологиче- ских питательных средах для полноценного питания микроорганизмов, используемых в ка- честве посевного материала или в ферментерах промышленного масштаба для производства 128 лекарственных препаратов, в том числе вакцин для медицинского и ветеринарного применения. Существует значительный интерес в использо- вании растительного белка как альтернативы животного белка. Тем не менее: – если в качестве источника белка использу- ется желатин, он должен отвечать требованиям раздела 5.2 данной общей фармакопейной статьи; – если в качестве источника белка исполь- зуется казеин, он должен отвечать требованиям раздела 5.6 данной общей фармакопейной статьи; – если в качестве источника белка исполь- зуются ткани видов животных, подверженных ГЭ, их получают от животных, пригодных для употребления в пищу (см. раздел 2.4 данной об- щей фармакопейной статьи) с максимальным возрастом 30 мес для КРС из стран категории В. Для животных из стран категории А возраст жи- вотных практически не влияет на оценку риска. ПРИЛОЖЕНИЕ. ОСНОВНЫЕ КАТЕГОРИИ ИНФЕКЦИОННОСТИ Приведенная ниже таблица взята из доку- мента Всемирной организации здравоохранения WHO Guidelines on Tissue Infectivity Distribu- tion in Transmissible Spongiform Encephalo- pathies (2010). Данные в таблице соответствуют следующему: + — наличие инфекционности или PrPTSE; – — отсутствие определяемой инфекционности или PrPTSE; НИ — не исследовалось; НП — не применимо; ? — неопределенная интерпретация; ( ) — ограниченные или предварительные данные; [ ] — данные об инфекционности или PrPTSE основаны исключительно на биопробах на трансгенных (Тg) мышах, экспрес- сирующих дополнительно ген PrP-ко- дирования, или методах амплификации PrPTSE. Ткань Крупный рогатый скот ГЭ КРС Овцы и козы Скрейпи инфекционность PrPTSE инфекционность PrPTSE Категория IA: Ткани с высокой инфекционностью мозг + + + + спинной мозг + + + + сетчатка + НИ НИ + зрительный нерв + НИ НИ + спинальный ганглий + + + + ганглий тройничного нерва + + НИ + гипофиз – НИ + + твердая мозговая оболочка НИ НИ НИ НИ Категория IB: Ткани с низкой инфекционностью периферические нервы [+] + + + вегетативные ганглии НИ + НИ + Таблица 2.3.19.3.-3.
– Основные категории инфекционности тканей 129 Ткань Крупный рогатый скот ГЭ КРС Овцы и козы Скрейпи инфекционность PrPTSE инфекционность PrPTSE лимфоретикулярные ткани селезенка – – + + лимфатические узлы – – + + миндалевидная железа + – + + мигательная перепонка + – [+] + тимус – НИ + + пищеварительный тракт пищевод – НИ [+] + рубец (только для жвачных животных) – НИ [+] + желудок/сычуг – НИ [+] + 12-перстная кишка – – [+] + тощая кишка – + [+] + подвздошная кишка + + + + аппендикс НП НП НП НП толстая кишка/слепая кишка – – + + прямая кишка НИ НИ НИ + репродуктивные ткани плацента – НИ + + яичник – НИ – – матка – НИ – – другие ткани молочная железа/вымя – НИ – + кожа – НИ – + жировая ткань – НИ НИ НИ сердце/перикард – НИ – НИ легкие – НИ – – печень – НИ + – почки – – [+] + надпочечники [+] + + – поджелудочная железа – НИ + НИ Таблица 2.3.19.3.-3. – Продолжение 130 Ткань Крупный рогатый скот ГЭ КРС Овцы и козы Скрейпи инфекционность PrPTSE инфекционность PrPTSE костный мозг [+] НИ + НИ скелетные мышцы [+] НИ [+] + язык – НИ [+] + кровеносные сосуды – НИ НИ + слизистая оболочка носа – НИ + + слюнная железа – НИ + НИ роговица НИ НИ НИ НИ жидкости организма, секреты и выделения цереброспинальная жидкость – НИ + – кровь – ? + ? слюна НИ НИ – НИ молоко – – + [+] моча – НИ – – фекалии – НИ – НИ Категория IC: Ткани с неопределяемой инфекционностью репродуктивные ткани яички – НИ – – предстательная железа/ придатки семенника/семенные канатики – НИ – – сперма – НИ – – плацентарная жидкость – НИ НИ НИ плод – НИ – – эмбрион – НИ ? НИ скелетно-мышечные ткани кость – НИ НИ НИ сухожилие – НИ НИ НИ другие ткани ткани десны НИ НИ НИ НИ зубная пульпа НИ НИ НИ НИ трахея – НИ НИ НИ щитовидная железа НИ НИ – НИ Таблица 2.3.19.3.-3. – Продолжение 131 Ткань Крупный рогатый скот ГЭ КРС Овцы и козы Скрейпи инфекционность PrPTSE инфекционность PrPTSE жидкости организма, секреты и выделения молозиво (–) – ( ? ) НИ пуповинная кровь – НИ НИ НИ пот НИ НИ НИ НИ слезы НИ НИ НИ НИ назальная слизь НИ НИ НИ НИ желчь НИ НИ НИ НИ Таблица 2.3.19.3.-3. – Продолжение 203190004-2023 2.3.19.4. СТАДА КУР ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВАКЦИН, НЕ СОДЕРЖАЩИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ПАТОГЕНОВ Общая фармакопейная статья описывает требования к стадам кур, не содержащим опре- деленных патогенов, и включает перечень пато- генов, подлежащих контролю. Цыплята, эмбрионы или культуры клеток, используемые при производстве или контроле качества вакцин, получают из яиц кур, не со- держащих определенных патогенов (specified pathogens free, SPF) (далее – категория СПФ). Для подтверждения соответствия стада кур ка- тегории СПФ используют систему контроля, представленную в данной общей фармакопей- ной статье. Перечень определенных патогенов, подлежащих контролю, составлен с учетом со- временных знаний и при необходимости может обновляться. Стадо кур категории СПФ содержат в оди- наковых условиях с минимальным риском кон- таминации. Технический персонал не должен иметь контактов со стадами кур без категории. После присвоения стаду кур категории СПФ к нему не добавляют птиц, не имеющих соответ- ствующей категории. Стада кур категории СПФ нельзя размещать вблизи стад птиц без нее. Исключение состав- ляют стада в процессе присвоения категории или содержащиеся в помещениях и условиях, соответствующих категории СПФ. Стадо кур ка- тегории СПФ должно содержаться в изоляторе или в помещениях с фильтруемым воздухом и поддержанием разницы давления. В помещения не допускаются лица без соответствующего раз- решения.
Принимаются необходимые меры для предотвращения проникновения грызунов, ди- ких птиц, насекомых. Персонал, имеющий разрешение на вход в помещение, не должен иметь контактов с дру- гими птицами или носителями инфекции, по- тенциально способными инфицировать стадо. Перед входом в помещения персоналу рекомен- дуют принять душ и переодеться или надеть за- щитную одежду. По возможности предметы, которые вносят в помещение, стерилизуют. В частности, реко- мендуется обрабатывать корм соответствующим образом для предотвращения контаминации не- желательными микроорганизмами. Используе- мая вода должна соответствовать требованиям к питьевой воде. У птиц из стада категории СПФ не применяют лекарственные препараты, которые могут препятствовать выявлению заболевания. Сведения о здоровье стада постоянно ре- гистрируют и любые отклонения расследуют. Основные параметры наблюдения включают заболеваемость, смертность, общее физическое состояние, потребление корма, ежедневная яй- ценоскость, выводимость цыплят и качество яиц. Записи сохраняют в течение 5 лет. О любых отклонениях или при обнаружении какой-либо инфекции сообщают потребителям яиц в воз- можно короткие сроки. 132 Таблица 2.3.19.4.-1. – Перечень патогенов, подлежащих контролю Возбудитель Методы исследования* Вертикальный путь передачи Распространение Аденовирусы птиц, группа 1 (Avian adenoviruses, group 1) РДП, ИФА да медленное Вирус энцефаломиелита птиц (Avian encephalomyelitis virus) РДП, ИФА да быстрое Вирус инфекционного бронхита птиц (Avian infectious bronchitis virus) РТГА, ИФА нет быстрое Вирус инфекционного ларинготрахеита птиц (Avian infectious laryngotracheitis virus) реакция нейтрализации вируса, ИФА нет медленное Вирус лейкоза птиц (Avian leucosis viruses) ИФА для вируса, реакция нейтрализации вируса, ИФА для антитела да медленное Вирус нефрита птиц (Avian nephritis virus) ИО нет медленное Ортореовирусы птиц (Avian orthoreoviruses) ИО, ИФА да медленное Вирус ретикулоэндотелиоза птиц (Avian reticuloendotheliosis virus) РДП, ИФА да медленное Вирус анемии цыплят (Chicken anaemia virus) ИО, ИФА, реакция нейтрализации вируса да медленное Вирус синдрома снижения яйценоскости (Egg drop syndrome virus) РТГА, ИФА да медленное Вирус инфекционного бурсита птиц (Infectious bursal disease virus) Серовар 1: РДП, ИФА, реакция нейтрализации вируса Серовар 2: реакция нейтрализации вируса нет быстрое Вирус гриппа А (Influenza A virus) РДП, ИФА, РТГА нет быстрое Вирус болезни Марека (Marek`s disease virus) РДП нет быстрое Вирус болезни Ньюкасла (Newcastle disease virus) РТГА, ИФА нет быстрое Вирус ринотрахеита индеек (птиц) (Turkey rhinotracheitis virus) ИФА нет медленное Mycoplasma gallisepticum РА и РТГА для подтверждения положительного результата, ИФА, РТГА да медленное Mycoplasma synoviae РА и РТГА для подтверждения положительного результата, ИФА, РТГА да быстрое Salmonella pullorum РА да медленное Примечание. РА – реакция агглютинации РДП – реакция диффузной преципитации в геле (метод применим для еженедельных исследований) ИФА – иммуноферментный анализ РТГА – реакция торможения гемагглютинации ИО – иммуноокрашивание * По согласованию с уполномоченным органом возможно использование других методов испытаний при условии, что они не менее чувствительные и специфичные, чем представленные в данной общей фармакопейной статье 133 Испытания, представленные в данной общей фармакопейной статье, должны обладать соот- ветствующей специфичностью и чувствительно- стью к определенным сероварам вирусов. Испы- туемые образцы отбирают случайным образом.
Положительный результат испытания на на- личие вируса анемии цыплят не обязывает ис- ключать использование материала, полученного из данного стада, однако живые вакцины для применения у птиц в возрасте менее 7 сут долж- ны производиться с использованием материала от птиц с отрицательным результатом на вирус анемии цыплят. Инактивированные вакцины для применения у птиц в возрасте менее 7 сут могут быть произведены из материала, полученного от стада без отрицательного результата на ви- рус анемии цыплят при условии подтверждения инактивации вируса анемии цыплят в процессе инактивации вакцины. СОЗДАНИЕ СТАДА КАТЕГОРИИ СПФ Стада категории СПФ создают из птиц, про- верка которых подтверждает отсутствие верти- кально передающихся инфекций (возбудители инфекций приведены в таблице 2.3.19.4.-1). Испытания проводят на двух поколениях птиц, предшествующих формированию стада категории СПФ. Процедуры присвоения и под- держания категории СПФ у стад кур приведены в таблице 2.3.19.4.-2. Для формирования нового стада категории СПФ проводят ряд испытаний на трех поколе- ниях птиц. Все птицы в первом поколении до дости- жения возраста 20 нед должны быть провере- ны один раз на наличие группового антигена лейкоза птиц и на отсутствие антител к виру- су лейкоза птиц подтипов A, B и J с помощью иммуноферментного анализа или реакции ней- трализации вируса. Всех птиц также проверяют на отсутствие антител к инфекционным возбу- дителям, передающимся вертикально, согласно таблице 2.3.19.4.-1. Начиная с возраста 8 нед формируемые стада проверяют на отсутствие Salmonella spp. С этого периода проводят регу- лярные клинические наблюдения, чтобы под- твердить отсутствие симптомов инфекционных заболеваний. Методы анализа, используемые для оценки формируемого стада, указаны в та- блице 2.3.19.4.-1, дополнительные рекоменда- ции приведены в разделе по рутинным испыта- ниям стада категории СПФ. Начиная с возраста 20 нед стада проверяют в соответствии с разделом Рутинные испытания стада категории СПФ данной общей фарма- копейной статьи. Все процедуры присвоения и поддержания категории применяют к последу- ющим двум поколениям, за исключением испы- тания каждой птицы на наличие возбудителей, передающихся вертикальным путем. Стада категории СПФ формируются из третьего поколения птиц при условии, что результаты испытаний во всех трех поколениях стада показали отсутствие патогенных микроор- ганизмов. Допускается доукомплектование стада мо- лодняком от стад кур категории СПФ, получен- ным из другого стада этой же категории, содер- жащимся в отдельных помещениях на одной птицеферме. Начиная с возраста 8 нед стада подвергают испытаниям в соответствии с про- цедурами присвоения и поддержания категории. ИСХОДНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ИСПЫТАНИЯМ ПОСЛЕДУЮЩИХ ПОКОЛЕНИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ СТАД КАТЕГОРИИ СПФ Новое поколение для присвоения категории СПФ предварительно проверяют на отсутствие определенных патогенов при условии, что стадо доукомплектовано исключительно птицами из стада той же категории. В дополнение к испыта- ниям на наличие Salmonella и контролю общего состояния здоровья, начиная с возраста 8 нед, проводят дополнительные испытания. Испы- тания выполняют дважды с интервалом не ме- нее 4 нед у 5 % птиц из стада (не менее 10 птиц и не более 200 птиц); птиц отбирают в возрасте от 12 нед до 16 нед и от 16 нед до 20 нед. Образцы крови для анализа на наличие ан- тител и подходящие образцы для проведения испытания на наличие вируса лейкоза отбирают и исследуют индивидуально.
Используемые ме- тодики контроля выполняют в соответствии с указаниями раздела Рутинные испытания стада категории СПФ данной общей фармакопейной статьи. При результатах испытаний, подтвержда- ющих отсутствие каких-либо инфекций, новому поколению присваивают категорию СПФ. 134 РУТИННЫЕ ИСПЫТАНИЯ СТАДА КАТЕГОРИИ СПФ ОБЩИЙ ОСМОТР, АУТОПСИЯ И ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Клинические исследования проводят не реже одного раза в неделю в течение всего периода существования стада для подтвержде- ния отсутствия вируса оспы домашней пти- цы и признаков какой-либо инфекции. В слу- чае превышения уровня смертности более чем на 0,2 % в течение недели проводят аутопсию по возможности всех погибших птиц. При не- обходимости для установления диагноза про- водят гистологические, микробиологические и вирусологические исследования. Также прово- дят специальное исследование на наличие при- знаков туберкулеза. Гистологические образцы из мест поражения специфически окрашивают для определения микобактерий Mycobacteri- um avium. Содержимое слепой кишки всех по- гибших птиц по возможности подвергают ми- кробиологическому исследованию на наличие Salmonella spp. При необходимости могут быть объединены образцы содержимого слепой киш- ки от 5 птиц. Таблица 2.3.19.4.-2. – Описание процедуры присвоения и поддержания категории СПФ у стад кур НОВЫЕ ПТИЦЫ (ПЕРВОЕ ПОКОЛЕНИЕ) Подтверждают отсутствие возбудителей, передающихся вертикальным путем Проверяют всех птиц в возрасте до 20 нед жизни на отсутствие вируса лейкоза птиц и антител к нему Проводят испытания на наличие Salmonella spp. и общие клинические исследования у всех птиц, начиная с возраста 8 нед Проводят рутинные испытания на наличие определенных возбудителей у всех птиц, начиная с возраста 20 нед ВТОРОЕ ПОКОЛЕНИЕ Проводят испытания на отсутствие вируса лейкоза птиц и антител к нему у всех птиц в возрасте до 20 нед Проводят испытания на наличие Salmonella spp. и общие клинические исследования у всех птиц возраста, начиная с 8 нед Проводят рутинные испытания на наличие определенных возбудителей у всех птиц, начиная с возраста 20 нед ТРЕТЬЕ ПОКОЛЕНИЕ Проверяют на отсутствие вируса лейкоза птиц и антител к нему у всех птиц в возрасте до 20 нед Проводят испытания на наличие Salmonella spp. и общие клинические исследования у всех птиц, начиная с возраста 8 нед ЕСЛИ РЕЗУЛЬТАТЫ ВСЕХ ИСПЫТАНИЙ СООТВЕТСТВУЮТ ТРЕБОВАНИЯМ, СТАДУ ПРИСВАИВАЮТ КАТЕГОРИЮ СПФ ТРЕТЬЕ ПОКОЛЕНИЕ Проводят рутинные испытания на наличие определенных возбудителей у всех птиц, начиная с возраста 20 нед Проводят испытания после яйцекладки на наличие возбудителей, передающихся вертикальным путем ПОСЛЕДУЮЩИЕ ПОКОЛЕНИЯ Проводят испытания на отсутствие вируса лейкоза птиц и антител к определенным инфекционным возбудителям у 5 % птиц в возрасте от 12 нед до 20 нед дважды Проводят испытания на наличие Salmonella spp. и общие клинические исследования у всех птиц, начиная с возраста 8 нед Проводят рутинные испытания на наличие определенных инфекционных возбудителей у всех птиц, начиная с возраста 20 нед Проводят испытания после яйцекладки на наличие возбудителей, передающихся вертикальным путем 135 ИСПЫТАНИЕ НА НАЛИЧИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ SALMONELLA SPP. Испытание на наличие Salmonella spp. про- водят с использованием культурального метода на смывах из прямой кишки или испражнениях птиц или мазках, полученных с помощью рек- тального тампона. При анализе испражнений или смывов каждые 4 нед исследуют 60 образ- цов в течение всей жизни стада. Для проведения испытаний можно объединить до 10 образцов.
При анализе мазков отбирают не менее двух образцов, испытания проводят каждые 4 нед в течение всей жизни стада. Для обнаружения Salmonella spp. образцы предварительно обога- щают, затем культивируют на питательных сре- дах, селективных для Salmonella. ИСПЫТАНИЯ НА НАЛИЧИЕ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ До начала яйцекладки проводят исследо- вания ректальных смывов или образцов крови (высеивают светлый слой кровяного сгустка) на наличие специфических групповых анти- генов лейкоза. Каждые 4 нед отбирают из ста- да 5 % птиц (не менее 10 птиц и не более 200 птиц). Во время яйцекладки для образцов белка отбирают 5 % яиц (не менее 10 яиц и не более 200 яиц) и проводят испытания каждые 4 нед Испытания на наличие групповых специфиче- ских антигенов вируса лейкоза птиц проводят методом иммуноферментного анализа, исполь- зуя методики, обеспечивающие обнаружение антигена подгрупп А, В и J. ИСПЫТАНИЯ НА НАЛИЧИЕ АНТИТЕЛ К ДРУГИМ ИНФЕКЦИОННЫМ ВОЗБУДИТЕЛЯМ Испытания на наличие антител ко всем ин- фекционным возбудителям, перечисленным в таблице 2.3.19.4.-1, проводят в течение все- го периода яйцекладки стада. Каждые 4 нед отбирают образцы у 5 % птиц стада (не менее 10 птиц и не более 200 птиц). Каждую неделю отбирают образцы у 1,25 % птиц стада, так как некоторые испытания на наличие отдельных возбудителей должны проводиться еженедель- но. В таблице 2.3.19.4.-1 приводится классифи- кация определенных возбудителей с быстрым или медленным распространением. На наличие медленно распространяющихся инфекций об- разец проверяют индивидуально. Для проверки наличия быстро распространяющихся инфек- ций отбирают не менее 20 % образцов каждые 4 нед и проверяют по отдельности. При исполь- зовании реакции нейтрализации сыворотки или твердофазного иммуноферментного анализа все образцы могут быть исследованы индивидуаль- но или объединением по 5 образцов, отобранных одновременно. Методы исследования, пригод- ные для обнаружения определенных возбудите- лей, приводятся в таблице 2.3.19.4.-1. По согла- сованию с уполномоченным органом возможно использование других методов исследований при условии, что они не менее чувствительные и специфичные, чем представленные в данной общей фармакопейной статье. ИСПЫТАНИЯ, ПРОВОДИМЫЕ В КОНЦЕ ПЕРИОДА ЯЙЦЕКЛАДКИ После последнего сбора яиц проводят заключительные испытания для подтверждения отсутствия возбудителей, передающихся верти- кальным путем (таблица 2.3.19.4.-1). Для про- ведения испытаний после последнего сбора яиц не менее 5 % птиц из стада (не менее 10 птиц и не более 200 птиц) оставляют на срок не менее 4 нед Образцы крови отбирают у каждой птицы стада в течение четырех недель, при этом не ме- нее чем у 1,25 % птиц (25 % образцов) отбирают не ранее чем через 4 нед после заключительно- го сбора яиц. Образцы сыворотки проверяют на наличие возбудителей, передающихся верти- кальным путем (таблица 2.3.19.4.-1). Если отбор образцов осуществляют еженедельно, исследо- ванию в данный период подвергают не менее 1,25 % птиц (25 % образцов). В качестве альтер- нативы в течение 4 нед и после заключительно- го сбора яиц кровь и (или) другие подходящие для испытаний материалы отбирают не менее чем у 5 % птиц из стада и проверяют на наличие воз- будителей, передающихся вертикальным путем, с помощью валидированных методик на основе амплификации нуклеиновых кислот (2.1.6.17).
МЕРЫ, ПРИНИМАЕМЫЕ ПРИ ОБНАРУЖЕНИИ ОПРЕДЕЛЕННОГО ВОЗБУДИТЕЛЯ Если обнаружено заражение стада возбуди- телем, относящимся согласно таблице 2.3.19.4.-1 к медленно распространяющимся, все материа- лы, полученные из стада в течение 4 нед, пред- шествующих дате отбора образца с наличием 136 возбудителя, считаются неудовлетворительны- ми. Аналогично, если обнаружено заражение стада возбудителем, относящимся согласно таблице 2.3.19.4.-1 к быстро распространяю- щимся, все материалы, полученные из стада в течение 2 нед, предшествующих дате отбора образца с наличием возбудителя, считаются не- удовлетворительными. Любой продукт, произ- веденный с использованием таких материалов и для которого обязательно использование кур категории СПФ, считают непригодным и браку- ют; все испытания по контролю качества, про- веденные с использованием таких материалов, являются недействительными. Производители обязаны уведомить потре- бителей всех яиц об обнаружении заражения по возможности быстрее после вспышки эпидемии. Стадо, у которого подтверждено инфицирова- ние любым определенным возбудителем, не мо- жет в последующем получить категорию СПФ. Любое потомство, полученное от данного стада в течение или после периода 4 нед, предшествую- щего отбору последней отрицательной пробы, не может быть отнесено к категории СПФ. 203190005-2023 2.3.19.5. ИСХОДНОЕ СЫРЬЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ КЛЕТОЧНОЙ И ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Настоящая общая фармакопейная статья приводится для информации. Общая фармакопейная статья содержит общие указания к качеству сырья биологиче- ского происхождения, используемого в про- изводстве лекарственных средств клеточной и генной терапии для медицинского примене- ния. Положения общей фармакопейной статьи не исключают использования альтернативных способов производства и методов его контроля. Производитель исходного сырья несет ответ- ственность за его квалификацию (подтверж- дение пригодности для применения по назна- чению) в соответствии с указаниями данной общей фармакопейной статьи. Пользователь исходного сырья несет полную ответственность за обеспечение надлежащего качества исход- ного сырья для конкретного использования по назначению. Учитывая изменения профиля качества лекарственного средства для клеточной и ген- ной терапии в процессе его фармацевтической разработки и клинических исследований каче- ство исходного сырья оценивают в зависимости от этапа разработки. Безопасность пациентов должна быть обеспечена на ранней стадии клинического исследования. Цель состоит в том, чтобы иметь соответствующую стратегию квалификации исходного сырья при использо- вании в производстве лекарственных средств для клеточной и генной терапии. Следует от- метить, что изменения в исходном сырье в те- чение жизненного цикла лекарственного сред- ства для клеточной и генной терапии могут повлиять на качество лекарственного средства и, следовательно, потребовать дополнительных исследований для подтверждения сопостави- мости. Влияние исходного сырья на качество, безопасность и эффективность лекарственно- го средства для клеточной и генной терапии определяют с использованием подходов, ос- нованных на оценке риска. Исходное сырье используют при последовательном получении действующего (активного) вещества, активной фармацевтической субстанции или лекарствен- ного препарата определенного качества с точ- ки зрения биологической активности, профиля примесей, риска контаминации (бактериями, вирусами и др.), стабильности и др.
С точки зрения оценки риска предпочтительнее не ис- пользовать сырье животного и человеческого происхождения. Биологическое происхождение исходного сырья, используемого для производства лекар- ственных средств для клеточной и генной те- рапии, обусловливает особые требования к его качеству. В общей фармакопейной статье пред- ставлены примеры важнейших показателей ка- чества, характерных для различных классов сырья. 137 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Общая фармакопейная статья распростра- няется на исходное сырье биологического про- исхождения, используемое в производстве ле- карственных средств для клеточной и генной терапии для медицинского применения. Понятие «исходное сырье» относится к сырью, не пред- назначенному для вхождения в состав активной фармацевтической субстанции или действую- щего (активного) вещества, но используемого при их получении. Исходное сырье может быть выделено из различных биологических источни- ков или получено с использованием технологии рекомбинантной ДНК (рДНК). Общая фармакопейная статья применима к следующим классам исходного сырья: – сыворотки и заменители сыворотки; – белки, полученные с использованием тех- нологии рДНК (например, факторы роста, ци- токины, гормоны, ферменты и моноклональные антитела); – белки, выделенные из биологического ма- териала, (например, ферменты и поликлональ- ные антитела); – векторы. Общие указания данной общей фармакопейной статьи могут быть применены к другим классам биологического сырья, в случае приемлемости. 2. ОЦЕНКА РИСКА Оценку влияния исходного сырья биологи- ческого происхождения на качество и безопас- ность лекарственных средств для клеточной и генной терапии должен проводить пользователь сырья. Применение одного отдельного метода или их комбинации не может полностью гаран- тировать качество, функциональность и безо- пасность сырья для использования по целевому назначению. Оценка риска должна учитывать происхождение и прослеживаемость исходного сырья, соответствующий этап процесса произ- водства, в котором оно использовалось, а также возможность производственного процесса кон- тролировать или удалять исходное сырье из ле- карственного средства. Любой фактор риска должен быть оценен по соотношению «польза – риск», в том числе обусловленный исходным сырьем биологиче- ского происхождения. При оценке риска следует учитывать воздействие на пациента остаточных количеств исходного сырья в лекарственном препарате с потенциально опасными эффектами (например, неблагоприятные иммунные реакции). 3. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ 3.1. ПРОИСХОЖДЕНИЕ Происхождение исходного сырья и при необходимости любых биологических матери- алов, использованных для производства сырья, должно быть известно. Особое внимание долж- но быть уделено рискам, связанным с источни- ком материалов (включая их объединение), ис- пользуемых для производства исходного сырья. Исходное сырье можно разделить на следу- ющие категории в зависимости от источника сырья и материалов, используемых для его про- изводства: – сырье животного или человеческого про- исхождения; – сырье, произведенное с использованием материалов животного или человеческого про- исхождения; – сырье, не содержащее материалов живот- ного или человеческого происхождения. Должна быть задокументирована прослежи- ваемость всего исходного сырья, при этом осо- бое внимание необходимо уделить материалам, безопасность которых является неотъемлемым фактором безопасности лекарственного препа- рата, то есть материалам животного или челове- ческого происхождения.
В связи с риском передачи агентов губчатой энцефалопатии животных рекомендуется мини- мизировать использование сырья животного или человеческого происхождения. Если такое сырье необходимо для производства лекарственных препаратов для клеточной и генной терапии, принимают соответствующие меры для сни- жения риска передачи агентов инфекционных заболеваний, таких как вирусы, прионы, бакте- рии и простейшие. Для получения крови и материалов из тканей человека можно привлекать только тщательно проверенных доноров, которые были надлежа- щим образом протестированы на наличие пато- генных агентов. Кровь и материалы, полученные из тканей человека, должны соответствовать законодательству государств – членов Сою- за в сфере трансплантации, донорства крови и ее компонентов. Меры по прослеживаемости должны позволить отследить каждую донацию 138 от забора крови и биологического материала до исходного сырья и конечного продукта и в об- ратном направлении. Животные, используемые для получения сы- рья, должны отвечать определенным санитар- ным требованиям, быть пригодными для упо- требления в пищу человеком и выращиваться в контролируемых условиях, если приемлемо. Если происхождение животных не полностью прослеживается (например, дикие животные), следует учитывать информацию об их географи- ческом местоположении на момент отлова. Если в качестве сырья используются век- торы или белки, полученные с использовани- ем технологии рДНК, необходимо проследить их происхождение до главного банка клеток или вирусного посевного материала. Для всего исходного сырья животного или человеческого происхождения или произведен- ного с использованием материалов животного или человеческого происхождения проводят оценку вирусной контаминации в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи 2.3.1.3. Вирусная безопасность. Объем испытаний для обеспечения вирус- ной безопасности зависит от результатов перво- начальной оценки риска. Кроме того, проводят оценку риска в отношении передачи агентов губчатой энцефалопатии и принимают соответ- ствующие меры для минимизации таких рисков согласно указаниям общей фармакопейной ста- тьи 2.3.19.3. Минимизация риска контаминации лекарственных средств инфекционными аген- тами прионных заболеваний. 3.2. ПРОИЗВОДСТВО Исходное сырье должно производиться в рамках надлежащей системы качества произ- водственного процесса. Для гарантии контроля производственного процесса и стабильного вы- пуска сырья заданного качества осуществляют соответствующий внутрипроизводственный контроль. Показатели качества исходного сырья включают идентификацию, чистоту и биологи- ческую активность, если приемлемо. Должны быть установлены соответствующие специфи- кации в отношении идентификации, испытаний, чистоты и профиля примесей. Производствен- ный процесс должен быть оптимизирован таким образом, чтобы постоянно обеспечивать удале- ние посторонних агентов и опасных примесей или минимизировать их содержание, сохраняя при этом заданное качество сырья. Это может быть достигнуто с помощью: – использования валидированных процедур инактивации или очистки (например, стерилиза- ция гамма-облучением или поддержание низкого рН в процессе хроматографии, если применимо); – подтверждения способности производ- ственного процесса минимизировать, уда- лять или инактивировать посторонние агенты или опасные примеси; – испытаний на наличие посторонних аген- тов или опасных примесей. Исходное сырье должно быть стерильным и произведено в асептических условиях и (или) подвергнуто финишной стерилизации, при от- сутствии другого обоснования.
Если исходное сырье нестерильно, должен быть известен уро- вень его микробиологической чистоты. В исходном сырье могут быть использованы добавки, например, стабилизаторы. Если анти- биотики и стабилизаторы биологического проис- хождения используют при производстве исходно- го сырья, необходимо обосновать их присутствие. Следует описать выбор, применение, качество и концентрацию добавок в исходном сырье, а также их влияние на само исходное сырье. 3.3. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ Исходное сырье должно отвечать заранее установленным требованиям к качеству в отно- шении идентификации, чистоты и биологической активности. Для подтверждения пригодности исходного сырья его предполагаемому использо- ванию проводят испытания с применением соот- ветствующих валидированных методик. Испытание на подлинность должно выявить уникальность исходного сырья и его отличия от родственных или подобных соединений. Примеси включают производственные примеси (остаточные белки клетки-хозяина, остаточную ДНК клетки-хозяина и вектор, в случае реком- бинантных белков, а также другие биологиче- ские или химические вещества) и родственные примеси (агрегаты и продукты деградации). Содержание исходного сырья представляют как в абсолютном, так и относительном выражении. Для количественного определения содержания можно использовать испытания на биологиче- скую активность. 3.3.1. Идентификация Испытания на подлинность должны быть специфичными для конкретного исходного сы- 139 рья и основаны на особенностях молекуляр- ной структуры и состава или других соответ- ствующих физико-химических, биологических или иммунохимических свойствах. Методы, используемые при определении биологической активности или чистоты исходного сырья, так- же можно применить для его идентификации. Идентификация может быть проведена путем сравнения с соответствующим стандартным образцом или репрезентативной серией сырья. 3.3.2. Испытания К исходному сырью применяются следу- ющие испытания (см. также разделы данной общей фармакопейной статьи для конкретного исходного сырья). Прозрачность и цветность раствора. Жид- кое или восстановленное лиофилизированное сырье должно соответствовать пределам, уста- новленным для конкретного исходного сырья в отношении степени опалесценции (2.1.2.1) и интенсивности окрашивания (2.1.2.2). Время растворения. Лиофилизированное сырье должно полностью растворяться в ука- занном объеме восстанавливающего раствора в течение определенного времени и при опре- деленной температуре, установленных для кон- кретного исходного сырья. Осмоляльность (2.1.2.32). Значение осмо- ляльности должно соответствовать пределам, установленным для конкретного исходного сырья. рН (2.1.2.3). Значение рН должно соответ- ствовать пределам, установленным для конкрет- ного исходного сырья. Примеси элементов. Содержание примесей элементов не должно превышать пределы, уста- новленные для конкретного исходного сырья. Общий белок (2.1.5.14). Содержание обще- го белка должно соответствовать пределам, уста- новленным для конкретного исходного сырья. Родственные примеси. Содержание приме- сей, связанных с продуктом, не должно превы- шать пределы, установленные для конкретного исходного сырья. Микробиологический контроль. Исполь- зуемое исходное сырье в зависимости от приро- ды должно выдерживать требования испытания на стерильность (2.1.6.1) или микробиологиче- скую чистоту (2.1.6.6). Вирусная контаминация. В зависимости от природы исходного сырья определяют соответ- ствующую вирусную контаминацию. Бактериальные эндотоксины (2.1.6.8).
Содержание бактериальных эндотоксинов не должно превышать предел, установленный для конкретного исходного сырья. Микоплазмы. Исходное сырье не должно содержать микоплазм. Стабилизатор. Содержание стабилизатора должно соответствовать пределам, установлен- ным для конкретного исходного сырья, если применимо. Вода (2.1.5.12). Содержание воды в исход- ном сырье в виде лиофилизата должно соответ- ствовать пределам, установленным для конкрет- ного исходного сырья. 3.3.3. Количественное определение Содержание (например, содержание бел- ка) или состав исходного сырья определяют с использованием подходящей валидированной методики. Биологическую активность определяют с использованием подходящей валидирован- ной методики. Биологическую активность вы- ражают в переcчете на миллиграмм общего белка (удельная активность), если применимо (например, для ферментов). Биологическую ак- тивность рекомбинантного белка определяют, например, с помощью клеточной пролиферации, клеточной дифференцировки или определения ферментативной активности. Для конкретного белка может существовать несколько приемле- мых биологических методик. Для антител мож- но использовать иммунологические анализы на основе клеток и испытания, основанные на свя- зывании лигандов и аффинности. 3.3.4. Стандартный образец или стандартная серия Для идентификации, количественного опре- деления и других испытаний используют соот- ветствующий стандартный образец, в качестве которого может быть утверждена репрезента- тивная серия исходного сырья. По возможно- сти рекомендуется использовать утвержденные стандартные образцы, такие как стандартные образцы Фармакопеи Союза или международ- ные стандартные образцы Всемирной организа- ции здравоохранения. 3.4. ХРАНЕНИЕ Должны быть установлены срок годности (срок хранения) и условия хранения исходного сырья. 140 3.5. МАРКИРОВКА На этикетке указывают срок годности (срок хранения), условия хранения и использования, а также код, который может потребоваться для отслеживания, включая происхождение исход- ного сырья. 4. СЫВОРОТКИ И ЗАМЕНИТЕЛИ СЫВОРОТКИ 4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Сыворотки животного или человеческо- го происхождения и заменители сыворотки (включая лизаты тромбоцитов и другие добав- ки для роста неопределенного состава, кон- диционированные среды, кровь и другие кле- точные компоненты) используют в качестве добавок (компонентов) для роста культуры клеток. Сыворотки и заменители сыворотки, исполь- зуемые для стимулирования клеточного роста, обычно представляют собой сложные биологи- ческие смеси, точный состав которых не всегда возможно определить. В связи с их сложным составом особое внимание необходимо уделять проверке постоянства и стабильности производ- ства каждой серии. Сыворотка крови крупного рогатого скота. При использовании сыворотки крови крупного рогатого скота она должна отвечать требованиям соответствующей частной фарма- копейной статьи. Сыворотка крови человека и лизаты тром- боцитов. Сыворотка крови человека и лизаты тромбоцитов, используемые в качестве исходного сырья для производства лекарственных препара- тов для клеточной и генной терапии, могут быть получены из крови реципиента (аутологичные) или от другого индивидуума (аллогенные). Кондиционированная среда. Кондицио- нированные среды, выделенные и очищенные из супернатанта культивируемых клеток, также могут быть использованы для увеличения про- лиферации клеток за счет различных факторов роста и цитокинов, секретируемых клетками в культуральную среду. Другие компоненты для роста с неопреде- ленным составом.
Клеточные и (или) тканевые лизаты могут быть использованы в качестве до- бавок для роста. Композитная среда. Композитные среды содержат компоненты для роста, такие как сы- воротка крови крупного рогатого скота, факто- ры роста и др. Принципы, описанные в данном разделе общей фармакопейной статьи, примени- мы к отдельным ингредиентам биологического происхождения и (или) биологически активным ингредиентам композитных сред. 4.2. ПРОИЗВОДСТВО Перед использованием серии в качестве исходного сырья вследствие потенциальных различий в качестве между сериями сыворотки, клеточного или тканевого лизата необходимо подтвердить подходящими методами стабиль- ность каждой серии. Ввиду присущего риска передачи инфекци- онных агентов из объединенной плазмы, сыво- роток или других производных, полученных из объединенной аллогенной крови или плазмы человека, как правило, ограничивают количе- ство объединяемых донаций, если только при производстве не используют надлежащие ме- тоды для инактивации или удаления вирусов. Для кондиционированных сред предпочтительна система посевных материалов (банков клеток). Необходимо обеспечить удаление клеток из сре- ды и по возможности определить потенциаль- ные примеси, происходящие из этих клеток. 4.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Общепризнано, что точный качественный состав сывороток и заменителей сыворотки трудно определить. Тем не менее, приблизитель- ный состав белков в обоих случаях может быть установлен, например, с помощью электрофоре- за. Проводят испытания для определения обще- го белка или любых химических компонентов, если применимо. Для сыворотки крови челове- ка электрофореграмма должна соответствовать образцу контрольной серии сыворотки. В ка- честве альтернативы подлинность может быть подтверждена путем сравнения содержания альбумина с его содержанием в соответству- ющей контрольной серии сыворотки. В каче- стве замены сравнения содержания альбумина с контрольной сывороткой можно использовать электрофореграмму белков или маркеры, секре- тируемые клетками или тромбоцитами. Чело- веческое происхождение устанавливают подхо- дящим иммунохимическим методом (2.1.6.15), при отсутствии других указаний. 141 4.4. ИСПЫТАНИЯ См. раздел 3.3.2 данной общей фармакопей- ной статьи. Гемоглобин. Содержание гемоглобина не должно превышать предел, установленный для конкретного исходного сырья, если применимо. Примеси клеточного происхождения. Содержание примесей клеточного происхож- дения не должно превышать пределы, установ- ленные для конкретного исходного сырья, если применимо. Испытания на вирусную контаминацию. Для сыворотки крови крупного рогатого скота применяют испытания на вирусную контами- нацию, указанные в соответствующей частной фармакопейной статье. Для сыворотки крови человека применяют испытания на вирусную безопасность, указанные в соответствующей частной фармакопейной статье. 4.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Сыворотки или заменители сыворотки долж- ны обладать свойствами, способствующими ро- сту клеток, в пределах, установленных для кон- кретного исходного сырья. Для подтверждения пригодности использования по целевому назна- чению может потребоваться более одного вида испытаний. 5. БЕЛКИ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ рДНК 5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Белки и пептиды, полученные с использова- нием технологии рДНК, применяемые в каче- стве исходного сырья, включают факторы роста, цитокины, гормоны, ферменты и моноклональ- ные антитела. Факторы роста, цитокины и гормоны. Ве- щества, используемые для стимуляции, инакти- вации, стимулирования роста или дифференци- ровки клеток в системах культивирования клеток. Другие белки.
Ферменты (например, колла- геназы) в качестве исходного сырья могут быть использованы для извлечения (экстракции) дей- ствующих (активных) веществ из тканей или жидкостей. Другие белки (например, фибронек- тин) могут быть использованы в качестве компо- нентов культуральной среды. Моноклональные антитела. В качестве исходного сырья используют иммуноглобули- ны и фрагменты иммуноглобулина с опреде- ленной специфичностью. Антитела могут быть конъюгированными (химически модифици- рованными) или неконъюгированными. Стан- дартные химические модификации включают введение флуоресцентной метки и конъюгацию с магнитными микросферами. Антитела в каче- стве исходного сырья могут быть использованы для отбора, активации и (или) стимуляции, выделения или очистки клеток в культуре клеток. 5.2. ПРОИЗВОДСТВО Производство белковых продуктов с ис- пользованием технологии рДНК основано на валидированной системе посевных материа- лов с использованием подходящей системы вектор/клетка-хозяин. В системе посевного материала обычно используют главный банк клеток и, если применимо, рабочий банк клеток. Рекомбинантный белок экстрагируют и очи- щают с помощью различных методов, таких как экстракция, преципитация, центрифугирование, концентрация, фильтрация и (или) хроматогра- фия. В процессе производства рекомбинантно- го белка производственные примеси, включая остаточную ДНК клетки-хозяина или ДНК век- тора, остаточные белки клетки-хозяина, должны быть снижены до приемлемого уровня. Особое внимание следует уделять родственным приме- сям (примесям, связанным с продуктом). 5.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Подлинность устанавливают с помощью подходящих методов, например, электрофореза (2.1.2.30), пептидного картирования (2.1.2.39), изоэлектрического фокусирования (2.1.2.38) или высокоэффективной жидкостной хромато- графии (2.1.2.28). Для антител идентификация основана на определении класса иммуноглобу- линов, изотипа и (или) специфичности. Подхо- дящими для идентификации также считаются иммунохимические методы (2.1.6.15) и опреде- ление активности (в качестве дополнения к вы- шеуказанным методам). 5.4. ИСПЫТАНИЯ См. раздел 3.3.2 данной общей фармакопей- ной статьи. 142 Остаточные белки клетки-хозяина и оста- точная ДНК клетки-хозяина или вектора. В случаях, когда это применимо к конкретному исходному сырью, содержание остаточных ДНК клетки-хозяина или вектора и (или) белка опре- деляют с использованием подходящего метода, если только производственный процесс не был валидирован для подходящей очистки и их со- держание не превышает пределы, установлен- ные для конкретного исходного сырья. Родственные белки. Родственные белки (например, поликлональные антитела с нео- пределенной специфичностью, гликоформы, продукты распада и окисления, олигомеры и агрегаты) определяют с использованием жид- костной хроматографии, электрофоретических или иммунологических методов. Их содержание не должно превышать пределы, установленные для конкретного исходного сырья. 5.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Содержание. Количественное определение белка проводят с помощью подходящих методов, например, жидкостной хроматографии (2.1.2.28) или спектрофотометрии в ультрафиолетовой об- ласти (2.1.2.24). Биологическая активность. Биологи- ческую активность рекомбинантного белка определяют, например, с помощью клеточной пролиферации, клеточной дифференцировки или определения ферментативной активности. Для конкретного белка могут существовать несколько приемлемых биологических методик.
Для антител можно использовать иммунологи- ческие анализы на основе клеток и испытания, основанные на связывании лигандов и аффинно- сти. Активность выражают в пересчете на мил- лиграмм общего белка (удельная активность), если применимо. 6. БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА 6.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Белки, выделенные из биологического ма- териала и используемые в качестве исходного сырья, включают ферменты (например, трипсин и эндонуклеазы свиного происхождения), поли- клональные антитела, другие белки (например, альбумин и трансферрин) и пептиды. Белки могут быть человеческого, животного, расти- тельного или микробиологического происхож- дения. Белки, выделенные из биологического материала, используют для стимулирования ро- ста, дифференцировки или очистки культивиру- емых клеток и извлечения действующих (актив- ных) веществ из тканей и (или) жидкостей. 6.2. ПРОИЗВОДСТВО Белки выделяют из крови, тканей животных или человека, растительных или микробиоло- гических источников с использованием меха- нических и (или) химических методов. Затем их подвергают процессам очистки с использо- ванием различных методов, например, центри- фугирования, фильтрации, хроматографии и концентрирования. Поликлональные антитела получают путем иммунизации специфическим антигеном с последующей очисткой. Очистка антител включает селективное обогащение или специфическое выделение антител из сыворот- ки на основе физико-химического фракциони- рования, класс-специфического сродства и (или) антиген-специфической аффинности. В процес- се производства белков производственные при- меси, такие как компоненты крови, фрагменты тканей или контаминирующие белки, должны быть снижены до приемлемого уровня. Особое внимание необходимо уделять родственным примесям (примесям, связанным с продуктом). 6.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Подлинность устанавливают с помощью подходящих методов, например, электрофоре- за (2.1.2.30), изоэлектрического фокусирования (2.1.2.38), пептидного картирования (2.1.2.39), жидкостной хроматографии (2.1.2.28) и иммуно- химических методов (2.1.6.15). 6.4. ИСПЫТАНИЯ См. раздел 3.3.2 данной общей фармакопей- ной статьи. Производственные примеси. Вещества, выделенные из исходного материала (напри- мер, компоненты крови, фрагменты тканей или неродственные белки), определяют с ис- пользованием подходящих методов, а их содер- жание не должно превышать пределы, установ- ленные для конкретного исходного сырья. Родственные белки. Родственные белки (например, антитела с неопределенной специ- фичностью, продукты деградации и окисления, олигомеры и агрегаты) определяют с использо- 143 ванием подходящих методов, а их содержание не должно превышать пределы, установленные для конкретного исходного сырья. 6.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Содержание белка определяют с помощью подходящих методов, например, жидкостной хроматографии (2.1.2.28) или спектрофотоме- трии в ультрафиолетовой области (2.1.2.24). Биологическая активность. В соответ- ствующих случаях биологическую активность белка устанавливают, например, с помощью определения ферментативной активности, им- мунологических испытаний или в испытаниях, основанных на пролиферации или дифферен- цировке клеток. Для трипсина испытание мо- жет быть проведено согласно указаниям соот- ветствующей частной фармакопейной статьи. Активность выражают в пересчете на милли- грамм общего белка (удельная активность), если применимо. 7.
ВЕКТОРЫ Векторы, которые могут быть использованы в качестве исходного сырья для производства ле- карственных средств для клеточной и генной те- рапии, включают ДНК-векторы (например, плаз- миды, векторы на основе транспозонов), а также вирусные и бактериальные векторы (например, модифицированные виды Lactococcus). Векто- ры обычно рассматривают как исходные мате- риалы, входящие в состав конечного продукта, и поэтому указания данной общей фармакопей- ной статьи к ним не применяются. Если векторы не предназначены для включения в состав ко- нечного продукта и не являются исходным ма- териалом (например, плазмиды-помощники или вирусы-помощники), следует придерживаться рекомендаций данной общей фармакопейной статьи и принципов производства и контроля качества, изложенных в общей фармакопейной статье предназначенной для лекарственных средств для медицинского применения с исполь- зованием доставки генов. 203190006-2023 2.3.19.6. БЕЛКИ-НОСИТЕЛИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИН ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ Использование альтернативных белков-но- сителей, методов производства и испытаний приемлемо при условии, что они были разреше- ны уполномоченным органом. Бактериальные полисахариды не способны индуцировать зависимый от Т-клеток иммун- ный ответ В-клеток, необходимый для ответной реакции иммунологической памяти, и, как пра- вило, имеют слабую иммуногенность у детей в возрасте до двух лет. Данное ограничение пре- одолевается конъюгированием полисахаридов с белками-носителями. Высоко иммуногенные белки-носители, конъюгированные с бактери- альными полисахаридами, увеличивают способ- ность полисахаридов вызывать защитную ответ- ную реакцию у иммунизированных. В качестве белков-носителей в полисаха- ридных вакцинах используют: анатоксины, не- токсичные мутантные токсины, поверхностные или другие мембранные белки, выделенные из микроорганизмов. Микроорганизмы, используе- мые при их производстве, могут иметь генетиче- ски модифицированное происхождение. Метод производства, используемый для бел- ков-носителей, должен обеспечивать постоянство получаемых серий белков-носителей, подходящих для конъюгации с полисахаридными антигенами. Перед конъюгацией с полисахаридом могут быть установлены соответствующие критерии приемлемости низкой бионагрузки. Обязатель- ным условием является фильтрация белка-носи- теля перед хранением через фильтр, задержива- ющий бактерии, и принятие соответствующих мер для предотвращения контаминации и роста микроорганизмов во время хранения. Производство белков-носителей основыва- ется на системе посевного материала. Должно быть подтверждено отсутствие контаминации посевного материала с использованием подходя- щего метода с соответствующей чувствительно- стью. При необходимости культуру микроорга- низмов инактивируют, белки-носители очищают подходящим методом. 144 Белки-носители характеризуют одним или более подходящими методами (например, электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом, изоэлектрическое фокусиро- вание, высокоэффективная жидкостная хрома- тография, эксклюзионная хроматография с де- текцией многоуглового лазерного рассеивания, аминокислотный анализ, аминокислотное секве- нирование, круговой дихроизм, флуоресцент- ная спектрометрия, пептидное картирование, масс-спектрометрия). Чистоту белков подтвер- ждают подходящим методом. Для подтвержде- ния, что продукт не содержит специфических токсинов, где это применимо, выполняют соот- ветствующее испытания в процессе валидации или рутинного анализа.
В случае необходимо- сти этапа очистки проводят мониторинг удале- ния отдельных производственных примесей для подтверждения постоянства процесса очистки. В случае использования рекомбинантных бел- ков-носителей выполняют испытания, как ми- нимум, для следующих примесей: – остаточные белки клетки-хозяина, включая белковые остатки экспрессионного вектора; – остаточная ДНК клетки-хозяина. Для приготовления конъюгатов могут быть использованы только белки-носители, выдержи- вающие следующие испытания. Идентификация. Для подтверждения под- линности белка-носителя используют подходя- щий метод. рН (2.1.2.3). Если применимо, проводят ис- пытание белка-носителя до конъюгирования на соответствие пределам, одобренным уполно- моченным органом. Содержание белка. Содержание белка-но- сителя определяют с использованием подходя- щего метода на соответствие пределам одобрен- ным, уполномоченным органом. Бактериальные эндотоксины (2.1.6.8). Содержание бактериальных эндотоксинов опре- деляют на соответствие пределам, одобренным уполномоченным органом. Кроме того, к белкам-носителям применяют следующие требования. Дифтерийный анатоксин. Дифтерийный ана- токсин, произведенный как описано в частной фар- макопейной статье на вакцину для профилактики дифтерии адсорбированную, должен выдерживать требования указанной частной фармакопейной ста- тьи для нерасфасованного очищенного анатоксина, за исключением испытания на стерильность. Столбнячный анатоксин. Столбнячный анатоксин, произведенный как описано в част- ной фармакопейной статье на вакцину для про- филактики столбняка адсорбированную, должен выдерживать требования указанной частной фармакопейной статьи для нерасфасованного очищенного анатоксина, за исключением того, что антигенная чистота допускается не менее 1500 Lf на миллиграмм белкового азота, и испы- тание на стерильность не требуется. Дифтерийный белок CRM 197. Дифте- рийный белок CRM 197 производят при куль- тивировании генетически модифицированных (С7/β197) или немодифицированных (mCRM) микроорганизмов Corynebacterium diphtheriae, или получают с помощью технологии рекомби- нантных ДНК, используя в качестве продуцен- тов, например, генетически модифицированные штаммы Escherichia coli. Супернатант культуры клеток может быть сконцентрирован ультра- фильтрацией и очищен путем последовательных стадий осаждения, фильтрации и хроматогра- фирования. В случае, когда дифтерийный белок CRM 197 производится на той же производ- ственной площадке, что и дифтерийный токсин, он должен иметь отличия от активного токси- на, четко определяемые подходящим методом. Чистота дифтерийного белка CRM 197 должна быть не менее 90 %. Поверхностный мембранный белковый комплекс Neisseria meningitidis группы В. Поверхностный мембранный белковый ком- плекс Neisseria meningitidis группы В выде- ляют из бактериальной клеточной культуры с использованием буферного раствора, содер- жащего детергент. Первым удаляют клеточный дебрис. Мембранный белковый комплекс мо- жет быть сконцентрирован и очищен после- довательно фильтрацией и дополнительными подходящими стадиями очистки. Содержание липополисахаридов не должно превышать 8 %. Относительное количество основных по- верхностных мембранных белков должно быть утверждено уполномоченным органом. Поверх- ностный мембранный белковый комплекс дол- жен выдерживать испытание на пирогенность (2.1.6.2): каждому кролику вводят по 0,25 мкг поверхностных мембранных белков на кило- грамм массы тела. Рекомбинантный белок D. Белок D – поверхностный белок нетипичной Haemophilus influenzae.
Его получают, используя генетиче- 145 ски модифицированный штамм E. coli, несущий плазмиду с последовательностью, кодирую- щей белок D. Для активации экспрессии белка D, модифицированный штамм культивируют в подходящей жидкой питательной среде. В конце культивирования выполняют ста- дию очистки. Чистота белка D должна быть не менее 95 %. 146 2.3.20. РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ 203200001-2023 2.3.20.1. ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕКУРСОРЫ ДЛЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Общая фармакопейная статья устанавливает общие требования к химическим прекурсорам, предназначенным для производства или изго- товления радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Химические прекурсоры для радиофарма- цевтических лекарственных препаратов (хи- мические прекурсоры) представляют собой нерадиоактивные вещества, полученные путем химического синтеза и предназначенные для хи- мического связывания с радионуклидом в про- цессе производства или изготовления радиофар- мацевтического лекарственного препарата. Если химический прекурсор, не описанный в частной фармакопейной статье, используют для радиофармацевтического лекарственного препарата, изготовленного для особых потреб- ностей отдельных пациентов, необходимость соответствия его требованиям данной общей фармакопейной статьи должна решаться, исходя из оценки риска. Такая оценка риска включает: – качество химического прекурсора и инфор- мацию, необходимую для оценки его качества; – любые процедуры последующей обработ- ки после введения радиоактивной метки (кото- рая может включать или не включать очистку перед применением); – количество, использованное для приготов- ления дозы (главным образом, для диагностиче- ского или терапевтического применения), и ча- стоту введения пациенту. Если химические прекурсоры производят с использованием веществ, полученных от чело- века или животных, должны применяться тре- бования общей фармакопейной статьи 2.3.1.3. Вирусная безопасность. Если химические прекурсоры получают от животных, восприимчивых к возбудителям губчатой энцефалопатии, за исключением экс- периментальных целей, они должны соответ- ствовать, если применимо, требованиям общей фармакопейной статьи 2.3.19.2. Продукты с ри- ском передачи возбудителей губчатой энцефа- лопатии животных. ПРОИЗВОДСТВО Химические прекурсоры получают с помо- щью разработанных процедур, обеспечивающих постоянство качества продукции и ее выпуск в соответствии с требованиями частной фарма- копейной статьи или утвержденных специфи- каций. Химические прекурсоры должны про- изводиться в рамках соответствующей системы качества. СВОЙСТВА Положения данного раздела частной фарма- копейной статьи (например, относящиеся к рас- творимости или температуре плавления) не мо- гут рассматриваться в качестве аналитических требований и носят информационный характер. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Для подтверждения подлинности химиче- ских прекурсоров применяют подходящие ана- литические методы, например, спектрометрию ядерного магнитного резонанса, инфракрас- ную спектрофотометрию, масс-спектрометрию и хроматографические методы. ИСПЫТАНИЯ Родственные примеси.
При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье или обоснования и разрешения упол- номоченного органа органические примеси, присутствующие в химических прекурсорах, и неорганические примеси, присутствующие в неорганических химических прекурсорах, должны подлежать информированию, иденти- 147 фикации и контролю в соответствии с нижепри- веденными значениями: – порог информирования 0,2 %; – порог идентификации 2,0 %; – общее содержание неспецифицированных примесей не более 3,0 %. Для сильнодействующих примесей или примесей, способных вызывать токсическое или недопустимое фармакологическое действие, могут устанавливаться особые пороговые значе- ния. Если в частной фармакопейной статье не предусмотрен соответствующий контроль но- вой примеси, должно быть разработано и вклю- чено в спецификацию качества химического прекурсора подходящее испытание для ее кон- троля. Остаточные органические растворители. Содержание остаточных органических раство- рителей ограничивают в соответствии с ука- заниями общей фармакопейной статьи 2.3.2.0. Остаточные органические растворители с использованием метода, приведенного в об- щей фармакопейной статье 2.1.4.19. Идентифи- кация и контроль остаточных растворителей, или другого подходящего метода. Растворители класса 1 не должны приме- няться на последней стадии процесса произ- водства химических прекурсоров. Если их ис- пользования на более ранней стадии процесса производства избежать не удается, применяют пределы, указанные в таблице 2.3.2.0.-3 общей фармакопейной статьи 2.3.2.0. Остаточные органические растворители. Предельное содержание растворителей клас- сов 2 и 3, основанное на значениях допустимого суточного воздействия, не должно превышать 0,5 %. Для растворителей классов 2 и 3 допускается определение потери в массе при высушивании или определение отдельного растворителя. Если для растворителей указанных классов обосно- ванный и разрешенный уполномоченным орга- ном предел содержания составляет более 0,5 %, требуется определение каждого растворителя по отдельности. Примеси элементов. Если известно или предполагается, что при производстве хими- ческих прекурсоров применение металличе- ских катализаторов или металлсодержащих ре- активов приводит к присутствию остаточных металлов, содержание каждого из них (Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Os, Mo, Ni, Cr, V, Pb, Hg, Cd и Tl) в химических прекурсорах должно соответство- вать пределу 0,01 % при отсутствии более жест- ких пределов, установленных в частной фарма- копейной статье. По возможности применяют методологию, описанную в общей фармакопейной статье 2.1.4.23. Определение примесей элементов. Микробиологическая чистота. Общее чис- ло аэробных микроорганизмов должно быть не более 103 КОЕ на грамм нерасфасованной про- дукции или не более 102 КОЕ в расчете на одно- дозовую и (или) многодозовую упаковку хими- ческого прекурсора (2.1.6.6). Общее число дрожжей и грибов должно быть не более 102 КОЕ на грамм нерасфасован- ной продукции или не более 101 КОЕ в расчете на однодозовую и (или) многодозовую упаковку химического прекурсора (2.1.6.6). Бактериальные эндотоксины. При отсут- ствии другого обоснования и разрешения упол- номоченного органа предельное содержание бактериальных эндотоксинов не должно пре- вышать 100 МЕ на грамм нерасфасованной продукции или не более 10 МЕ в расчете на од- нодозовую и (или) многодозовую упаковку хи- мического прекурсора (2.1.6.8.
Бактериальные иэндотоксины) КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ При отсутствии другого обоснования и раз- решения уполномоченного органа содержание химических прекурсоров определяют с исполь- зованием подходящего метода. ХРАНЕНИЕ Химические прекурсоры хранят в воздухо- непроницаемой упаковке в условиях, обеспечи- вающих надлежащую стабильность. МАРКИРОВКА Маркировка химических прекурсоров долж- на соответствовать требованиям права Союза и содержать необходимую информацию. На эти- кетке указывают назначение в качестве химиче- ского прекурсора для радиофармацевтических лекарственных препаратов. В сопроводитель- ной информации может быть рекомендовано испытание промышленных серий химического 148 прекурсора перед использованием в производ- стве или изготовлении радиофармацевтических лекарственных препаратов, обеспечивающее получение из них в указанных условиях радио- фармацевтического лекарственного препарата в необходимом количестве и требуемого качества. 203200002-2023 2.3.20.2. РАДИОФАРМАЦЕВТИ- ЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Радиофармацевтические лекарственные пре- параты представляют собой лекарственные пре- параты, содержащие в готовой для применения лекарственной форме один или несколько ради- онуклидов (радиоактивных изотопов) в качестве действующего вещества или в составе действу- ющего вещества. Общая фармакопейная статья включает также следующие понятия. Радионуклидный генератор – любая си- стема, включающая фиксированный первич- ный (материнский) радионуклид, из которого образуется вторичный (дочерний) радионуклид, извлекаемый путем элюирования или другим способом и используемый для получения ради- офармацевтического лекарственного препарата. Радиофармацевтический набор – лекар- ственный препарат, который подлежит вос- становлению или химическому связыванию с радионуклидами для получения радиофар- мацевтического лекарственного препарата, как правило, перед его применением. Радиофар- мацевтический набор содержит необходимые компоненты для приготовления радиофармацев- тического лекарственного препарата за исклю- чением радионуклида. Радионуклидный (радиофармацевтический) прекурсор – любой радионуклид, предназначен- ный для введения радиоактивной метки в другое вещество перед его применением. Радионуклид- ные прекурсоры могут выпускаться в виде рас- творов для радиоактивной метки. Нуклид является видом атома, характеризу- ющегося числом протонов и нейтронов в ядре (т.е. его атомным номером Z и массовым чис- лом А), а также в ряде случаев энергетическим состоянием ядра. Изотопы элемента представ- ляют собой нуклиды с одинаковым числом про- тонов, но различным количеством нейтронов, т.е. имеют одинаковый атомный номер, но раз- личные массовые числа. Нуклиды, содержащие нестабильные комбинации протонов и нейтро- нов, с постоянной статистической вероятностью самопроизвольно превращаются в стабильные или другие нестабильные комбинации прото- нов и нейтронов. Такие нуклиды являются ра- диоактивными и называются радионуклидами. Первичный нестабильный нуклид называют материнским радионуклидом, а образующийся нуклид (вторичный нуклид) – дочерним. Распад или превращение радионуклидов мо- жет вызывать испускание заряженных частиц, электронный захват или изомерный переход. Заряженные частицы, испускаемые ядром, могут представлять собой альфа-частицы (ядра 4Не) или бета-частицы (отрицательно заряженные, обычно называемые электронами, или положи- тельно заряженные, обычно называемые пози- тронами). Альфа-распаду обычно подвергаются тяжелые ядра (Z ˃ 82). Радионуклиды с дефици- том протонов обычно распадаются с испуска- нием электронов.
Радионуклиды с дефицитом нейтронов обычно распадаются путем электрон- ного захвата или с испусканием позитронов. В последнем случае радионуклиды называют позитрон-излучателями. Позитроны аннигили- руются при взаимодействии с электронами в окружающем материале. Аннигиляция приводит к испусканию двух гамма-квантов с энергией 0,511 МэВ каждый, обычно разлетающихся под углом 180º друг к другу (аннигиляционное излу- чение). Все пути распада могут сопровождать- ся гамма-излучением. Гамма-излучение может частично или полностью замещаться выходом электронов, известных как внутренние конвер- сионные электроны. Данное явление, подобное процессу электронного захвата, приводит к воз- никновению вторичного рентгеновского излуче- ния (вследствие перегруппировки электронов в атоме). Вторичное излучение может частично замещаться выходом электронов, называемых электронами Оже. Радиоактивность (активность) – термин, обычно использующийся для описания явле- ния радиоактивного распада и количественного выражения данного процесса. 149 Радиоактивность лекарственного препара- та определяют количеством ядерных распадов или превращений в единицу времени. В Международной системе единиц (СИ) радиоактивность выражают в единицах «бекке- рель» (Бк): 1 Бк равен одному ядерному распаду в секунду. Обнаружение и измерение радиоактивности проводят в соответствии с указаниями общей фармакопейной статьи 2.1.2.43. Обнаружение и измерение радиоактивности. Измерение абсолютной радиоактивности выполняют только в специализированных ла- бораториях, однако идентификация и количе- ственное измерение радиоактивности могут проводиться относительным способом путем сравнения со стандартизированными препара- тами, которые предоставляются лабораториями, признанными уполномоченным органом, или с использованием поверенного или калиброван- ного оборудования. Радиоактивный распад – изменение состава или внутреннего строения нестабильных атом- ных ядер путем испускания элементарных ча- стиц, гамма-квантов и (или) ядерных фрагмен- тов, протекающее по экспоненциальному закону. Кривая экспоненциального распада (кривая распада) описывается следующим выражением: At = A0e–λt где: At — радиоактивность при времени t; A0 — радиоактивность при времени t = 0; λ — постоянная радиоактивного распада, характерная для каждого радионуклида; e — основание натурального логарифма. Период полураспада (Т1/2 ) – промежуток времени, в течение которого радиоактивность радионуклида уменьшается вдвое от ее первона- чального значения. Период полураспада связан с постоянной радиоактивного распада (λ) следующим уравне- нием: T1/2 = ln2 λ Уравнение экспоненциального распада мо- жет также выражаться в следующем виде, при- годном для быстрой оценки радиоактивности, оставшейся после истечения времени t: At = A0 ( 1 ) t T1/2 2 Проникающая способность каждого вида излучения существенно зависит от его природы и энергии. Альфа-частицы полностью погло- щаются слоем материала от нескольких микро- метров до нескольких десятков микрометров. Бета-частицы полностью поглощаются слоем материала от нескольких миллиметров до не- скольких сантиметров. Гамма-излучение полно- стью не поглощается, а лишь ослабевает. Напри- мер, для ослабления интенсивности излучения в 10 раз может потребоваться пластина свинца толщиной несколько сантиметров. С увеличени- ем плотности материала уменьшается область проникновения альфа- и бета-частиц и больше ослабляется гамма-излучение. Каждый радионуклид характеризуется неизменным периодом полураспада, выражен- ным в единицах времени, природой и энерги- ей излучения (излучений).
Энергию выражают в электронвольтах (эВ), килоэлектронвольтах (кэВ) или мегаэлектронвольтах (МэВ). Радионуклидная чистота – отношение ра- диоактивности основного радионуклида к об- щей радиоактивности радиофармацевтического лекарственного препарата, выраженное в про- центах. Возможные радионуклидные примеси и их допустимые пределы содержания указыва- ются в частных фармакопейных статьях. Радиохимическая чистота – отношение ради- оактивности радионуклида, присутствующего в радиофармацевтическом лекарственном препа- рате в заявленной химической форме, к общей радиоактивности радионуклида в радиофарма- цевтическом лекарственном препарате, выражен- ное в процентах. Возможные радиохимические примеси и их допустимые пределы содержания указываются в частных фармакопейных статьях. Химическая чистота контролируется пу- тем установления допустимых пределов со- держания химических примесей, указанных в частных фармакопейных статьях, и (или) нормативных документах по качеству, и (или) спецификациях. Изотопный носитель – стабильный изотоп данного элемента, присутствующий или до- 150 бавленный в радиофармацевтический лекар- ственный препарат в той же химической форме, что и сам радионуклид. Лекарственный препарат без носителя – лекарственный препарат, не содержащий ста- бильных изотопов того же элемента, что и ра- дионуклид, присутствующий в лекарственном препарате в заявленной химической форме или положении в данной молекуле. Лекарственный препарат без добавления носителя – лекарственный препарат, в кото- рый преднамеренно не добавлены стабильные изотопы того же элемента, что и радионуклид в заявленной химической форме или положении в данной молекуле. Удельная радиоактивность – радиоактив- ность радионуклида, выраженная на единицу массы элемента или его химической формы. Удельную радиоактивность выражают в едини- цах «беккерель на грамм» (Бк/г). Молярная радиоактивность – радиоактив- ность радионуклида, выраженная на единицу количества вещества элемента или его химиче- ской формы. Молярную радиоактивность выра- жают в единицах «беккерель на моль» (Бк/моль). Радиоактивная концентрация – радиоактив- ность радионуклида, выраженная на единицу объема или массы радиофармацевтического ле- карственного препарата. Для радиофармацевти- ческих лекарственных препаратов в виде раство- ров радиоактивную концентрацию выражают величиной радиоактивности на единицу объема радиофармацевтического лекарственного препа- рата, т.е. в виде объемной радиоактивности. Общая радиоактивность – радиоактивность радионуклида, выраженная на единицу формы выпуска радиофармацевтического лекарствен- ного препарата (флакон, капсула, ампула, гене- ратор и др.). ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ Радиофармацевтический лекарственный препарат содержит радионуклид в виде: – элемента в атомной или молекулярной форме, например, 133Хе, [15О]О2; – иона, например, [131I]йодид, [99mTc]пертех- нетат; – структурной единицы, включенной в со- став вещества, адсорбированной на нем или связанной с органическими молекулами путем образования хелатного комплекса, например, [111In]индия оксина или ковалентного соедине- ния, например, 2-[18F]фтор-2-дезокси-D-глюко- зы. Радионуклиды могут быть получены следу- ющими основными способами: – в реакциях с нейтронами (облучение мишеней в ядерных реакторах); – в реакциях с заряженными частицами (об- лучение мишеней в ускорителях, в частности, циклотронах); – путем выделения из радионуклидных ге- нераторов. Вероятность возникновения ядерной реакции зависит от природы и энергии бомбардирующих частиц (протонов, нейтронов, дейтронов и др.) и от природы облучаемых ими ядер.
Скорость образования (выход) данного радионуклида в результате облучения зависит, кроме того, от изотопного состава материала-мишени и его химической чистоты, а в случае нейтронов − от их потока, в случае заряженных частиц – от тока пучка. Помимо описываемой ядерной реакции обычно могут происходить побочные превраще- ния. Вероятность их протекания определяется факторами, изложенными выше. Такие побоч- ные превращения могут приводить к увеличе- нию радионуклидных примесей. Ядерная реакция (превращение) может быть указана в следующей форме: «ядро-ми- шень (бомбардирующая частица, испускаемая частица или излучение) полученные ядра». Например: 58Fe(n, γ)59Fe, 18O(p, n)18F. ОБЛУЧЕНИЕ НЕЙТРОНАМИ Облучение стабильных радионуклидов в ядерных реакторах обычно приводит к воз- никновению ядер с дефицитом протонов, т.е. электрон-излучателей, которые образуются в (n, γ)-реакциях (реакциях радиационного за- хвата). Продукт реакции представляет собой изотоп элемента мишени и поэтому может содержать значительное количество носителя. Некоторые нуклиды с высоким атомным номером обладают свойством деления ядра под действием нейтронов. Ядерное деление, обозначаемое как (n, f)-реакция, приводит к об- разованию большого количества радионуклидов с разной массой и периодом полураспада. Наи- более часто используемой реакцией является реакция деления 235U. Путем облучения 235U 151 в ядерных реакторах и выделения из смеси более 200 образующихся в данном процессе радионуклидов могут быть получены йод-131, молибден-99 и ксенон-133. ОБЛУЧЕНИЕ ЗАРЯЖЕННЫМИ ЧАСТИЦАМИ Облучение стабильных радионуклидов заря- женными частицами обычно приводит к возник- новению ядер с дефицитом нейтронов, которые распадаются или путем электронного захвата, или за счет испускания позитронов. Они обра- зуются, в частности, в (p, xn)-реакциях, где х − число испускаемых нейтронов. Продукт не явля- ется изотопом элемента мишени, а его удельная радиоактивность может быть близкой удельной радиоактивности лекарственного препарата без носителя. РАДИОНУКЛИДНЫЕ ГЕНЕРАТОРЫ В системах радионуклидных генераторов ис- пользуют первичный (материнский) нестабиль- ный радионуклид, который распадается с обра- зованием вторичного (дочернего) радионуклида обычно с более коротким периодом полураспада. Отделяя вторичный радионуклид от пер- вичного нестабильного с помощью химических или физических процессов, можно использовать вторичный радионуклид на значительном рас- стоянии от места производства радионуклидно- го генератора, несмотря на его короткий период полураспада. МАТЕРИАЛЫ МИШЕНЕЙ Изотопный состав и чистота материала ми- шени в совокупности с другими факторами, например, природой и энергией бомбардиру- ющих частиц, определяют соотношение в про- центах основного радионуклида и радионуклид- ных примесей. Использование искусственно обогащенного изотопами материала мишени со значительным избытком необходимого ну- клида-мишени, позволяет повысить выход реак- ции и чистоту целевого радионуклида. Химическая форма, чистота, физическое состояние материала мишени и химические до- бавки, а также условия облучения, физическая и химическая среда определяют химическое состояние и химическую чистоту получаемых радионуклидов. При получении радионукли- дов и, в частности, радионуклидов с коротким периодом полураспада, перед дальнейшей их обработкой и производством радиофармацев- тических лекарственных препаратов не всегда возможно определить какой-либо из показате- лей качества.
Поэтому качество каждой серии материала мишени оценивают перед ее исполь- зованием в серийном процессе получения радио- нуклида и производстве радиофармацевтических лекарственных препаратов. Материал мишени помещают в держатель в газообразном, жидком или твердом состоянии для облучения пучком частиц. Для облучения нейтронами материал мишени обычно поме- щают в кварцевые ампулы или контейнеры из алюминия или титана высокой чистоты. Необ- ходимо установить, что взаимодействие между контейнером и его содержимым не происходит в условиях облучения. Для облучения заряженными частицами держатель материала мишени изготавливают из подходящего металла, по возможности, с входом и выходом, окруженным охлаждающей системой и, как правило, с окном-мишенью из тонкой металлической фольги. Для оценки влияния всех условий на эффек- тивность получения радионуклида по качеству и количеству в процессе получения должны быть точно описаны и учтены следующие фак- торы: – материал мишени; – конструкция держателя материала мишени; – метод облучения; – метод выделения требуемого радионуклида. СВОЙСТВА Наиболее общие физические характеристи- ки радионуклидов, входящих в состав радио- фармацевтических лекарственных препаратов и описываемых в частных фармакопейных ста- тьях, приводятся в Приложении 4.2. Физические характеристики радионуклидов, указанных в Фармакопее Евразийского экономического со- юза. Кроме того, в Приложении указываются физические характеристики основных радиону- клидных примесей, возможных в радионукли- дах, описываемых в частных фармакопейных статьях. Под вероятностью перехода (распростра- ненность) подразумевают вероятность превра- 152 щения ядра в данном энергетическом состоянии посредством соответствующего перехода. Под вероятностью излучения подразуме- вают вероятность испускания атомом радиону- клида соответствующих частиц или лучей. Независимо от значения используемых терми- нов вероятность обычно выражают в процентах. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Радионуклид, как правило, идентифициру- ют по его периоду полураспада, или природе и энергии его излучения (излучений), или обои- ми способами в соответствии с указаниями част- ной фармакопейной статьи. Приблизительный период полураспада – период полураспада, определяемый в течение относительно короткого промежутка времени, предназначенный для подтверждения подлин- ности радиофармацевтического лекарственного препарата и позволяющий получить разрешение на его выпуск в обращение. Рассчитанное значение приблизительного периода полураспада должно находиться в диа- пазоне значений, указанном в частной фармако- пейной статье. Определение природы и энергии излуче- ния. Природу и энергию излучения определяют методом спектрометрии. Для позитрон-излуча- телей природу и энергию излучения обычно не определяют; их идентификацию проводят путем определения периода полураспада и по спектру гамма-излучения. ИСПЫТАНИЯ Для радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов, содержащих радионуклид с коротким периодом полураспада, проведе- ние некоторых из указанных ниже испытаний до выпуска лекарственных препаратов в обра- щение не представляется возможным. Испы- тания, выполнение которых не завершается до выпуска в обращение, приводятся в частной фармакопейной статье. Указанные испытания используют в последующем для контроля произ- водственного процесса. Нерадиоактивные вещества и род- ственные примеси. Данный раздел частной фармакопейной статьи регламентирует опре- деление нерадиоактивных веществ и родствен- ных примесей, которые могут присутствовать в радиофармацевтическом лекарственном пре- парате.
Остаточные органические растворители. Содержание остаточных органических раство- рителей ограничивают в соответствии с требо- ваниями общей фармакопейной статьи 2.3.2.0. Остаточные органические растворители с использованием методов, приведенных в об- щей фармакопейной статье 2.1.4.19. Идентифи- кация и контроль остаточных растворителей, или других подходящих методов. РАДИОНУКЛИДНАЯ ЧИСТОТА Радионуклидные примеси могут образовы- ваться в процессе получения и распада радио- нуклида. Возможные радионуклидные примеси могут указываться в частных фармакопейных статьях, а их характеристики приводятся в При- ложении 4.2. Физические характеристики ради- онуклидов, указанных в Фармакопее Евразийско- го экономического союза. В большинстве случаев для установления радионуклидной чистоты радиофармацевти- ческого лекарственного препарата необходимо определить подлинность каждого присутству- ющего радионуклида и его радиоактивность. Как правило, наиболее подходящим методом оценки радионуклидной чистоты гамма- и рент- геновских излучателей является гамма-спек- трометрия. Использование натрий-йодидных детекторов может вызывать проблемы: пики примесей гамма-излучателей могут быть скры- ты в спектре основного радионуклида или оста- ваться неразделенными от пиков других радио- нуклидных примесей в радиофармацевтическом лекарственном препарате. Примеси альфа- и бета-излучателей, которые не излучают гамма- и рентгеновские лучи, не могут обнаруживаться данным методом. Для альфа- и бета-излучателей должны применяться другие методы. Требования к радионуклидной чистоте и до- пустимое предельное содержание определенных радионуклидных примесей (например, молиб- ден-99 в технеции-99m) указываются в частных фармакопейных статьях. Хотя данные требования являются необходимыми, сами по себе они недостаточны для обеспечения того уровня радионуклидной чистоты, который соответствует медицинскому применению радиофармацевти- ческого лекарственного препарата. В связи с этим производитель должен проводить после 153 соответствующего периода распада тщательную оценку лекарственных препаратов, особенно включающих радионуклиды с коротким периодом полураспада, на содержание примесей с длительным периодом полураспада. Подобный подход позволяет получить информацию о пригод-ности производственных процессов и методик испытания. При необходимости идентифицировать и (или) дифференцировать 2 или несколько позитрон-излучающих радиону- клидов, например, примеси 18F в 13N-содержащих лекарственных препаратах, дополнительно к гамма-спектрометрии должно быть выполнено определение периода полураспада. Вследствие различий в периодах полурас- пада различных радионуклидов, присутствую- щих в радиофармацевтическом лекарственном препарате, радионуклидная чистота изменяется со временем. РАДИОХИМИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА Радиохимические примеси могут образовы- ваться при следующих процессах: – получении радионуклида; – последующих химических процессах; – неполном препаративном разделении; – химических изменениях в процессе хранения. Установление радиохимической чистоты требует разделения различных химических ве- ществ, содержащих радионуклид, и определе- ния радиоактивности в процентах радионукли- да в заявленной химической форме. В данном разделе частной фармакопейной статьи могут указываться допустимые пределы содержания специфицированных радиохимических приме- сей, в том числе изомеров. В целом, для определения радиохимической чистоты допускается использование любого метода аналитического разделения.
Например, частные фармакопейные статьи на радиофар- мацевтические лекарственные препараты могут включать бумажную хроматографию (2.1.2.25), тонкослойную хроматографию (2.1.2.26), электрофорез (2.1.2.30), эксклюзионную хро- матографию (2.1.2.29), газовую хроматогра- фию (2.1.2.27) и жидкостную хроматографию (2.1.2.28). Соответствующие аналитические ме- тодики описываются в частных фармакопейных статьях. Кроме того, при работе с радиофарма- цевтическими лекарственными препаратами должны быть приняты особые меры предосто- рожности, например, радиационная защита, геометрия измерения, линейность детектора, использование носителей, разведение лекар- ственного препарата. Удельная, молярная и объемная радио- активность. Обычно рассчитывают с учетом радиоактивной концентрации и концентрации испытуемого химического вещества после под- тверждения принадлежности радиоактивности только радионуклиду (радионуклидная чистота) и соответствующим химическим веществам (ра- диохимическая чистота). Удельная, молярная и объемная радиоактив- ность изменяются со временем, в связи с чем их значения приводят на определенную дату, а при необходимости – на определенное время. Физиологическое (биологическое) рас- пределение. По возможности следует избегать проведения испытаний на животных. Если ис- пытания на подлинность и радиохимическую чистоту недостаточны для полного определения и контроля радиохимических примесей в ради- офармацевтическом лекарственном препарате, может потребоваться проведение испытания на физиологическое (биологическое) распределе- ние. Характер распределения радиоактивности, установленный в указанных органах, тканях или других частях тела соответствующего вида животных, может быть достоверным показа- телем пригодности радиофармацевтического лекарственного препарата для предполагаемой цели. Кроме того, испытание на физиологическое (биологическое) распределение может служить для установления биоэквивалентности испыту- емого лекарственного препарата аналогичным лекарственным препаратам с известной клини- ческой эффективностью. Подробное описание выполнения испыта- ния и требования к физиологическому (биоло- гическому) распределению, которым должен соответствовать радиофармацевтический лекар- ственный препарат, приводится в частных фар- макопейных статьях. Испытание, как правило, проводят следую- щим образом. Лекарственный препарат вводят внутривенно каждому из трех животных. В не- которых случаях может потребоваться разведе- ние лекарственного препарата непосредственно перед применением. Сразу после введения ле- карственного препарата каждое животное по- мещают в отдельную клетку, условия содержа- 154 ния в которой позволяют собирать экскременты и предупреждают загрязнение поверхности тела животного. По истечении указанного вре- мени после введения лекарственного препара- та животных умерщвляют соответствующим способом и проводят вскрытие. В выделенных органах и тканях определяют радиоактивность. Затем рассчитывают физиологическое (биоло- гическое) распределение, выражая его значени- ем радиоактивности, обнаруженной в каждом из выделенных органов или тканей, в процен- тах от введенной радиоактивности с учетом поправок на радиоактивный распад. Для неко- торых радиофармацевтических лекарственных препаратов необходимо определение отноше- ния радиоактивности во взвешенных образцах выделенных тканей, т.е. в виде «радиоактив- ность/масса». Радиофармацевтический лекарственный препа- рат выдерживает испытание, если распределение радиоактивности не менее чем у двух из трех жи- вотных соответствует установленным критериям.
Результаты испытаний на животных с при- знаками экстравазальной инъекции (наблюдае- мыми во время введения или обнаруживаемыми при последующем определении радиоактивно- сти тканей) не учитывают. В указанном случае допускается повторное проведение испытания. Стерильность. Радиофармацевтические ле- карственные препараты для парентерального применения должны выдерживать испытание на стерильность. Лекарственные препараты должны произ- водиться в условиях, предотвращающих ми- кробную контаминацию и обеспечивающих их стерильность. Испытание на стерильность вы- полняют в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи 2.1.6.1. Стерильность. Особые сложности возникают в случае радио- фармацевтических лекарственных препаратов в связи с коротким периодом полураспада содер- жащихся в них радионуклидов, малыми разме- рами серий и радиационной опасностью. Если в частной фармакопейной статье указано, что в связи с излучением допускается выпуск ра- диофармацевтического лекарственного препа- рата в обращение до завершения испытания на стерильность, испытание должно быть нача- то, по возможности, быстрее. Если испытание не начато сразу же, образцы хранят в услови- ях, которые считают подходящими для предот- вращения ложноотрицательных результатов. В таких случаях методом выбора является пара- метрический выпуск продукции, произведенной по полностью валидированному технологиче- скому процессу. В асептических условиях про- изводства испытание на стерильность должно выполняться в виде контроля производственно- го процесса. Если размер серии радиофармацевтическо- го лекарственного препарата ограничен одним или несколькими образцами, допускается не применять требования общей фармакопейной статьи 2.1.6.1. Стерильность к отбору серии на испытание стерильности. При периоде полураспада радионуклида ме- нее 5 мин введение радиофармацевтического лекарственного препарата пациенту, как прави- ло, осуществляют непосредственно на месте его получения в условиях валидированной системы изготовления. Из соображений безопасности (высокий уровень радиоактивности) использование ради- офармацевтических лекарственных препаратов в количестве, предусмотренном испытанием на стерильность (2.1.6.1), является невозможным. Для уменьшения облучения персонала предпоч- тительным представляется метод мембранной фильтрации. Для рутинного контроля процесса фильтра- ции при асептическом производстве стерильных радиофармацевтических лекарственных препа- ратов, а также в случаях, когда это обосновано и разрешено уполномоченным органом на осно- вании оценки риска, допускается не проводить испытание на целостность фильтра перед филь- трацией, выполнив это испытание только после фильтрации. Несмотря на требования по использованию антимикробных консервантов в общей фармако- пейной статье 2.5.3.4. Лекарственные препараты для парентерального применения их добавление в радиофармацевтические лекарственные пре- параты, выпускаемые в многодозовой упаковке, не является обязательным при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Бактериальные эндотоксины или Пиро- генность. Радиофармацевтические лекарствен- ные препараты для парентерального применения должны выдерживать испытание на бактериаль- ные эндотоксины (2.1.6.8) или испытание на пи- рогенность (2.1.6.2). В случае радионуклидов с периодом по- лураспада менее 90 мин и в случаях, когда это 155 обосновано и разрешено уполномоченным ор- ганом на основании оценки риска, допускается выпуск радиофармацевтического лекарствен- ного препарата в обращение до завершения испытания.
Элюаты радионуклидных генераторов, рас- творы для радиоактивных меток и радиофарма- цевтические наборы также должны выдержи- вать испытание на бактериальные эндотоксины, если они предназначены для получения радио- фармацевтических лекарственных препаратов для парентерального применения без последую- щих мер по их удалению. Радионуклидные (радиофармацевтические) прекурсоры должны выдерживать испытание на бактериальные эндотоксины, если они предна- значены для использования в производстве лекар- ственных препаратов для парентерального приме- нения без последующих мер по их удалению. Испытание на бактериальные эндотоксины выполняют в соответствии с указаниями общей фармакопейной статьи 2.1.6.8. Бактериальные эндотоксины, принимая необходимые меры предосторожности по радиационной безопас- ности персонала, выполняющего испытание. Допустимое предельное содержание бактери- альных эндотоксинов указывается в частной фармакопейной статье или рассчитывается в соответствии с требованиями общей фармако- пейной статьи 2.1.6.21. Применение испытания на бактериальные эндотоксины. Если природа радиофармацевтического ле- карственного препарата приводит к появлению мешающих факторов в испытании на бактери- альные эндотоксины в виде ингибирования или активации реакции, а устранение данных факто- ров не представляется возможным, может потре- боваться испытание на пирогенность (2.1.6.2). ХРАНЕНИЕ Лекарственные препараты, содержащие ра- диоактивные вещества, хранят в воздухонепро- ницаемом контейнере, обеспечивающем доста- точную защиту персонала от первичного или вторичного излучений в соответствии с требо- ваниями законодательства государств ‒ членов Союза по хранению радиоактивных веществ. В процессе хранения контейнеры могут тем- неть вследствие облучения, что необязательно означает ухудшение качества лекарственных пре- паратов. МАРКИРОВКА Маркировка произведенных радиофармацевти- ческих лекарственных препаратов должна отвечать требованиям права Союза, а радиофармацевтиче- ских лекарственных препаратов, изготовленных в медицинских организациях, – требованиям законодательства государств ‒ членов Союза. Помимо вышеуказанного, на этикетке контей- нера, вторичной упаковке, в общей характеристи- ке лекарственного препарата (листок-вкладыш) или сертификате анализа серии (партии) ради- офармацевтического лекарственного препарата дополнительно указывают, если применимо: − максимальную рекомендуемую дозу (объ- ем) в миллилитрах; − особые условия хранения. 203200003-2023 2.3.20.3. ИЗГОТОВЛЕНИЕ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В МЕДИЦИНСКИХ ОРГАНИЗАЦИЯХ 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Многие радиофармацевтические лекар- ственные препараты изготавливают на посто- янной основе на месте их применения, обычно в дозах для небольшого числа пациентов в со- ответствии с индивидуальными клиническими потребностями. Фармацевтическую деятель- ность по получению радиофармацевтических лекарственных препаратов, осуществляемую в медицинских организациях для собственных нужд, называют изготовлением радиофармацев- тических лекарственных препаратов. В общей фармакопейной статье рассматри- ваются радиофармацевтические лекарственные препараты, изготовленные в медицинских орга- низациях. В отличие от радиофармацевтических лекарственных препаратов, производство кото- рых осуществляется в соответствии с правом Союза, изготовление радиофармацевтических лекарственных препаратов в медицинских орга- низациях должно отвечать требованиям законо- дательства государств – членов Союза.
К ради- офармацевтическим лекарственным препаратам 156 применяются положения и требования общей фармакопейной статьи 2.5.3.1. Лекарственные препараты. Радиофармацевтические лекарственные пре- параты изготавливают либо по утвержденным технологическим рецептурам (инструкциям) для отдельных пациентов, либо в соответствии с требованиями частной фармакопейной статьи и применяют для пациентов непосредственно в этой медицинской организации. Такие ради- офармацевтические лекарственные препараты применяются в течение установленного сро- ка годности и включают в себя лекарственные препараты, как изготовленные на основе ради- офармацевтических наборов, так и лекарствен- ные препараты, содержащие радионуклиды для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонной эмиссионной компьютерной то- мографии (ОФЭКТ) или терапевтических целей. Изготовление радиофармацевтических лекарственных препаратов рассматривается как процесс, включающий отдельные стадии или все стадии из следующих: – приобретение материалов и продуктов; – получение радионуклидов для мечения; – введение радиоактивной метки (радиоме- чение); – химическую модификацию и (или) очистку; – получение лекарственной формы; – дозирование лекарственного препарата (наполнение флаконов); – стерилизацию; – аналитический контроль; – упаковку; – маркировку; – отпуск. Отбор дозы (например, из многодозового флакона) и немедленное применение радиофар- мацевтического лекарственного препарата паци- ентом считают частью клинической практики, но не частью процесса изготовления радиофар- мацевтического лекарственного препарата. Для обеспечения требуемого качества ради- офармацевтических лекарственных препаратов их изготовление должно осуществляться в рам- ках соответствующей системы качества. Уро- вень системы качества определяется рисками для пациента, такими как микробная контами- нация, неоптимальное протекание химических реакций и его последствия, неисправность обо- рудования, используемого в процессе изготов- ления, и несоответствующие условия хранения исходных материалов и готовой продукции. Определение уровня риска и требуемого уровня обеспечения качества, необходимых для дости- жения надлежащего качества продукции и обе- спечения радиационной безопасности, должно проводиться на основе оценки рисков. Выбор систем качества для изготовления радиофар- мацевтических лекарственных препаратов осу- ществляют на основе установленных правил и рекомендаций. Особое внимание при этом следует уделять следующим вопросам: – наличие квалифицированного персонала, имеющего необходимую подготовку; – наличие соответствующих помещений; – квалификация подходящего оборудования для изготовления и анализа; – валидация всех критических стадий изго- товления и методик проведения испытаний; – мониторинг окружающей среды; – наличие и ведение соответствующей доку- ментации; – закупка материалов и услуг, используемых при изготовлении; – наличие аналитических методик и кон- троль качества. Все стадии изготовления радиофармацевти- ческих лекарственных препаратов разрабаты- вают в соответствии с требованиями радиаци- онной безопасности участвующего персонала и окружающей среды, установленными законо- дательством государств – членов Союза. 2.
ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ В общей фармакопейной статье используют- ся следующие понятия: автоматизированный модуль для син- теза и (или) дозирования – электромеханическое устройство, управляемое программным обеспе- чением, для автоматического выполнения после- довательности операций, необходимых для ра- диомечения, очистки, получения лекарственной формы, дозирования и (или) стерилизации ради- офармацевтического лекарственного препарата; дозирование (наполнение) в закрытые фла- коны – процесс, при котором раствор, предназна- ченный для наполнения после стерилизующей фильтрации, не находится в непосредственном контакте с окружающей средой, а асептические 157 операции по соединению компонентов системы во время дозирования после стерилизующего фильтра не производятся; закрытый метод радиосинтеза – метод, при котором раствор содержится в системе синтеза и не подвергается непосредственному воздействию окружающей среды в процессе ра- диосинтеза (например, с использованием радио- фармацевтической кассеты); исходный материал – материал, используе- мый для изготовления радиофармацевтического лекарственного препарата. В качестве исходных материалов могут рассматриваться радионуклид- ные генераторы для радиофармацевтических лекарственных препаратов, радионуклидные и химические прекурсоры, вспомогательные веще- ства для синтеза, ионообменные смолы, компо- ненты упаковки и расходные материалы; набор исходных материалов – набор реактивов, растворителей и прекурсоров в виде, пригодном для изготовления радиофармацевти- ческих лекарственных препаратов. Как прави- ло, пригодными для изготовления исходными материалами являются образец твердого веще- ства точно установленного (путем взвешивания) количества или образец раствора определенно- го объема. Твердые и жидкие исходные матери- алы, как правило, расфасовывают во флаконы и укупоривают для хранения до использования. Наборы исходных материалов могут быть при- обретены в готовом виде или получены на ме- сте с использованием упаковочных материалов и химических веществ, приобретенных или син- тезированных на месте; открытый метод радиосинтеза или дози- рования (наполнения) в открытые флаконы – метод, при котором в определенной точке про- цесса раствор подвергается непосредственному воздействию окружающей среды (при дозирова- нии контакт с окружающей средой через стери- лизующий воздушный фильтр не считают непо- средственным воздействием); радиофармацевтическая кассета (кассе- та) – устройство одноразового использования, состоящее из предварительно собранной цепи контейнеров, клапанов и шприцев, в том чис- ле набора исходных материалов или без него, и предназначенное для установки на модуле синтеза в процессе изготовления радиофарма- цевтического лекарственного препарата. 3. ПОМЕЩЕНИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ Помещения и оборудование проектируются, строятся, обслуживаются, очищаются и дезин- фицируются таким образом, чтобы обеспечить надлежащее качество радиофармацевтического лекарственного препарата, низкий уровень со- держания частиц и микробной контаминации, а также защитить персонал и окружающую сре- ду от воздействия радиации. Обычно радиофармацевтические лекарствен- ные препараты изготавливают в широком раз- нообразии, часто в одно и то же время и в од- ном месте. Помещения, оборудование и рабо- чий процесс должны выстраиваться так, чтобы свести к минимуму риск перекрестной кон- таминации и перепутывания. Оборудование и вспомогательные средства проектируют и кон- тролируют с учетом особого риска для всех из- готавливаемых лекарственных препаратов и воз- можности их микробной контаминации.
При работе с биологическими материалами должны соблюдаться дополнительные требования. Подробное описание параметров и после- довательности процесса, условий окружаю- щей среды и микробиологических аспектов изготовления позволяет избежать возможного химического, радиохимического, радионуклид- ного и микробного загрязнения. В частном слу- чае радиомечения клеток крови перемещение операторов внутри лаборатории между зоной для радиомечения и зоной для изготовления других радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов предотвращают соответствую- щей конструкцией и планировкой помещений. Любой опасный биологический материал должен храниться и подвергаться обработке отдельно от других субстанций для фармацевти- ческого применения, лекарственных препаратов или исходных материалов. Измерение радиоактивности проводят, как описано в общей фармакопейной статье 2.1.2.43. Обнаружение и измерение радиоактивности. Измерительное оборудование должным обра- зом экранируют, особенно при работе с высо- кими уровнями радиоактивности в смежных зонах. Для обеспечения надлежащей работы оборудования должна быть внедрена система, предусматривающая его ежедневную провер- ку и периодическую поверку или калибровку. 158 Все отклонения, такие как изменения диапазона линейности, калибровка по энергии и эффектив- ности и непредвиденные изменения фоновых показаний, должны подлежать исследованию. 4. ПРОЦЕСС ИЗГОТОВЛЕНИЯ В случае зарегистрированного радиофар- мацевтического лекарственного препарата, ис- пользуемого в качестве компонента в процессе изготовления, ответственность за его соответ- ствие требованиям, заявленным в регистраци- онном досье, несет владелец регистрационного удостоверения. Специалисты, занятые изготов- лением радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов в соответствии с инструкциями по медицинскому применению, несут ответ- ственность за качество изготовления и обраще- ние этих радиофармацевтических лекарственных препаратов на своем участке. Подтверждение соответствия качества готового к применению радиофармацевтического лекарственного препа- рата предполагаемому назначению осуществля- ет ответственное лицо, назначенное руководите- лем медицинской организации. Если один или несколько компонентов, ис- пользуемых для изготовления, не зарегистри- рованы, должна проводиться оценка риска (включая обоснование и фармацевтическую эквивалентность, если применимо) и ее доку- ментальное оформление. Как правило, соответствие исходных мате- риалов требованиям биологических испытаний (бионагрузка) является важным фактором в до- стижении низкого содержания бактериальных эндотоксинов и обеспечении стерильности ра- диофармацевтических лекарственных препа- ратов при последующих операциях изготовле- ния. Вскрытые или частично использованные упаковки исходных материалов, предназначен- ные для последующего применения, следует должным образом маркировать и хранить в ус- ловиях ограниченного доступа. Для открытых, неоткрытых и растворенных исходных матери- алов должны быть определены сроки годности, особенно с точки зрения микробиологического фона в конкретных условиях работы. Рекомен- дуется использование одноразовой упаковки. Для наборов исходных материалов срок годно- сти устанавливают, исходя из возможности де- градации ингредиентов, микробной контамина- ции и стабильности упаковочных материалов с учетом проницаемости полимерной и эласто- мерной упаковок. Срок годности указывают и обосновывают исследованиями стабильности, отражающими способ применения.
Мониторинг окружающей производственной среды и персонала во время изготовления ра- диофармацевтического лекарственного препа- рата имеет важное значение для обеспечения качества лекарственного препарата независимо от происхождения исходного материала, исполь- зованного при изготовлении. Частота монито- ринга определяется на основании установленных правил и рекомендаций. Отклонения от рекомен- дованной частоты осуществляются на основе оценки риска и должны быть обоснованы. При необходимости получения стерильного лекар- ственного препарата и невозможности финиш- ной стерилизующей фильтрации должны исполь- зоваться стерильные исходные материалы. Ком- поненты оборудования, непосредственно кон- тактирующие с лекарственным препаратом в процессе изготовления, должны быть стериль- ными, одноразового использования или могут повторно использоваться только после выполне- ния валидированной процедуры очистки и сте- рилизации. 4.1. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ Методика получения радионуклида должна описывать следующие основные параметры: – материал мишени; – ядерная реакция; – конструкция держателя для материала мишени; – техническое обслуживание держателя для материала мишени и линий передачи; – данные об облучении, например, энергия и интенсивность пучка излучения; – типичные радионуклидные загрязнители для принятых условий (функция возбуждения); – процесс разделения и очистки целевого радионуклида. Методика должна оценивать все воздействия на эффективность получения с точки зрения ка- чества и количества целевого радионуклида. Радионуклидные прекурсоры и молекулы с радиоактивной меткой должны отвечать тре- бованиям общей фармакопейной статьи 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекарственные препа- раты и соответствующих частных фармакопей- ных статей (при наличии). 159 4.2. ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕКУРСОРЫ Химические прекурсоры обычно получают химическим синтезом. Они могут химически связываться с радионуклидом или смешиваться с другими веществами в виде наборов, предва- рительно изготовленных для процедур радиоме- чения, и (или) использоваться в качестве исход- ных материалов в кассетах или наборах. Химические прекурсоры как в изолиро- ванном виде, так и в виде наборов исходных материалов, должны иметь допустимо низкий уровень микробной контаминации независимо от того, подвергается ли продукт финишной стерилизации или стерилизующей фильтрации. Стерилизацию следует рассматривать с точки зрения существования риска того, что химиче- ские прекурсоры могут способствовать росту микроорганизмов. Требования к качеству химических прекур- соров приводятся в общей фармакопейной ста- тье 2.3.20.1. Химические прекурсоры для радио- фармацевтических лекарственных препаратов и соответствующих частных фармакопейных статьях. При отсутствии частных фармакопей- ных статей применяются требования и поло- жения общей фармакопейной статьи 2.3.18.0. Субстанции для фармацевтического примене- ния, а также осуществляется программа испыта- ний для проверки качества химических прекур- соров. Однако некоторые положения указанной общей фармакопейной статьи не применимы для радиофармацевтических лекарственных препаратов и химических прекурсоров. Такие положения приводятся в общей фармакопейной статье 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекар- ственные препараты. 4.3. РАДИОМЕЧЕНИЕ Стадия радиомечения представляет собой реакцию радионуклида с химическим прекур- сором. Субстратами для прямого радиомечения также могут быть биологические материалы, та- кие как белки или клетки. Радиомечение включает смешивание исход- ных материалов в контролируемых условиях (например, температура или давление).
После радиомечения могут осуществляться последу- ющие стадии, предназначенные для удаления защитных групп или связывания меченого со- единения с другой молекулой, которая может представлять собой органический фрагмент или более сложную структуру, такую как белок или антитело. Риски для эффективности радиомечения, качества, безопасности и эффективности ради- офармацевтического лекарственного препарата, связанные с химическим и физическим соста- вом набора, компонентами или исходными мате- риалами, должны оцениваться и документально оформляться. Тщательному изучению подлежат химическая и физическая стабильность и риски микробной контаминации. При разработке метода синтеза учитывают источники получения и качество исходных мате- риалов (например, загрязнение металлами), их количественный и качественный состав (напри- мер, концентрация, рН, стерильность, осмоляр- ность, вязкость, растворимость, стабильность) и условия проведения синтеза (например, ис- пользование инертного газа, температура, дав- ление). Особое внимание также уделяют воз- можным побочным продуктам синтеза. Для повышения надежности процессов синтеза, снижения риска микробной контаминации и по- вышения радиационной безопасности предпоч- тительны автоматизация и (или) использование кассет. Перед внедрением в клиническую практику радиофармацевтического лекарственного пре- парата, полученного в соответствии с новым методом синтеза, процесс синтеза валидируют, используя подходящие виды контроля в про- цессе изготовления (промежуточный контроль) и выполняя полный контроль качества не менее трех серий готового к применению радиофарма- цевтического лекарственного препарата. После выполнения валидации процесса возможен ру- тинный контроль качества, который должен про- водиться до введения радиофармацевтического лекарственного препарата пациенту и должен быть основан на оценке риска с учетом химиче- ской сложности синтеза, факторов, влияющих на эффективность радиофармацевтического ле- карственного препарата, дозы облучения для па- циента, например, посредством контроля радио- химических и радионуклидных примесей. 4.3.1. Радиофармацевтические лекарственные препараты, не требующие очистки Данный тип синтеза характеризуется ком- бинированием радионуклида со смесью исход- ных материалов. Такое однократное добавление 160 исходных материалов сопровождается почти количественной реакцией радионуклида с хи- мическим прекурсором, так что процесс изго- товления не требует стадии очистки. Ввиду повышенного риска микробной контаминации следует избегать открытых методов радиосин- теза. Все компоненты радиофармацевтическо- го лекарственного препарата вводят совместно с полученным радиофармацевтическим актив- ным ингредиентом. Необходимая оценка риска должна быть сосредоточена на химическом, ра- диохимическом и микробиологическом качестве всех исходных материалов, включая радиону- клид. При многократном добавлении исходных материалов оценка риска также должна фокуси- роваться на условиях введения и реакции с уча- стием различных исходных материалов, особен- но реакционного контейнера (реактора). 4.3.2. Радиофармацевтические лекарственные препараты, требующие очистки Данный тип синтеза характеризуется одно- кратным добавлением раствора радионуклида к смеси исходных материалов или многократ- ным добавлением различных исходных мате- риалов, что требует последующей очистки (см. также раздел 4.5 данной общей фармакопейной статьи).
Эффективная очистка целевого радио- активного соединения от реакционной смеси не- обходима для обеспечения низкого содержания радионуклидных, химических и (или) радиохи- мических примесей. Физико-химическое и хими- ческое выделение промежуточных продуктов или готового продукта имеет существенное значение для получения радиофармацевтического лекар- ственного препарата, соответствующего требо- ваниям спецификации. По возможности процесс изготовления, включая критические стадии разделения, контролируют с помощью подхо- дящих детекторов, при этом контроль проводят в отношении радиационной безопасности. Не- обходимая оценка риска должна быть сосредо- точена на аспектах, указанных в разделе 4.3.1 данной общей фармакопейной статьи, а также на условиях очистки, особенно эффективности разделения и влиянии хроматографической сре- ды на последующее микробиологическое каче- ство (содержание бактериальных эндотоксинов продукта. 4.3.3. Радиомечение клеток К особым аспектам оценки риска при ра- диомечении клеток относятся перекрестная контаминация, перекрестное инфицирование, перепутывание образцов крови и ее компонен- тов, а также сохранение целостности и (или) жизнеспособности клеток после радиомечения. Указанный тип радиомечения более подробно рассматривается в разделе 4.14 данной общей фармакопейной статьи. 4.4. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ Некоторые из описанных выше стадий могут быть автоматизированы. Автоматизированный модуль (синтезатор) обычно состоит из комби- нации источников питания, приводных механиз- мов, насосов, нагревателей и датчиков, которые используются в сочетании с взаимосвязанной сетью контейнеров, реакторов, трубок, шпри- цев, твердофазных картриджей и (или) препа- ративных систем жидкостной хроматографии. Автоматизированный модуль может быть гото- вой единицей оборудования, доступной в про- даже, или изготавливаться на заказ. Обычно для разных радиофармацевтических лекарственных препаратов применяют один и тот же автомати- зированный модуль. В процессе синтеза автоматизированный мо- дуль контролирует параметры процесса вплоть до получения раствора радиофармацевтиче- ского лекарственного препарата. Контейнеры и система очистки, используемые с автоматизи- рованным модулем, могут быть одноразовыми (радиофармацевтическая кассета) или исполь- зоваться в многочисленных циклах получения лекарственного препарата. При использовании последовательных ци- клов получения учитывают риск перекрестной контаминации. Для ее предотвращения при- нимают соответствующие меры с использова- нием предназначенных для этого компонентов или оборудования или путем оценки эффектив- ности процедуры очистки. Контейнеры и системы очистки (например, колонка системы препаративной жидкостной хроматографии) считают частью синтезатора. Электронные компоненты синтезатора долж- ны быть устойчивы к высоким уровням излучения. Компоненты автоматизированного модуля, непосредственно соприкасающиеся с исходны- ми материалами, растворителями и (или) радио- фармацевтическим лекарственным препаратом, должны быть химически инертными. Особое внимание следует уделять компонентам, нахо- дящимся в контакте с исходными материалами 161 и (или) радиофармацевтическим лекарственным препаратом, которые способны под воздействи- ем излучения подвергаться деградации и со вре- менем выделять примеси.
Автоматизированные модули могут так- же контролировать получение лекарственной формы и дозирование радиофармацевтиче- ского лекарственного препарата, как правило, с использованием устройств для измерения объ- ема или массы и детекторов радиоактивности для отмеривания точных количеств лекарствен- ного препарата. Для дозирования используют одноразовые системы трубок. Измерительная система должна быть откалибрована. Для автоматизированного модуля синтеза и (или) дозирования требуется два уровня квали- фикации (валидации). Сам автоматизированный модуль проходит квалификацию у поставщика и (или) пользователя. После такой квалифика- ции осуществляется валидация процесса изго- товления и дозирования. Процесс синтеза на синтезаторе обычно управляется программным обеспечением и ва- лидируется. Пользователь автоматизированной системы должен иметь перечень последователь- ных стадий синтеза и историю внесенных в них изменений. Программное обеспечение должно находиться под контролем доступа, и любые изменения в нем должны контролироваться и документально оформляться. Случаи «ручного» вмешательства или коррек- тировки параметров (например, «ручное» управ- ление клапанами) документально оформляют и исследуют как отклонение процесса, если оно выходит за пределы допустимых диапазонов. Версию программного обеспечения, используе- мую для получения серии радиофармацевтиче- ского лекарственного препарата, указывают как параметр серии. При внесении изменений в про- граммное обеспечение его прежнюю версию ар- хивируют на тот же период, что и документацию для серий, полученных с данной версией. Автоматизированные системы могут вклю- чать в себя применение радиофармацевтиче- ских кассет и других одноразовых устройств. Кассеты используются с набором исходных ма- териалов (таких как прекурсоры, растворители, катализаторы и др.), которые могут содержаться в кассете (предварительно заполненная кассета) или предоставляться отдельно (пустая кассета). Кассеты могут производиться в готовом виде или собираться собственными силами. В обоих случаях должны соблюдаться требования сопро- водительной документации, предназначенной для пользователей. Все материалы в системе, контактирующие с реактивами или радиофармацевтическим ле- карственным препаратом, должны обладать со- ответствующей стабильностью при хранении и использовании. Совместимость материалов (например, полимерных материалов) с химиче- ским процессом должна быть оценена, а резуль- таты оценки – документально оформлены. Стек- ло, используемое для изготовления компонентов системы, должно быть по крайней мере типа I (см. общую фармакопейную статью 2.4.2.2. Упаковка для фармацевтического применения из стекла). Перед применением радиофармацевти- ческого лекарственного препарата, получен- ного с помощью кассет, процесс валидируют для подтверждения того, что комбинация кас- сеты и автоматизированной системы позволяет постоянно получать радиофармацевтический лекарственный препарат требуемого качества. Качество используемых химических реак- тивов должно соответствовать требованиям, указанным в разделе 4.2 данной общей фарма- копейной статьи. Кассета должна быть способна синтезиро- вать радиофармацевтический лекарственный препарат в соответствии с утвержденной спец- ификацией в течение всего срока годности кас- сеты. Для поддержания низкого содержания бакте- риальных эндотоксинов и достижения стериль- ности радиофармацевтического лекарственного препарата, полученного с использованием кас- сеты, кассета должна иметь низкую исходную бионагрузку.
Пригодность процесса для получения ра- диофармацевтического лекарственного препа- рата должна быть обеспечена, а его качество подтверждено соответствующими аналитиче- скими испытаниями. Пользователь автоматизированной системы должен иметь необходимую информацию о хи- мических реактивах и реакционных процессах, применяемых в системе, чтобы оценить воз- можные отклонения, которые могут возникнуть в процессе получения радиофармацевтических лекарственных препаратов. Неоптимальное про- текание реакции или сбои в системе могут при- вести к снижению выхода готовой продукции 162 и (или) появлению дополнительных примесей. Предоставляемая информация о возможных сбоях в системе должна быть достаточна для установления соответствующих показателей качества получаемого радиофармацевтического лекарственного препарата. 4.5. ОЧИСТКА Часто, особенно при проведении органиче- ских химических реакций, требуется выделение продукта реакции. Поскольку стадия очистки обеспечивает качество радиофармацевтического лекарственного препарата, эффективность раз- деления должна быть оценена с точки зрения ра- диохимической, радионуклидной и химической чистоты. Особое внимание уделяют остаточным органическим растворителям (2.3.2.0). Все про- цедуры очистки должны быть валидированы. При использовании хроматографических сред существует риск микробной контаминации, особенно в случае многоразового использования колонок для жидкостной хроматографии. Оцен- ка риска должна быть сосредоточена на проце- дурах очистки и условиях хранения хроматогра- фических сред. Их бионагрузку и содержание бактериальных эндотоксинов поддерживают ниже допустимых пределов, чтобы обеспечить стерилизацию лекарственных препаратов для парентеральных применения. Процесс радиомечения биологических мате- риалов, например, клеток крови, разрабатывают таким образом, чтобы стадия очистки, обычно центрифугирование, обеспечивала воспроизво- димое качество продукта. 4.6. ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ После очистки получают лекарственную форму радиомеченного соединения, подходя- щую для введения пациентам. Источники получения и качество вспомога- тельных веществ и добавок должны быть доку- ментально описаны. При использовании набора исходных мате- риалов собственного изготовления рекомендует- ся использовать компоненты без микробной кон- таминации (или с допустимо низким уровнем) независимо от того, будет ли радиофармацев- тический лекарственный препарат подвергнут финишной стерилизации или стерилизующей фильтрации. В случае получения различных типов ради- офармацевтических лекарственных препаратов из наборов для предотвращения перекрест- ной контаминации одновременно используют отдельные флаконы с разбавителем. Большинство радиофармацевтических ле- карственных препаратов предназначено для парентерального введения. В связи с этим при разработке радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов и наборов исходных материалов собственного изготовления особое внимание уделяют определению рН, осмолярности, вязко- сти, ионной силы и растворимости. 4.7. ДОЗИРОВАНИЕ (НАПОЛНЕНИЕ) Дозирование представляет собой процесс розлива раствора радиофармацевтического ле- карственного препарата с получением его до- зированной формы, предназначенной для отпу- ска перед применением (см. раздел 4.12 данной общей фармакопейной статьи). Процесс сводит- ся к изготовлению серии, состоящей из одного или нескольких флаконов или шприцев с гото- вым к применению радиофармацевтическим лекарственным препаратом. Для сведения био- нагрузки до минимального уровня компоненты, необходимые в процессе дозирования, исполь- зуют стерильными.
Если это невозможно, ком- поненты стерилизуют по валидированной про- цедуре. Если компоненты используют повторно, отсутствие перекрестной контаминации при переходе от одного продукта к другому обеспе- чивают с помощью валидированной процедуры очистки. 4.8. СТЕРИЛИЗАЦИЯ Радиофармацевтические лекарственные пре- параты для парентерального применения должны быть стерильными. Наиболее высо- кий уровень обеспечения стерильности лекар- ственного препарата достигается с помощью фи- нишной стерилизации. В большинстве случаев могут выполняться только стадии стерилизую- щей фильтрации, но в некоторых других случаях стерилизация представляется невозможной (на- пример, при радиомечении аутологичных клеток). Такие радиофармацевтические лекарствен- ные препараты следует рассматривать как асептически изготавливаемые лекарственные препараты. Применяемые методы стерилиза- ции описаны в общей фармакопейной статье 163 2.3.1.5. Методы обеспечения стерильности продуктов. Асептические операции осуществля- ют в помещении (зоне) класса А. Класс окружающей производственной среды бу- дет зависеть от используемой системы герметизации, риска контаминации ра- диофармацевтического лекарственного пре- парата, его срока годности и количества еди- ниц продукции, полученного в течение одного цикла изготовления. В отношении чистоты воздуха обычно приемлемыми являются поме- щения класса С для открытых производствен- ных (рабочих) зон или помещения класса D для изоляторов. Сложность операций и срок годности ради- офармацевтического лекарственного препарата определяют меры, которые необходимо пред- принять для обеспечения стерильности продук- ции, например: – для простых операций в закрытой системе, требующей небольшого вмешательства (напри- мер, изготовление радиофармацевтических ле- карственных препаратов из наборов и генерато- ров), соответствующий контроль окружающей производственной среды, непосредственно при- легающей к производственной (рабочей) зоне может обеспечить соответствующий уровень чистоты воздуха, когда применяются дополни- тельные меры (например, контроль целостности костюма (перчаток) оператора); в этом отноше- нии решающее значение имеет оценка риска; – для сложных операций в открытой систе- ме (например, изготовление в открытом флаконе или наполнение флакона после стерилизующей фильтрации, асептическое изготовление, ради- омечение аутологичных клеток) могут потре- боваться дополнительные меры в окружающей производственной среде, непосредственно при- легающей к производственной (рабочей) зоне для обеспечения стерильности радиофармацев- тического лекарственного препарата. Процедуры закрытого наполнения приме- няются по возможности в качестве альтернати- вы заполнению открытого флакона, особенно для очень малых серий или в случае радио- фармацевтических лекарственных препаратов для отдельных пациентов. Дозирующий набор (стерилизующий фильтр, иглы, пробирки и фла- коны), применяемый в закрытых асептических операциях наполнения, должен быть стериль- ным, что может быть достигнуто стерилизацией дозирующего набора или использованием сте- рильных компонентов. Такие стерильные ком- поненты собирают и соединяют в зоне с подава- емым воздухом класса А, расположенной в зоне с чистотой воздуха, соответствующей классу С. Процесс закрытого асептического наполнения может выполняться в зоне, чистота воздуха ко- торой соответствует как минимум классу С. Мониторинг количества частиц и микроб- ной контаминации воздуха в критических зонах класса А и окружающей среды должен про- водиться на регулярной основе.
При исполь- зовании стерилизующей фильтрации перед введением радиофармацевтического лекарствен- ного препарата пациенту фильтр проверяют на целостность. Испытание целостности филь- тра для каждого типа лекарственного препарата, например, методом «точки пузырька», должно быть валидировано. Для радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов, содержащих радионуклид с периодом полураспада менее 10 мин, испытание на целостность фильтра перед отпуском лекар- ственного препарата не проводится. Если введение пациенту радиофармацевти- ческого лекарственного препарата выполняется непосредственно от оборудования, использу- емый фильтр должен быть пригоден для непо- средственного применения у человека. Совместимость мембраны и корпуса филь- тра с раствором радиофармацевтического ле- карственного препарата проверяют экспери- ментально с использованием спецификаций поставщика фильтра. В некоторых случаях невозможно найти сертифицированные филь- тры, приемлемые для определенных радио- фармацевтических лекарственных препаратов (например, для гидрофобных радиофармацев- тических лекарственных препаратов). В этих случаях необходимо проводить испытания фильтров на содержание бактериальных эндо- токсинов, эффективность и выход продукта. 4.9. АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ Все аналитические системы должны быть квалифицированы, а методики валидированы. По возможности контроль качества не должен проводиться лицами, осуществляющими изго- товление радиофармацевтического лекарствен- ного препарата. 164 4.9.1. Исходные материалы Исходные материалы, используемые для из- готовления, должны соответствовать требовани- ям и положениям общей фармакопейной статьи 2.3.18.0. Субстанции для фармацевтического применения и частным фармакопейным статьям (при наличии). Для исходных материалов, не входящих в состав радиофармацевтических лекарствен- ных препаратов (например, реактивы, уда- ленные очисткой, катализаторы, растворите- ли, картриджи), соответствие спецификациям проверяют путем оценки сертификата анали- за, предоставленного их производителем, и до- полняют, при необходимости, специфически- ми испытаниями. Если испытание невозможно с технической точки зрения, например, при ис- пользовании доступных в продаже предваритель- но заполненных кассет, допускается не проводить испытание, если осуществляется оценка риска. Спецификации исходных материалов должны быть адаптированы к уровню химической и ми- кробиологической чистоты, который необходим для обеспечения качества целевого продукта радиосинтеза. Подлинность вспомогательных веществ, входящих в состав радиофармацевти- ческого лекарственного препарата, проверяют подходящим аналитическим методом. Спец- ификации вспомогательных веществ должны быть адаптированы к уровню чистоты, который требуется для обеспечения качества компонента лекарственного препарата для парентерального применения, особенно в отношении бионагрузки и содержания бактериальных эндотоксинов. В случае некоторых радионуклидов систе- матическая аналитическая оценка их качества невозможна перед использованием в процессе радиосинтеза. Их пригодность для предполага- емой цели должна устанавливаться каждый раз при использовании новой серии материала ми- шени или модификации процесса изготовления радионуклидов.
Для химических прекурсоров должны выполняться следующие требования: – подлинность подтверждают подходящим аналитическим методом; – пригодность для радиосинтеза проверяют путем проведения полного радиосинтеза с подтверждением соответствия готового к при- менению радиофармацевтического лекарствен- ного препарата требованиям всех его специфи- каций (испытательный синтез); – соответствие спецификациям проверяют путем оценки сертификата анализа, предостав- ленного производителем, и дополняют, при необходимости, специфическими испытаниями. 4.9.2. Радиофармацевтические лекарственные препараты Изготовленные радиофармацевтические ле- карственные препараты должны соответствовать требованиям и положениям общей фармакопей- ной статьи 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекарственные препараты и частных фарма- копейных статей (при наличии). Кроме того, к ним также должны применяться другие общие фармакопейные статьи, особенно 2.5.3.1. Лекар- ственные препараты, 2.3.1.5. Методы обеспе- чения стерильности продуктов, 2.3.2.0. Оста- точные органические растворители. При отсутствии частной фармакопейной статьи или утвержденной общей характери- стики лекарственного препарата должны быть разработаны спецификации и соответствую- щие методы испытаний для каждого радио- фармацевтического лекарственного препарата. В таблице 2.3.20.3.-1 представлены примеры испытаний (или показателей качества) и соот- ветствующих методов их проведения. Подроб- ные сведения об измерении радиоактивности при проведении испытаний приводятся в общей фармакопейной статье 2.1.2.43. Обнаружение и измерение радиоактивности. Для каждого пла- нируемого испытания указывают, должен ли быть получен результат перед отпуском радиофарма- цевтического лекарственного препарата. Если испытание отложено на момент после отпуска, это должно быть обосновано, а максимальный период отсрочки испытания четко установлен. 4.10. УПАКОВКА Материал первичной упаковки должен быть совместим с радиофармацевтическим лекар- ственным препаратом. 4.11. МАРКИРОВКА Если радиофармацевтический лекарствен- ный препарат изготавливают и применяют на одном и том же участке, маркировка пер- вичной упаковки должна указывать на нали- чие радиофармацевтического лекарственного препарата и обеспечивать его прослеживаемость. Маркировку таких лекарственных препаратов осуществляют в соответствии с требованиями за- конодательства государств – членов Союза. 165 На этикетке радиофармацевтического лекар- ственного препарата обычно указывают: – наименование лекарственного препара- та (активной фармацевтической субстанции) и (или) его (ее) характеристики; – точные данные по изготовлению (номер серии или дата изготовления); – порядковый номер дозированной единицы лекарственного препарата при изготовлении не- скольких дозированных единиц, если применимо; – международный символ радиоактивности. Если применимо, маркировка защитного контейнера должна содержать данные пациен- та (идентификационный номер или фамилию и инициалы). Для радиофармацевтических лекарственных препаратов в жидких и газообразных лекар- ственных формах маркировка защитного контей- нера должна включать общую радиоактивность в расчете на контейнер или радиоактивную кон- центрацию на миллилитр, указанные на дату и время измерения, а также объем жидкого ле- карственного препарата в контейнере. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов в твердых лекарственных формах (например, капсулы) указывают общую радио- активность на дату и, при необходимости, время измерения.
В определенных случаях допускается из- менение маркировки, если ввиду чрезвычайно короткого периода полураспада (менее 10 мин) радиофармацевтический лекарственный препа- рат применяется до получения всей информации по оценке его качества. Таблица 2.3.20.3.-1. – Примеры испытаний и методов их проведения для отпуска изготовленных радиофармацевтических лекарственных препаратов Испытание (показатель качества) Метод проведения испытания свойства описание визуальная оценка подлинность радионуклида определение периода полураспада, альфа-спектрометрия, бета-спектрометрия, гамма-спектрометрия радиохимическая подлинность жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография радиохимическая чистота жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография химическая чистота жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография радионуклидная чистота определение периода полураспада, гамма-спектрометрия, альфа-спектрометрия, бета-спектрометрия остаточные органические растворители газовая хроматография фармацевтические или физиологические показатели (рH, осмоляльность и др.) потенциометрия, осмометрия и др. стерильность бактериальные эндотоксины микробиологические методы радиоактивность или радиоактивная концентрация ионизационная камера удельная радиоактивность жидкостная хроматография, ионизационная камера энантиомерная чистота хиральная хроматография 166 Кроме того, на этикетке защитного контей- нера или наружной упаковке указывают: – наименование всех вспомогательных ве- ществ, входящих в состав радиофармацевтическо- го лекарственного препарата, если применимо; – путь введения; – дату истечения срока годности; – особые условия хранения, если применимо. 4.12. ОТПУСК Решение об отпуске готового к применению радиофармацевтического лекарственного препа- рата зависит от соответствия результатов анали- тических испытаний требованиям специфика- ций и от технологических данных, относящихся к изготовлению, особенно контролю в процессе изготовления и мониторингу (например, части- цы, микроорганизмы, параметры окружающей среды). Однако, учитывая короткоживущую природу радиофармацевтического лекарствен- ного препарата, результаты не всех испытаний могут быть получены на время его отпуска к применению. Перечень аналитических испы- таний, которые должны быть выполнены до от- пуска радиофармацевтического лекарственного препарата, составляют в соответствии с разде- лом 4.9.2 данной общей фармакопейной статьи. Отпуск радиофармацевтического лекарственно- го препарата осуществляют в соответствии с до- кументированной процедурой с указанием всех необходимых данных (изготовление, контроль качества, оценка отклонений и др.). Такая про- цедура основана на оценке риска. Ретроспектив- ное исследование результатов аналитических испытаний допускается в тех случаях, когда ввиду технических возможностей они не могут быть получены до применения радиофармацев- тического лекарственного препарата, и должно быть основано на оценке риска. Рассмотрение результатов и разрешение на отпуск радио- фармацевтического лекарственного препарата до применения осуществляет ответственное лицо в письменной форме в документации серии. Должна быть разработана документирован- ная процедура, описывающая действия, обяза- тельные для выполнения в случае получения неудовлетворительных результатов испыта- ний после отпуска радиофармацевтического лекарственного препарата (отзыв или предо- ставление информации пользователям лекар- ственного препарата в зависимости от времени обнаружения).
Заключительное рассмотрение результатов и разрешение на отпуск радиофармацевтиче- ского лекарственного препарата осуществляет ответственное лицо в письменной форме в доку- ментации серии. 4.13. АРХИВНЫЕ ОБРАЗЦЫ При изготовлении радиофармацевтического лекарственного препарата в медицинской орга- низации его архивные образцы хранят в течение 1 мес с момента завершения всех испытаний или 1 мес после изготовления в зависимости от того, какой срок больше. При изготовлении одного флакона радиофармацевтического лекарствен- ного препарата получение архивных образцов является невозможным, что требует учета при оценке риска. По возможности аналогичный подход применяют к химическим прекурсорам и исходным материалам. Архивные образцы не требуются для радиофармацевтических лекар- ственных препаратов, изготовленных из радио- меченных клеток крови. 4.14. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОМЕЧЕННЫХ КЛЕТОК КРОВИ При операциях с клетками и радиомече- нии необходимо поддерживать как жизнеспо- собность, так и стерильность клеток. При этом защита оператора должна иметь первостепенное значение, биологического и радиационного воз- действия на оператора следует избегать. 4.14.1. Сбор клеток крови и клеточных компонентов для радиомечения и повторного введения донору или пациенту Сбор клеток крови и клеточных компонен- тов осуществляют таким образом, чтобы со- хранить их функцию, например, применяя иглу с широким отверстием, используя шприц, пред- варительно покрытый соответствующим анти- коагулянтом, избегая чрезмерного центрифуги- рования. Для предотвращения перепутывания контейнеров на их этикетках подходящим спо- собом приводят информацию о пациентах. Тре- бования к качеству для всех веществ, исполь- зуемых при выделении клеток, указываются в соответствующих частных фармакопейных статьях (при наличии). Независимо от наличия или отсутствия частной фармакопейной ста- тьи применяют общую фармакопейную статью 2.3.18.0. Субстанции для фармацевтического применения. При использовании гетерологич- ных клеток могут понадобиться дополнитель- 167 ные меры предосторожности, что должно быть предусмотрено соответствующими правилами. Для выделения клеточных компонентов крови необходимо применение центрифуги, конструкция которой должна обеспечивать ло- кализацию образцов в случае разливов и (или) поломок (например, с закрытыми емкостями). Оборудование, используемое для радиомечения клеток, применяют только для одной процедуры (одного пациента) за один раз, при этом пред- почтительным выбором является одноразовая посуда. Обработка образцов от разных пациен- тов должна разделяться соответствующими ин- тервалами времени и включать процесс очистки и дезинфекции посуды и оборудования, который обеспечивает уничтожение передаваемых через кровь патогенов и вирусов. 4.14.2. Радиомечение клеток Для предотвращения перекрестной контами- нации, перекрестного инфицирования или пере- путывания образцов крови и их микробной кон- таминации принимают соответствующие меры предосторожности. Условия радиомечения не должны нарушать целостность и (или) жизне- способность клеток. Вследствие невозможности проведения финишной стерилизации радиоме- чение клеток рассматривают как асептический процесс (см. раздел 4.8 данной общей фармако- пейной статьи). 4.14.3. Контроль качества Для проверки пригодности радиомеченных клеток до их отпуска и повторного введения про- водят идентификацию, расчет выхода процесса радиомечения и испытание на отсутствие агрега- ции или слипания клеток. Испытание жизнеспо- собности и целостности клеток должно выпол- няться через регулярные интервалы времени.
Валидация процесса получения радиомечен- ных клеток крови включает проверку жизнеспо- собности, морфологии или функции клеток в зависимости от типа клеток. Любые изменения в процедуре получения радиомеченных клеток должны быть валидированы. 168 4. ПРИЛОЖЕНИЕ 169 402000000-2023 4.2. ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАДИОНУКЛИДОВ, УКАЗАННЫХ В ФАРМАКОПЕЕ ЕВРАЗИЙСКОГО ЭКОНОМИЧЕСКОГО СОЮЗА В приложении приводятся физические харак- теристики радионуклидов, указанных в Фарма- копее Союза. Приложение следует рассматривать в качестве дополнения к общей фармакопейной статье 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекар- ственные препараты. В качестве физических характеристик ра- дионуклидов приводятся период полураспада радионуклидов, а также тип, энергия и веро- ятность излучения (в расчете на 100 распадов) для электронного и фотонного излучений. Фи- зические характеристики радионуклидов, ука- занных в Фармакопее Союза, представлены в таблице 4.2.-1. Их значения получены из базы данных Национального центра по ядерным дан- ным (NNDC) Брукхейвенской национальной лаборатории (США) (http://www.nndc.bnl.gov). При использовании более точных или обновлен- ных значений физических характеристик из дру- гого источника информации следует приводить ссылку на использованный источник. Значения периода полураспада указываются вместе с их неопределенностью, которая пред- ставляет собой стандартную неопределенность соответствующих последних цифр в значении периода полураспада. При этом неопределен- ность периода полураспада приводится в кру- глых скобках. В таблице используются следующие обозна- чения: eA − электроны Оже; ce − конверсионные электроны; β- − электроны; β+ − позитроны; γ − гамма-излучение; X − рентгеновское излучение. 170 Таблица 4.2.-1. – Физические характеристики радионуклидов, указанных в Фармакопее Союза Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Тритий (3Н) 12,33 (6) лет β- 0,006 (I) (макс. 0,19) 100 Углерод-11 (11С) 20,385 (20) мин β+ 0,386 (I) (макс. 0,960) 99,8 γ 0,511 199,5 (II) Азот-13 (13N) 9,965 (4) мин β+ 0,492 (I) (макс. 1,198) 99,8 γ 0511 199,6 (II) Кислород-15 (15О) 122,24 (16) с β+ 0,735 (I) (макс. 1,732) 99,9 γ 0,511 199,8 (II) Фтор-18 (18F) 109,77 (5) мин β+ 0,250 (I) (макс. 0,633) 96,7 γ 0,511 193,5 (II) Фосфор-32 (32Р) 14,26 (4) сут β- 0,695 (I) (макс. 1,71) 100 Фосфор-33 (33Р) 25,34 (12) сут β- 0,076 (I) (макс. 0,249) 100 Сера-35 (35S) 87,51 (12) сут β- 0,049 (I) (макс. 0,167) 100 Хром-51 (51Сr) 27,7025 (24) сут еА 0,004 67 Х 0,005 22,3 γ 0,320 9,9 171 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Кобальт-56 (56Со) 77,27 (3) сут еА 0,006 47 Х 0,006 – 0,007 25 β+ 0,179 (I) 0,9 γ 0,511 38,0 (II) 0,631 (I) 18,1 0,847 100,0 1,038 14,1 1,175 2,2 1,238 66,1 1,360 4,3 1,771 15,5 2,015 3,0 2,035 7,8 2,598 17,0 3,202 3,1 3,253 7,6 Кобальт-57 (57Со) 271,79 (9) сут еА+се 0,006-0,007 177,4 Х 0,006 – 0,007 57 се 0,014 7,4 γ 0,014 9,2 0,115 1,8 0,122 85,6 0,129 1,3 1,136 10,7 0,692 0,15 Таблица 4.2.-1.
– Продолжение 172 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Кобальт-58 (58Со) 70,86 (7) сут еА 0,006 49,4 Х 0,006-0,007 26,3 β+ 0,201 (I) 14,9 γ 0,511 29,9 (II) 0,811 99,4 0,864 0,7 1,675 0,5 Кобальт-60 (60Со) 5,2714 (5) лет β- 0,096 (I) (макс. 0,318) 99,9 1,173 100,0 1,333 100,0 Галлий-66 (66Ga) 9,49 (7) ч еА 0,008 21 Х 0,009 – 0,010 19,1 β+ 0,157 (I) 1 γ 0,511 112 (II) 0,331 (I) 0,7 0,834 5,9 0,397 (I) 3,8 1,039 37 0,782 (I) 0,3 1,333 1,2 1,90 (I) 50 1,919 2,1 2,190 5,6 2,423 1,9 2,752 23,4 3,229 1,5 3,381 1,5 3,792 1,1 4,086 1,3 4,295 4,1 4,807 1,8 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 173 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Галлий-67 (67Ga) 3,2612 (6) сут еА 0,008 62 Х 0,008-0,010 57 ce 0,082-0,084 30,4 γ 0,091-0,093 42,4 0,090-0,092 3,6 0,185 21,2 0,175 0,3 0,209 2,4 0,300 16,8 0,394 4,7 0,888 0,15 Германий-68 (67Gе) в равновесии с Галлием-68 (68Ga) 270,82 (27) сут (68Ga: 67,629 (24) мин) еА 0,008 42,4 Х 0,009 – 0,010 44,1 β+ 0,353 (I) 1,2 γ 0,511 178,3 0,836 (I) 88,0 1,077 3,0 Галлий-68 (68Ga) 67,29 (24) мин еА 0,008 5,1 Х 0,009 – 0,010 4,7 β+ 0,353 (I) 1,2 γ 0,511 178,3 0,836 (I) 88,0 1,077 3,0 Криптон-81m (81mKr) 13,10 (3) c се 0,176 26,4 Х 0,012 – 0,014 17,0 0,189 4,6 γ 0,190 67,6 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 174 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Рубидий-81 (81Rb) в равновесии с Криптоном-81m (81mKr) 4,576 (5) ч (81mKr: 13,10 (3) с) еА 0,011 31,3 Х 0,013 – 0,014 57,2 се 0,176 25,0 γ 0,190 64 0,188 4,3 0,446 23,2 0,457 3,0 β+ 0,253 (I) 1,8 0,510 5,3 0,447 (I) 25,0 0,511 54,2 0,538 2,2 Стронций-89 (89Sr) в равновесии с Иттрием-89m (89mY) 50,53 (7) сут (89mY: 16,06 (4) с) β- 0,583 (I) (макс. 1,492) 99,99 γ 0,909 0,01 Стронций-90 (90Sr) в равновесии с Иттрием-90 (90Y) 28,74 (4) лет (90Y: 64,10 (8) ч) β- 0,196 (I) (макс. 0,546) 100 Иттрий-90 (90Y) 64,10 (8) ч β- 0,934 (I) (макс. 2,280) 100 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 175 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Молибден-99 (99Мо) в равновесии с Технецием-99m (99mTc) 65,94 (1) ч (99mTc: 6,01 (1) ч) β- 0,133 (I) 16,4 Х 0,018-0,021 3,6 0,290 (I) 1,1 0,443 (I) 82,4 γ 0,041 1,1 0,141 4,5 0,181 6 0,366 1,2 0,740 12,1 0,778 4,3 Технеций-99m (99mTc) 6,01 (1) ч се 0,002 74 Х 0,018-0,021 7,3 еА 0,015 2,1 γ 0,141 89,1 се 0,120 9,4 0,137-0,140 1,3 Технеций-99 (99Tc) 2,11 × 105 лет β- 0,085 (I) (макс. 0,294) 100 Рутений-103 (103Ru) в равновесии с Родием-103m (103mRh) 39,26 (2) сут (103mRh: 56,114 (20) мин) еА+се 0,017 12 Х 0,020 – 0,023 9,0 се 0,030-0,039 88,3 γ 0,497 91 0,610 5,8β- 0,031 (I) 6,6 0,064 (I) 92,2 Таблица 4.2.-1.
– Продолжение 176 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Индий-110 (110In) 4,9 (1) ч еА 0,019 13,4 Х 0,023 – 0,026 70,5 γ 0,642 25,9 0,658 98,3 0,885 92,9 0,938 68,4 0,997 10,5 Индий-110m (110mIn) 69,1 (5) мин еА 0,019 5,3 Х 0,023 – 0,026 27,8 β+ 1,015 (I) 61 γ 0,511 123,4 (II) 0,658 97,8 2,129 2,1 Индий-111 (111In) 2,8047 (5) сут еА 0,019 15,6 Х 0,003 6,9 0,023 – 0,026 82,3 се 0,145 7,8 0,167 – 0,171 1,3 γ 0,171 90,2 0,219 4,9 0,245 94,0 0,241 – 0,245 1,0 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 177 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Индий-114m (114mIn) в равновесии с Индием-114 (114In) 49,51 (1) сут (114In: 71,9 (1) с) се 0,162 40 Х 0,023 – 0,027 36,3 0,186 – 0,190 40 γ 0,190 15,6 β- 0,777 (I) (макс. 1,985) 95 0,558 3,2 0,725 3,2 Теллур-121m (121mТе) в равновесии с Теллуром-121 (121Те) 154,0 (7) сут (121Те: 19,16 (5) сут) еА 0,003 88,0 Х 0,026-0,031 50,5 0,022 – 0,023 7,4 γ 0,212 81,4 се 0,050 33,2 1,102 2,50,077 40,0 0,180 6,1 Теллур-121 (121Те) 19,16 (5) сут еА 0,022 11,6 Х 0,026 – 0,030 75,6 γ 0,470 1,4 0,508 17,7 0,573 80,3 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 178 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Йод-123 (123I) 13,27 (8) ч еА 0,023 12,3 Х 0,004 9.3 0,027 – 0,031 86,6 се 0,127 13,6 0,154 1,8 γ 0,159 83,3 0,158 0,4 0,346 0,1 0,440 0,4 0,505 0,3 0,529 1,4 0,538 0,4 Йод-125 (125I) 59,402 (14) сут еА+се 0,004 80 Х 0,004 15,5 0,023-0,035 33 0,027 114 0,031 26 γ 0,035 6,7 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 179 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Йод-126 (126I) 13,11 (5) сут еА 0,023 6 Х 0,027-0,031 42,2 се 0,354 0,5 γ 0,388 34 0,634 0,1 0,491 2,9 0,511 2,3 (II) β- 0,109 (I) 3,6 0,666 33 0,290 (I) 32,1 0,754 4,2 0,459 (I) 8,0 0,880 0,8 1,420 0,3β+ 0,530 (I) 1 Йод-131 (131I) 8,02070 (11) сут се 0,46 3,5 Х 0,029 – 0,030 3,9 0,330 1,6 γ 0,080 2,6 β- 0,069 (I) 2,1 0,284 6,1 0,097 (I) 7,3 0,365 81,7 0,192 (I) 89,9 0,637 7,2 0,723 1,8 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 180 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Ксенон-131m (131mXe) 11,84 (7) cут еА 0,025 6,8 Х 0,004 8,3 0,030 44,0 се 0,129 61 0,034 10,2 0,159 28,5 0,163 8,3 γ 0,164 2,0 Йод-133 (133I) (распадается до радиоактивного Ксенона-133) 20,8 (1) ч β- 0,140 (I) 3,8 γ 0,530 87 0,162 (I) 3,2 0,875 4,5 0,299 (I) 4,2 1,298 2,4 0,441 (I) 83 Ксенон-133 (133Хе) 5,243 (1) сут еА 0,026 5,8 Х 0,004 6,3 0,031 40,3 се 0,045 55,1 0,035 9,4 0,075 – 0,080 9,9 γ 0,080 38,3 β- 0,101 (I) 99,0 Таблица 4.2.-1.
– Продолжение 181 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Ксенон-133m (133mХе) (распадается до радиоактивного Ксенона-133) 2,19 (1) сут еА 0,025 7 Х 0,004 7,8 0,030 45,9 се 0,199 64,0 0,034 10,6 0,228 20,7 0,232 4,6 γ 0,233 10,0 Йод-135 (135I) (распадается до радиоактивного Ксенона-135) 6,57 (2) ч β- 0,140 (I) 7,4 γ 0,527 13,8 0,237 (I) 8 0,547 7,2 0,307 (I) 8,8 0,837 6,7 0,352 (I) 21,9 1,039 8,0 0,399 (I) 8 1,132 22,7 0,444 (I) 7,5 1,260 28,9 0,529 (I) 23,8 1,458 8,7 1,678 9,6 1,791 7,8 Ксенон-135 (135Хе) 9,14 (2) ч се 0,214 5,5 Х 0,031 – 0,035 5,0 β- 0,171 3,1 γ 0,250 90,2 0,308 96,0 0,608 2,9 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 182 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Цезий-137 (137Cs) в равновесии с Барием-137m (137mBa) 30,04 (3) лет (137mBa: 2,552 (1) мин) еА 0,026 0,8 Х 0,005 1 0,032 – 0,036 7 се 0,624 8,0 0,656 1,4 γ 0,662 85,1 β- 0,174 (I) 94,4 0,416 (I) 5,6 Иттербий-175 (175Yb) 4,185 (1) сут еА 0,00602 6,34 Х 0,0530 – 0,541 5,90 се 0,05049 7,42 0,1029 1,76 γ 0,1138 3,87 β- 0,0190 20,4 0,2825 6,13 0,1024 6,7 0,3963 13,2 0,1399 72,9 Лютеций-177m (177mLu) 160,44 (6) сут еА 0,00618 129,8 Х 0,0079 45,6 се 0,04001 33,6 0,0546 – 0,0649 115,2 0,04760 18,2 γ 0,2285 37,1 0,06315 23,9 0,2818 14,2 0,08793 16,1 0,3277 18,1 0,1017 23,9 0,3785 29,9 β- 0,04082(I) 78,6 0,4137 17,5 0,4185 21,3 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 183 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Лютеций-177 (177Lu) 6,647 (4) сут еА 4,3 – 11,2 8,8 Х 0,007 – 0,011 3,2 0,054 – 0,056 4,4 β- 0,0477 11,6 γ 0,1129 6,2 0,1117 9,1 0,2084 10,4 0,1494 79,3 Таллий-200 (200Tl) 26,1 (1) ч се 0,285 3,4 Х 0,010 32,0 0,353 1,4 0,069 – 0,071 63,3 0,08 17,5 β- 0,495 (I) 0,3 γ 0,368 87,2 0,579 13,8 0,828 10,8 1,206 29,9 1,226 3,4 1,274 3,3 1,363 3,4 1,515 4,0 Таблица 4.2.-1. – Продолжение 184 Радионуклид Период полураспада Электронное излучение Фотонное излучение тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) тип энергия (МэВ) вероятность излучения (на 100 распадов) Свинец-201 (201Pb) (распадается до радиоактивного Таллия-201) 9,33 (3) ч еА 0,055 3 Х 0,070 – 0,073 69 0,083 19 се 0,246 8,5 0,276 2 γ 0,331 79 0,316 2,3 0,361 9,9 0,406 2,0 0,585 3,6 0,692 4,3 0,767 3,2 0,826 2,4 0,908 5,7 0,946 7,9 1,099 1,8 1,277 1,6 Таллий-201 (201Tl) 72,912 (17) ч се 0,016 – 0,017 17,7 Х 0,010 46,0 0,027 – 0,029 4,1 0,069 – 0,071 73,7 0,052 7,2 0,080 20,4 0,084 15,4 0,153 2,6 γ 0,135 2,6 0,167 10,0 Таблица 4.2.-1. – Продолжение