Текст очень длинный, поэтому разбит на части. Часть 2 из 4.
Метод выбирают с уче- том различных факторов, включая стадию раз- работки лекарственного препарата, природу клетки-хозяина и иммуногенность белков, тип экспрессии, производственный процесс и пред- шествующий опыт. При выборе и разработке методики количе- ственного определения остаточных белков клет- ки-хозяина необходимо учитывать жизненный цикл испытания (обеспеченность реактивами, постоянство их качества, валидацию методики количественного определения, внесение изме- нений в производственный процесс). ТИПЫ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Процесс-специфичные методы количественного определения Методику количественного определения оста- точных белков клетки-хозяина, специфичных для процесса (процесс-специфичных или про- дукт-специфичных остаточных белков клетки-хо- зяина), разрабатывают и валидируют с учетом особенностей производственного процесса и с ис- пользованием той же экспрессирующей системы, что и при получении рекомбинантного продукта. Антигены белков клетки-хозяина получают путем имитации процесса производства актив- ной фармацевтической субстанции (или анало- гичного ему процесса) до стадии, способной вырабатывать широкий спектр белков клет- ки-хозяина в достаточном количестве. Полученные антисыворотки должны охваты- вать широкий диапазон белков клетки-хозяина, чтобы определять как можно больше различных белков клетки-хозяина и учитывать вариабель- ность производственного процесса. Платформенные методы количественного определения Платформенные методы количественного определения остаточных белков клетки-хозяина разрабатывают производители для конкретных биотехнологических процессов, используемых в производстве. Одни и те же наборы реактивов применяют для определения остаточных белков клетки-хозя- ина в нескольких лекарственных средствах, полу- ченных от одного типа экспрессирующей систе- мы (например, линия клеток яичников китайского хомячка (CHO)), при условии, что процессы на- работки биологического материала с целевым продуктом (и последующие за ним выделение и очистка целевого продукта, если применимо) до- статочно схожи для этих лекарственных средств. Возможность применения антисыворотки долж- на быть оценена, как описано для процесс-спец- ифичных методов количественного определения. Общие методы количественного определения Коммерчески доступные наборы реактивов для определения остаточных белков клетки-хо- зяина предназначены для работы с широким спектром белков от аналогичных типов экспрес- сирующих систем. Подробная информация по производству реактивов может быть не доступ- на. Например, антигены могут быть выделены из смеси штаммов клетки-хозяина, и использу- емый процесс (процессы) может не совпадать с процессом, применяемым для конкретного лекарственного средства. Возможность приме- нения антисыворотки должна быть оценена, как описано для процесс-специфичного метода ко- личественного определения. КРИТЕРИИ ВЫБОРА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Ввиду потенциальных вопросов безопас- ности, ассоциированных с остаточным количе- ством белков клетки-хозяина в активных фар- мацевтических субстанциях, для выбора между общим, платформенным или процесс-специ- фичным методами количественного опре- деления проводят оценку риска, принимая во внимание стадию разработки лекарственно- го средства. На начальном этапе разработки могут быть использованы общий или платформенный мето- ды количественного определения.
46 На поздних этапах разработки следует использовать процесс-специфичные методы ко- личественных определений как более точные, особенно в сравнении с общими методами коли- чественного определения, так как процесс-спец- ифичные методы с большей вероятностью обна- ружат иммунореактивность против характерных белков клетки-хозяина. Методы платформен- ного или общего количественного определения могут быть использованы при условии, что ме- тодика количественного определения соответ- ствующим образом валидирована и ее пригод- ность оценена относительно специфичных для процесса остаточных белков клетки-хозяина. ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ Для иммунологического количественного определения остаточных белков клетки-хозяина реактивы (антигены и антисыворотки) получают способами, которые при необходимости могут быть повторно воспроизведены. Антигены используют для получения по- ликлональных антител с помощью иммуниза- ции одного или нескольких подходящих видов животных. Кроме того, антигены белков клет- ки-хозяина применяют в качестве стандартного образца при количественном определении оста- точных белков клетки-хозяина. Антигены должны охватывать как можно более широкую совокупность видов белков клетки-хозяина, которые могут быть получены в производственном процессе целевого белка и по возможности включать в себя всю сово- купность видов белков, получаемых в условиях наихудшего случая процесса очистки, а также обеспечивать робастность против потенциаль- ных изменений производственного процесса в течение жизненного цикла лекарственного препарата. ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ Разработка процесс-специфичного метода ко- личественного определения остаточных белков клетки-хозяина включает выбор нулевой клеточ- ной линии, не содержащей ген экспрессии целе- вого продукта и полученной из клеточной линии, использованной при создании производствен- ной клеточной линии, продуцирующей целевой белок. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно трансфицирован- ной. Ложно трансфицированную линию клеток получают с помощью трансфекции родительской линии клеток плазмидой, используемой при соз- дании производственной клеточной линии, но без гена, кодирующего целевой белок. ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА Процессы наработки продукта, содержащего целевой белок Антигены для процесс-специфичного метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина получают, имитируя планируе- мый производственный процесс с использовани- ем нулевой клеточной линии и, где это возможно, в одних и тех же условиях производства. Любая имитация производственного про- цесса является приближением к предполага- емому производственному процессу, поэтому они могут иметь отличия, например, различный масштаб, рабочие параметры, взаимодействие продуктов. Такие отличия необходимо тщатель- но оценить, так как они могут повлиять на сово- купность видов белков клетки-хозяина. Например, при имитации стадии фермента- ции процесса производства телец включения, получение желаемых телец включения может быть не достигнуто. В связи с этим, в зависи- мости от используемой нулевой клеточной ли- нии (например, ложно трансфицированной или не трансфицированной), антигены получают иначе, чем в предполагаемом производственном процессе.
В отдельных случаях для некоторых параме- тров производственного процесса при имитации производства может потребоваться корректи- ровка с учетом наихудшего случая (например, для получения антигенов, охватывающих широ- кий спектр различных видов белков клетки-хо- зяина). Например, супернатант клеточной куль- туры, содержащий антиген, может быть собран уже после достижения минимального уровня жизнеспособности клеток, чтобы включить больше цитозольных белков, которые высвобо- ждаются при дополнительном лизисе клеток. 47 Процессы выделения и очистки целевого белка Полученные антигены подвергают щадя- щему воздействию (фильтрации, концентриро- ванию) с целью получения репрезентативного спектра белков клетки-хозяина. Дальнейшую очистку обычно не рекомендуется, так как су- ществует риск потери видового разнообразия остаточных белков. В случаях, когда не достиг- нута репрезентативность антигенов (например, в результате узкого охвата), можно рассмотреть возможность смешивания имитационных мате- риалов с различных этапов обработки. Возмож- но увеличение разнообразия антигенов путем объединения материалов, полученных в резуль- тате имитации ферментации и (или) очистки с использованием различных производствен- ных условий, или селективных этапов очистки (например, для уменьшения общего количества некоторых иммунодоминантных остаточных белков клетки-хозяина). Перекрестная контаминация целевым белком Существенным фактором риска при получе- нии антигенов, используемых в качестве реак- тивов, является контаминация целевым белком с последующей перекрестной реакцией с поли- клональными антителами, что необходимо учи- тывать при организации производственного и лабораторного процессов. По этой причине при получении антигенов максимально используют специальное или одноразовое оборудование. Когда это невозможно, оборудование должно быть очищено соответствующим образом. Определение характеристик и испытания Перед использованием антигенов для имму- низации, в них определяют общее содержание белка и подтверждают отсутствие целевого белка. Сравнение совокупности белков клетки-хо- зяина, полученных в результате имитирован- ного и предполагаемого производственных процессов, выполняют, как правило, при помо- щи электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и (или) двумерного электрофореза с высокочувствительным красите- лем. Сравнение должно показать, что антигены, полученные при имитации процесса, содержат большинство видов белков клетки-хозяина пред- полагаемого производственного процесса. При необходимости дополнительная информация мо- жет быть получена с помощью ортогональных методов (например, масс-спектрометрии). ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ Разработка платформенного метода количе- ственного определения остаточных белков клет- ки-хозяина включает выбор нулевой клеточной линии, не содержащей ген экспрессии целевого продукта, и использование одного и того же вида клетки-хозяина. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно транс- фицированной и может быть использована для производства антигенов для продуктов данной производственной площадки производителя. ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА Наработка биоматериала, содержащего целевой белок Антигены для испытаний с использованием платформенного метода получают с помощью имитации производственного процесса, ис- пользуемого для нескольких продуктов, обычно с использованием одних и тех же компонентов среды.
При любой имитации производства ис- пользуемый процесс должен быть максимально приближен к предполагаемому производствен- ному процессу, так как это может повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина (см. раздел Процесс-специфичные методы количественного определения остаточных бел- ков данной общей фармакопейной статьи). Процесс выделения и очистки целевого белка Как и для других методов количественного определения, антигены белков клетки-хозяина, полученные на технологической стадии нара- ботки биоматериала, как правило, обрабаты- вают лишь в минимальной степени (например, без стадий очистки или с ограниченным количе- ством стадий) для получения широкого спектра белков клетки-хозяина, в то же время стратегии смешивания и объединения также могут исполь- зоваться для расширения спектра видов белков клетки-хозяина. Определение характеристик и испытания Определяют общее содержание белка и под- тверждают отсутствие целевого белка. Сравни- вают белки клетки-хозяина, полученные при имитации процесса и в предполагаемом произ- водственном процессе. 48 ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Общий метод количественного определения разрабатывает производитель коммерческого набора реактивов. Подробная информация по производству реактивов может быть не раскры- та. Например, клеточная культура может быть получена из смеси штаммов экспрессирующих клеток одного типа (вида), а используемый процесс (процессы) может не совпадать с про- цессом, применяемым для конкретного лекар- ственного средства. Общий метод количествен- ного определения должен быть выбран с учетом предполагаемого конкретного производственно- го процесса (например, подходящая линия клет- ки-хозяина) и надлежащим образом валидиро- ван для целевого продукта и этапа разработки. Если общий метод количественного опреде- ления применяют на более поздних этапах разра- ботки или во время промышленного производства, целесообразно валидировать методику количе- ственного определения и контролировать постоян- ство состава реактивов от серии к серии используя либо соответствующие предшествующие фрак- ции из производственного процесса, либо образец продукта, полученный при имитации процесса с использованием нулевой клеточной линии. ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТЕЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ И ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕНННОГО ОПРЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Иммунизация Для получения поликлональных антител им- мунизируют один или несколько подходящих видов животных. Основной задачей иммуниза- ции является получение высокоспецифичных поликлональных антител, чувствительных к каждому из антигенных белков в смеси белков клетки-хозяина, используемой в качестве им- муногена. Иммунный ответ животного должен индуцироваться как высокоиммунными, так и низкоиммунными антигенами. Выбирают вид животного, позволяющее по- лучать достаточное количество и разнообразие специфического к белкам клетки-хозяина имму- ноглобулина G. Если поликлональные антитела для образо- вания иммунного комплекса антиген – антитело (первичные антитела) и для детекции результатов реакции (вторичные антитела) получены из одного и того же источника, можно предположить, что при проведении количественного определения они рас- познают разные эпитопы на одном и том же белке клетки-хозяина. Альтернативно можно использо- вать поликлональные антитела к белкам клетки-хо- зяина от разных видов животных.
Использование нескольких животных для каждого из данных ви- дов позволяет уменьшить влияние индивидуальной изменчивости иммунной системы и обеспечить дополнительное разнообразие ответов, что будет способствовать максимальному охвату антителами против антигенов белков клетки-хозяина. В случае ограниченного количества антиге- нов, использование адъювантов сокращает вре- мя формирования иммунного ответа. В случае сложного состава смеси антигенов может потре- боваться дифференциальное усиление иммун- ного ответа к низкоиммуногенным антигенам или к антигенам в более низких концентрациях. Для достижения максимального иммунного ответа может потребоваться несколько циклов иммунизации, и, в зависимости от частоты имму- низации, процесс может занять от 3 до 6 месяцев. Иммунный ответ на белки клетки-хозяина для конкретной схемы иммунизации контроли- руют путем определения титра антител с исполь- зованием, например, ИФА, и путем сравнения ре- зультатов одно- или двумерного электрофореза после окрашивания белков и вестерн-блоттинга, где в качестве первичных антител используют поликлональные антитела к белкам клетки-хозя- ина. На практике некоторые белки, вызывающие сильный иммунный ответ, могут быть не видны в геле при окрашивании, а некоторые белки со слабыми антигенными свойствами, обнаружи- ваемые при окрашивании белков, могут не вы- зывать детектируемый иммунный ответ. В муль- типлексных иммунологических испытаниях для достижения линейности при разведении образ- ца важно, чтобы реактив, содержащий антитела, одновременно и специфически распознавал как можно больше отдельных молекул в образце, и присутствовал в стехиометрическом избытке. Для этой цели серии разведений испытуемых образцов, полученных на разных стадиях произ- водственного процесса, предварительно оцени- 49 вают с помощью твердофазного ИФА, используя для этого очищенные антитела белков клетки-хо- зяина, показавшие высокую эффективность в вестерн-блоттинге. На основании результатов описанных выше испытаний антисыворотки от разных животных объединяют, повторно испытывают и очищают. Очистка и подготовка Антитела к белкам клетки-хозяина долж- ны быть очищены. Как правило, применяют аффинную хроматографию на основе связы- вания с белком А или белком G и (или) аффин- ную хроматографию на основе антигена белка клетки-хозяина. Может потребоваться дополнительная очистка для удаления потенциальных агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии. Для ИФА часть очищенных антител к бел- кам клетки-хозяина конъюгируют с меткой, не- обходимой для детекции результатов реакции (например, биотином или пероксидазой хрена). Очищенные антитела к белкам клетки-хозя- ина и антисыворотки хранят при температуре, обеспечивающей их стабильность. Определение характеристик и испытания Полученные и используемые в качестве реак- тивов поликлональные антитела должны обеспе- чивать связывание максимального спектра белков антигена и не давать перекрестной реакции с це- левым белком. Их пригодность оценивают путем подтверждения охвата белков клетки-хозяина, ха- рактерных для производственного процесса. Для этого проводят двумерный электрофорез антигенов белков клетки-хозяина. Полученный белковый профиль после иммуноокрашивания сравнивают с белковым профилем, полученным при окрашивании неселективным красителем. Антитела к белкам клетки-хозяина должны рас- познавать широкий спектр белков клетки-хозяи- на при любых зарядах и молекулярных размерах. Могут быть рассмотрены другие подходящие методы.
ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ Иммунизацию, очистку и производство ан- тител к белкам клетки-хозяина выполняет про- изводитель коммерческого набора реактивов, и подробная информация по производству мо- жет быть не представлена. В большинстве слу- чаев возможен лишь ограниченный контроль за постоянством качества реактивов от серии к серии, в связи с чем необходимо проводить соответствующие сравнительные испытания серий. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ- ХОЗЯИНА Метод твердофазного ИФА для определения остаточных белков клетки-хозяина разработан с целью обнаружения и количественного опреде- ления гетерогенной смеси антигенов, содержа- щихся в различных концентрациях, с помощью антител, добавляемых в соотношении не один к одному. Ниже описаны требования к разработ- ке и валидации данного типа ИФА. Методику испытания на остаточные бел- ки клетки-хозяина методом ИФА, валидируют по характеристикам: правильность, специфич- ность, прецизионность, предел количественного определения, предел обнаружения, линейность, диапазон применения и робастность. В течение жизненного цикла лекарственного препарата может потребоваться полная или частичная повторная валидация методики, например, при внесении изменений в производственный про- цесс, которые могут повлиять на пригодность антигенов. ПРАВИЛЬНОСТЬ Правильность подтверждают методом добавок и открываемости стандартного образ- ца белка клетки-хозяина в соответствующем «фоновой» матрице (например, активная фарма- цевтическая субстанция или образец с соответ- ствующего этапа очистки). СПЕЦИФИЧНОСТЬ Специфичность подтверждают отсутствием интерференции со стороны матрицы (напри- мер, содержащей активную фармацевтическую субстанцию). Для оценки специфичности могут быть использованы результаты проверки пра- вильности. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ Повторяемость, промежуточная прецизион- ность и воспроизводимость должны быть соот- ветствующим образом подтверждены. 50 ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ Чувствительность обычно находится в диапазоне частей на миллион (ppm) и вы- ражается через предел количественного определения. Предел количественного опре- деления как правило определяют методом добавок белков клетки-хозяина в активную фармацевтическую субстанцию или в соот- ветствующую пробу матрицы и рассчитывают на основе минимальной добавки, обеспечи- вающей отклик с заданной правильностью и прецизионностью. Предел обнаружения чаще всего не опреде- ляют, так как он не является обязательным пара- метром валидации. ЛИНЕЙНОСТЬ Линейность методики количественного определения остаточных белков клетки-хозя- ина подтверждают с помощью серии разведе- ний стандартного образца белка клетки-хозяина и изучения правильности. В силу особенностей количественного опре- деления остаточных белков клетки-хозяина, большим количеством видов белков и поликло- нальных антител белков клетки-хозяина, может наблюдаться нелинейность при разведениях об- разцов. Например, полученные путем обратных вычислений результаты возрастают по мере ро- ста числа разведений образцов. В большинстве случаев это связано с излишком одного или не- скольких отдельных белков клетки-хозяина в об- разце по сравнению с доступным количеством антител в ИФА белков клетки-хозяина. Как след- ствие, необходимо оценить линейность при раз- ведениях для соответствующих стадий процесса путем сравнения целевой и измеренной концен- трации остаточных белков клетки-хозяина при разной степени разведения пробы.
Линейность методики считается подтвержденной, если для разных разведений образца соблюдаются кри- терии приемлемости. Исследования, подтверж- дающие линейность при разведениях образца, можно проводить при разработке метода или на этапе валидации. Если при разведении образца отмечают от- сутствие линейности, делают многократные раз- ведения вне границ диапазона, в котором обна- руживается нелинейность. Окончательное содержание остаточных белков клетки-хозяина обычно выражают как среднюю концентрацию белков клетки-хозяина, полученную как минимум для двух разведений в пределах линейного диапазона. При соответ- ствующем обосновании может быть достаточно одного разведения. ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ Диапазон применения методики обычно определяют по концентрациям остаточных бел- ков клетки-хозяина, для которых был показан подходящий уровень прецизионности, правиль- ности и линейности. РОБАСТНОСТЬ Оценка робастности проводится на этапе разработки методики. ЗАМЕНА МЕТОДА КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И (ИЛИ) ИСПОЛЬЗУЕМЫХ РЕАКТИВОВ Количество антигенов и антител должно быть достаточным, чтобы обеспечить возможность проведения испытания на остаточные белки клет- ки-хозяина в течение нескольких лет. Следова- тельно, обеспеченность и постоянство качества реактивов должны надлежащим образом управ- ляться на протяжении всего жизненного цикла испытания. Для общего метода количественного определе- ния остаточных белков клетки-хозяина, чтобы убе- диться в постоянстве качества реактивов, может по- требоваться повторная проверка пригодности или повторная валидация методики для каждой новой серии реактива, поскольку их качество может ме- няться от одной серии к другой. Для процесс-специфичных и для платформен- ных методов количественных определений необхо- димость в новых сериях реактивов для испытания на белки клетки-хозяина может возникнуть в двух основных случаях: – исчерпаны запасы стандартного образца белков клетки-хозяина и (или) антител; в таком случае антитела могут быть выделены из запаса замороженной сыворотки или требуется новая иммунизация; – изменение производственного процесса может повлиять на совокупность видов белков 51 клетки-хозяина, присутствующих в очищенных промежуточных продуктах или активной фар- мацевтической субстанции; реактив для испы- тания может не подходить для обнаружения и количественного определения модифицирован- ных белков клетки-хозяина; поэтому изменение производственного процесса может обусловить непригодность реактивов для использования ис- пытании. Вновь приготовленные реактивы долж- ны быть тщательно охарактеризованы (напри- мер, сочетанием методов двумерного элек- трофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и вестерн-блоттинга или сочетанием методов двумерного электрофо- реза в полиакриламидном геле с натрия доде- цилсульфатом с дифференциальным гель-э- лектрофорезом и идентификацией с помощью масс-спектрометрии). Необходимо оценить валидационные характеристики методики с использованием новых реактивов. Проверку новых реактивов рекомендуется проводить па- раллельно с имеющимися ранее одобренными реактивами. 52 Таблица 2.1.6.20.-1.
– Рекомендации по оценке пригодности реактивов и оценке валидационных характеристик методики испытания в случае истощения запаса используемых реактивов или внесения изменения в производственный процесс Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Оценка пригодности Концентрацию белка в новой серии реактива предпочти- тельно определять с исполь- зованием тех же методов, что и для текущей (одобрен- ной) серии реактива, чтобы обеспечить сопоставимость концентраций белка. С по- мощью подходящих мето- дов (например, одно- или двумерный электрофорез, двумерный дифференци- альный гель-электрофорез оценивают сходство сово- купностей видов белков меж- ду новой серией и текущей (одобренной) серией реактивов. Определяют общую концентрацию белка новой серии антител. Конечную концен- трацию для количественного определения необходимо установить для новой серии, чтобы получить такую же калибровочную кривую, что и для текущей (одобренной) серии реактива. Для детектирующих антител с меткой (вторичные антитела) контролируют стехиометрию белков для подтвержде- ния аналогичности текущей (одобренной) серии антител. Иммунореактивность новой серии ан- тител сравнивают качественно (визуаль- ное сравнение) или полуколичественно (определение области охвата) с теку- щей (одобренной) серией подходящими методами (например, одно- или двумер- ный вестерн-блоттинг). Из-за изменчиво- сти методики настоятельно рекомендует- ся проводить эту проверку пригодности параллельно с текущей (одобренной) серией антител. Эффекты изменений производственного процесса, которые могут повлиять на совокупность видов бел- ков клетки-хозяина, проверяют подходящими мето- дами (например, одно- или двумерный электрофорез, вестерн-блоттинг, количественное определение белков клетки-хозяина). Если изменение производственного процесса не приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, но была подтверждена пригод- ность текущих (одобренных) реактивов, то текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производ- ственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, и было показано, что текущие (одобренные) реактивы не подходят для нового произ- водственного процесса, необходимо разработать новую методику испытания, включая пробную ферментацию в соответствии с новым производственным процессом и новую иммунизацию. 53 Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Испытание реактивов для количественного определения остаточных белков клетки-хозяина Новую серию реактива испы- тывают в сравнении с текущей (одобренной) серией реакти- ва с использованием метода добавок при различных кон- центрациях в пределах диапа- зона применения методики. Сравнивают сходимость кали- бровочных кривых, получен- ных с использованием новой серии реактива и текущей (одобренной) серии реактива. Сравнивают калибровочные кривые, полу- ченные при использовании новых и теку- щих (одобренных) серий антител. Сокращенное исследование проводят с испытанием соответствующих техноло- гических образцов (например, начиная от стадии очистки полупродукта до получения активной фармацевтической субстанции).
В параллельном эксперименте новая серия антител должна обнаруживать белки клет- ки-хозяина на разных этапах процесса в той же концентрации или ниже, что обнаружи- вает текущая (одобренная) серия антител. Сбор, полученный в пробном этапе нового процесса, прове- ряют на открываемость добавки с использованием текущей методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина. Образцы, соответствующие стадии производственного процесса (например, начиная от стадии очистки сбора до получения активной фармацевтической субстанции) из нового и текущего процессов проверяют параллельно. Таблица 2.1.6.20.-1. – Продолжение 54 Реактив Изменения в производственном процессеантигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина антитела к белкам клетки-хозяина Оценка валидационного статуса Если проверка пригодно- сти реактивов и испытания ИФА показали соответствие нового стандартного образца белка (белков) клетки-хозя- ина, текущий (одобренный) стандартный образец может быть заменен. Повторная ва- лидация методики испытания не требуется. Если новый стандартный образец белка (белков) клет- ки-хозяина значительно отли- чается по совокупности ви- дов белков и (или) по рабочим характеристикам в количе- ственном определении от те- кущего (одобренного) стан- дартного образца, требуется повторная валидация мето- дики. Если проверка пригодности реактивов и испытания ИФА показывают соответствие новой серии антител, текущая (одобрен- ная) серия антител может быть заменена. Повторная валидация методики испытания не требуется. Если новая серия антител значитель- но отличается по иммунореактивности вестерн-блоттинга или чувствительности иммуноанализа и (или) по рабочим харак- теристикам в количественном определении от текущей (одобренной) серии антител, требуется повторная валидация методики. Если для нового производственного процесса текущая (одобренная) серия антител показывает аналогичную или более высокую иммунореактивность по сравнению с пре- дыдущим процессом, и результат количественного опре- деления остаточных белков клетки-хозяина подтвержда- ет приемлемую открываемость белков клетки-хозяина из пробного сбора нового процесса, а также аналогичную или более высокую чувствительность для образцов из соответ- ствующих стадий производственного процесса, то текущая методика количественного определения и реактивы счита- ются подходящими для нового процесса. Повторная валида- ция методики испытаний не требуется. Если ИФА обнаруживает существенные различия в откры- ваемости добавки белков клетки-хозяина или в определяе- мых концентрациях белков клетки-хозяина на отдельных стадиях для текущего и нового процессов, при том, что реактивы признаны подходящими, требуется повторная валидация методики. Изменение производственного процес- са может также повлиять на линейность разведения испы- туемых образцов из отдельных стадий производственного процесса; если эти стадии являются критическими с точки зрения стратегии контроля содержания остаточных белков клетки-хозяина, может потребоваться повторная валидация или даже создание новых реактивов антител. В случае существенного изменения совокупности видов белков клетки-хозяина в новом производственном процес- се, которое приводит либо к несоответствию совокупности видов белков по сравнению с текущим (одобренным) стан- дартным образцом (антигенами), либо к снижению имму- нореактивности антител, либо к значительному снижению чувствительности иммунологического анализа, готовят но- вые реактивы для анализа и проводят валидацию методики анализа с использованием новых реактивов. Таблица 2.1.6.20.-1.
– Продолжение 55 201060021-2023 2.1.6.21. ПРИМЕНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ Настоящая общая фармакопейная статья приводится для информации. 1. ВВЕДЕНИЕ Эндотоксины грамотрицательных бактерий являются самой распространенной причиной токсических реакций, возникающих в резуль- тате загрязнения фармацевтической продукции пирогенами; их общая пирогенная активность намного выше, чем у других известных пиро- генных веществ. Бактериальные эндотоксины представляют собой липополисахариды, кото- рые являются термостабильным компонентом наружной части клеточной стенки всех грамо- трицательных микроорганизмов. Существует лишь небольшое количество пирогенов, обла- дающих иной структурой. В целом, по отсут- ствию бактериальных эндотоксинов в субстан- ции для фармацевтического применения и (или) лекарственном препарате можно сделать вывод об отсутствии пирогенных веществ при условии, что наличие пирогенов неэндотоксиновой при- роды исключено. Испытания на пирогенность (2.1.6.2) и на активацию моноцитов (2.1.6.13) являются подходящими методами для опреде- ления отсутствия пирогенов неэндотоксиновой природы в субстанции для фармацевтического применения и лекарственном препарате. Присутствие бактериальных эндотоксинов может быть замаскировано факторами, вли- яющими на реакцию между эндотоксинами и лизатом амебоцитов мечехвоста. На обнаруже- ние эндотоксинов могут влиять условия и (или) время хранения образцов и реактивов. Следова- тельно, перед проведением испытания на бакте- риальные эндотоксины или перед выбором меж- ду испытаниями на бактериальные эндотоксины и на пирогенность или на активацию моноцитов, необходимо подтвердить возможность его про- ведения для конкретной субстанции для фарма- цевтического применения и (или) лекарственно- го препарата; при этом может быть необходимо выполнение процедуры устранения мешающих факторов. Согласно указаниям общей фармакопей- ной статьи 2.1.6.8. Бактериальные эндотокси- ны, при проведении испытания должны быть выполнены следующие условия: – подтвержденное отсутствие влияния мате- риалов, используемых в испытании. Должно быть показано отсутствие эндотоксинов в воде для испы- тания на бактериальные эндотоксины, других реак- тивах и расходных материалах. Также, должна быть подтверждена чувствительность лизата амебоцитов, заявленная производителем; – чувствительность лизата амебоцитов опре- деленная как в присутствии, так и в отсутствии испытуемого образца, в связи с возможным влия- нием на испытание. Между двумя полученными значениями чувствительности не должно быть значимой разницы. В общей фармакопейной статье 2.1.6.8. Бактериальные эндотоксины представлены методы удаления мешающих факторов; в слу- чае использования других методов должно быть проведено дополнительное испытание для под- тверждения нейтрализации или удаления мешаю- щих факторов. В данной общей фармакопейной статье приве- дены причины установления требований к испыта- ниям на бактериальные эндотоксины, а также разъ- яснения по расчетам и интерпретации результатов. Замена испытания Пирогенность, указан- ного в частной фармакопейной статье, на испы- тание Бактериальные эндотоксины или другие методы, например, испытание на активацию моноцитов или испытание с использованием ре- комбинантного фактора С, требует подтвержде- ния возможности проведения метода для кон- кретной субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата и получения соответствующего результата альтер- нативным методом, в соответствии с указаниями раздела 1. Общие сведения Фармакопеи Союза (см.
также раздел 13 данной общей фармакопей- ной статьи). Метод определения бактериальных эндоток- синов может быть указан в частной фармакопей- ной статье. Если метод не указан, используют лю- бой из методов от A до F общей фармакопейной статьи 2.1.6.8. Бактериальные эндотоксины. 56 2. МЕТОДЫ И КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ 2.1. МЕТОДЫ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Добавление бактериальных эндотоксинов к лизату амебоцитов может привести к помут- нению, осаждению или гелеобразованию (гель- тромб). Первоначально, только гель-тромб метод применяли для оценки качества субстанции для фармацевтического применения и (или) лекар- ственного препарата при проведении испытания на бактериальные эндотоксины. Преимущество метода заключалось в простоте принятия реше- ния о качестве испытуемого образца по резуль- татам испытания на основании отсутствия или присутствия плотного геля, видимого невоору- женным глазом. Количественные фотометри- ческие методы C, D, E и F были разработаны позднее: данные методы требуют оснащения со- ответствующим оборудованием, но могут быть автоматизированы для рутинных испытаний большого количества образцов одной и той же субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата. Бактериальные эндотоксины могут адсор- бироваться на поверхности пробирок или пипе- ток из определенных полимерных материалов или типов стекла. Мешающие факторы могут появиться вследствие высвобождения веществ из полимерных материалов. Следовательно, ис- пользуемое оборудование должно быть проверено. 2.2. ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ Решение использовать в испытании на бак- териальные эндотоксины методы качественного анализа подразумевает, во-первых, установле- ние предельного содержания эндотоксинов для субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата, подлежащих исследованию, и, во-вторых, проведение испы- тания с целью получения информации будет ли концентрация эндотоксинов в испытуемом образце ниже или выше установленного пре- дельного содержания эндотоксинов. Количественные фотометрические методы C, D, E и F позволяют определить содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце, но для соответствия фармакопейным требованиям и при рутинном контроле качества основной вопрос заключается в том, превышает ли это значение допустимое предельное содер- жание эндотоксинов. При установлении предельного содержа- ния бактериальных эндотоксинов в лекар- ственном препарате следует учитывать его терапевтическую дозу и пути введения. При уста- новлении предельного содержания эндотоксинов в субстанции для фармацевтического примене- ния следует использовать рекомендации по при- менению и дозированию лекарственного препа- рата, в состав которого она входит. Предельное содержание бактериальных эндотоксинов определяет допустимую концен- трацию эндотоксинов в лекарственном препа- рате. Если содержание эндотоксинов не превы- шает этого показателя, то даже при введении пациенту максимальной дозы лекарственно- го препарата в течение часа предполагаемым путем не возникает токсической реакции, обусловленной эндотоксинами. Методы качественного анализа в ис- пытаниях на бактериальные эндотоксины не позволяют установить различия между содержанием эндотоксинов равным предель- ному содержанию или выше его. Образова- ние плотного геля происходит, если содер- жание эндотоксинов в испытуемом образце достигает значения предельного содержания эндотоксинов и когда превышает его. В обоих случаях испытуемый образец не выдерживает испытание.
Только при отсутствии образова- ния плотного геля можно сделать вывод, что содержание эндотоксинов ниже предельного содержания эндотоксинов. Для испытуемых образцов в твердом состо- янии предельное содержание эндотоксинов на единицу массы или международную единицу ак- тивности лекарственного средства должно быть преобразовано в содержание бактериальных эндотоксинов на миллилитр испытуемого рас- твора, поскольку данное испытание может быть проведено только в растворе. Лекарственные препараты в жидком состоянии (например, рас- творы для инфузий) обсуждаются ниже, в разде- ле 2.5 данной общей фармакопейной статьи. 2.3. ВЫЧИСЛЕНИЕ ПРЕДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ Для лекарственных препаратов, вводи- мых парентерально, предельное содержание 57 эндотоксинов, определенное на основе дозы, рассчитывают по формуле: ПСЭ = К M где: К — предельная пирогенная доза эндоток- сина на килограмм массы тела; M — максимальная разовая доза лекар- ственного препарата на килограмм массы тела. Если лекарственный препарат вводится с частыми интервалами или инфузионно, вели- чина М соответствует общей максимальной дозе, вводимой в течение 1 ч. Предельное содержание эндотоксинов зави- сит от лекарственного препарата, пути его вве- дения и может быть указано в некоторых част- ных фармакопейных статьях. Значения предельной пирогенной дозы бактериальных эндотоксинов (К) приведены в таблице 2.1.6.21.-1. 2.4. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ПРЕДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ В КОНКРЕТНОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ИЛИ ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ Допустимое предельное содержание эндо- токсинов в субстанции для фармацевтического применения или лекарственном препарате уста- навливают с учетом следующих аспектов. Расчет предельного содержания эндотоксинов Предельное содержание эндотоксинов рас- считывают, как описано в разделе 2.3 данной общей фармакопейной статьи. Показатель опре- деляет границу безопасности, которую нельзя превышать, если лекарственное средство пред- назначено для медицинского применения. Значение предельного содержание эндотоксинов, указанное в частной фармакопейной статье Обычно отражает достижимое в контроли- руемом производственном процессе содержание эндотоксинов в субстанции для фармацевтиче- ского применения или лекарственном препарате. Следовательно, значения предельного содержание эндотоксинов, указанное в частной фармакопей- ной статье, может быть меньше рассчитанного предельного содержания эндотоксинов. Произво- дитель может установить более жесткие требо- вания к предельному содержанию эндотоксинов, чем указанные в частной фармакопейной статье. Возможности производственного процесса Производственный процесс может обеспе- чивать снижение концентрации или удаление бактериальных эндотоксинов и соответственно приводить к более низким значениям предель- ного содержания эндотоксинов. Дополнительные требования безопасности Меры предосторожности принимают с уче- том популяции пациентов (например, использо- Таблица 2.1.6.21.-1.
– Значения предельной пирогенной дозы бактериальных эндотоксинов Путь введения К внутривенный 5,0 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) внутривенный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 2,5 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) интратекальный 0,2 ME/кг (международных единиц эндотоксина на килограмм массы тела) интратекальный, для радиофармацевтических лекарственных препаратов 14 ME/V МЕ/мл (международных единиц эндотоксина на максимальную рекомендуемую дозу (объем)), где V максимальная рекомендуемая доза (объем) парентеральный, для лекарственных препаратов, вводимых в дозе, рассчитываемой на квадратный метр поверхности тела 100 ME/м2 (международных единиц эндотоксина на квадратный метр поверхности тела) Примечание. Одна международная единица (МЕ) эндотоксина соответствует одной единице эндотоксина (ЕЭ). 58 вание в педиатрии, для пациентов с истощением или кахексией и т.д.), конкретных региональных требований (например, использование при расче- тах предельного содержания эндотоксинов более низкой средней массы тела, 60 кг вместо 70 кг) или любые дополнительные меры безопасности, запрошенные уполномоченным органом. Состав При установлении значения предельного со- держания эндотоксинов необходимо учитывать любую теоретическую эндотоксиновую нагруз- ку, вносимую любыми компонентами, исполь- зуемыми для растворения и (или) разведения (например, вода для инъекций) субстанции для фармацевтического применения или лекарствен- ного препарата, или получаемую от исходных материалов и (или) иcходного сырья. 2.5. МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОЕ РАЗВЕДЕНИЕ В данном разделе рассматривают вопросы: какое разведение субстанции для фармацевтиче- ского применения или лекарственного препарата следует использовать в испытании для получения подтверждения, что при отрицательном результате содержание эндотоксинов в испытуемом образце меньше предельного содержания эндотоксинов, а при положительном результате равно или пре- вышает допустимое предельное содержание. Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое содержа- ние эндотоксинов. Оно зависит от предельного содержания эндотоксинов и чувствительно- сти лизата амебоцитов (предела обнаружения). МДР рассчитывают по формуле: МДР = ПСЭ · С λ где: ПСЭ — предельное содержание эндотоксинов; С — концентрация испытуемого раствора; λ — чувствительность лизата амебоцитов в международных единицах в миллилитре. Концентрацию испытуемого раствора выра- жают в единицах: – мг/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в массовых единицах (МЕ/мг); – ЕД/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в пересчете на единицу биоло- гической активности (МЕ/ЕД); – мл/мл, если предельное содержание эндо- токсинов указано в объемных единицах (МЕ/мл). Предел обнаружения (λ) представляет со- бой чувствительность лизата в гель-тромб методе (МЕ/мл), заявленную производите- лем лизата амебоцитов, или самую низкую концентрацию эндотоксинов, определенную по стандартной калибровочной кривой в тур- бидиметрическом или хромогенном методах. Если значение МДР не является целым чис- лом, для рутинных испытаний можно исполь- зовать подходящее целое число, меньшее, чем МДР (приготовление раствора испытуемого образца в меньшем разведении, чем MДР). В та- ком случае, отрицательный результат означает, что содержание бактериальных эндотоксинов ниже допустимого предельного содержания.
Если содержание бактериальных эндотокси- нов в испытуемом образце ниже допустимого предельного содержания эндотоксинов, но до- статочно велико, чтобы вызвать гелеобразова- ние лизатом амебоцитов, то испытание в таких условиях может быть положительным. Следо- вательно, когда в испытании с использовани- ем «рабочего» разведения, кратность которого меньше МДР, получен положительный резуль- тат, испытуемый образец разводят до МДР и по- вторяют испытание. В любом сомнительном или спорном случае необходимо использовать МДР. Данный факт подчеркивает важность подтвержде- ния чувствительности лизата амебоцитов. Пример Необходимо провести испытание рас- твора 50 мг/мл натрия фенитоина (для вну- тривенного введения). Определяют МДР, используя следующие данные: М — максимальная доза для человека 15 мг/кг; С — концентрация испытуемого раствора 50 мг/мл; К — предельная пирогенная доза эндотокси- нов 5 МЕ/кг; λ — предел обнаружения 0,4 МЕ/мл. МДР = 5 · 50 · 1 = 41,67 15 0,4 59 Для рутинных испытаний данного лекар- ственного препарата 1 мл испытуемого раствора разводят до 20 мл (MДР/2 округляют до ближай- шего меньшего целого числа). В случае, если результат испытания будет положительным, то 1 мл испытуемого раствора следует развести до 41,67 мл и повторить испытание. Разведение до 41,67 мл также необходимо, когда испытание проводят в спорных случаях. 3. ОЦЕНКА РИСКА Отсутствие бактериальных эндотоксинов в субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственном препарате, как указано в разделе 1 данной общей фармакопейной статьи, позволяет сделать вывод об отсутствии пироге- нов при условии исключения присутствия пиро- генов неэндотоксиновой природы. Для подтверждения отсутствия неэндотокси- новых пирогенов в субстанциях для фармацевти- ческого применения и (или) лекарственных препа- ратах рекомендуется использовать испытания на пирогенность (2.1.6.2) или на активацию моноцитов (2.1.6.13) при выпуске или в ходе разработки произ- водственного процесса. Если в производственный процесс вносят какие-либо изменения, способные повлиять на качество субстанции для фармацевти- ческого применения и (или) лекарственного пре- парата в отношении пирогенности, испытания вы- бранным методом повторяют. Например, к таким изменениям относят использование другого исход- ного сырья, другой производственной площадки и других параметров процесса. Решение об использовании испытания на бактериальные эндотоксины в качестве един- ственного испытания на пирогенность необ- ходимо принимать после тщательной оценки риска для субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата, содержащих пирогены неэндотоксиновой при- роды. Оценку риска проводят с учетом любого фактора, способного привести к включению пи- рогенов, не обнаруживаемых при испытании на бактериальные эндотоксины. Далее представлен перечень факторов, ко- торые необходимо учитывать при оценке риска. Список не является исчерпывающим, при необ- ходимости может быть дополнен. Производство (химический синтез, фермен- тация, биотехнологический метод). Для продук- тов ферментации учитывают экспрессионную систему: прокариотическая или эукариотическая и, в случае использования прокариотической системы, ‒ грамположительные или грамотри- цательные бактерии. Кроме того, рассматрива- ют компоненты питательных сред с учетом их происхождения (синтетические, животного или растительного происхождения). Бионагрузка.
Должно быть учтено потенци- альное присутствие дрожжевых грибов и грампо- ложительных бактерий в качестве контаминантов активной фармацевтической субстанции, вспо- могательных веществ или исходных материалов и исходного сырья, используемых при производ- стве лекарственного препарата, а также проис- хождение сырья (синтетическое, животного или растительного происхождения). Качество воды также играет важную роль в общей оценке риска. Возможности последующей стадии произ- водственного процесса. Необходимо подтвер- дить, удаляются ли бактериальные эндотоксины на последующих стадиях производственного процесса. Безопасность. При оценке риска необходимо учитывать целевую популяцию и путь введения (например, внутривенно, интратекально и др.). Стабильность обнаружения эндотокси- нов. Следует учитывать, что на возможность обнаружения эндотоксинов оказывают влияние взаимодействие с определенными компонента- ми, условия или время хранения, температура, пробоподготовка испытуемого образца. Должны быть установлены процедуры хранения, пробо- подготовки и смешивания образцов, подтверж- дающие отсутствие влияния на стабильность обнаружения бактериальных эндотоксинов. 4. СТАНДАРТЫ ЭНДОТОКСИНА В качестве стандартного образца может быть использован стандартный образец, с содержа- нием бактериальных эндотоксинов, выражен- ным в международных единицах эндотоксина на упаковку, калиброванный относительно меж- дународного стандартного образца, например, СО ФЕАЭС эндотоксина. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца эндотоксина, устанавливаемую Всемирной организацией здравоохранения. Одна международная единица 60 (МЕ) эндотоксина соответствует одной единице эндотоксина (ЕЭ). 5. ВОДА ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ Вода для испытания на бактериальные эндо- токсины представляет собой стерильную воду, не содержащую эндотоксинов в количествах, определяемых в испытании. Обычно она ком- мерчески доступна и сертифицирована. Для подготовки воды для испытания на бак- териальные эндотоксины помимо тройной ди- стилляции могут быть использованы и другие методы. Приемлемые результаты дает метод об- ратного осмоса, в некоторых случаях предпоч- тительнее проведение процесса дистилляции более трех раз. Независимо от используемого метода, полученная вода не должна содержать поддающиеся обнаружению бактериальные эн- дотоксины. 6. pH СМЕСИ В испытании на бактериальные эндоток- сины оптимальное образование плотного геля происходит при рН (6,0 – 8,0). Следует учиты- вать, что добавление лизата амебоцитов в ис- пытуемый образец может приводить к сниже- нию значения рН. 7. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЗАЯВЛЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИЗАТА АМЕБОЦИТОВ При приготовлении растворов лизата аме- боцитов следуют инструкции производителя. Концентрации эндотоксинов в конечной точке реакции для каждого из разведений в гель-тромб методах А и В преобразуют в логарифмы. Не- обходимость преобразования заключается в том, что построенный график частотного распределе- ния логарифмических значений, обычно гораздо ближе к кривой нормального распределения, чем частотное распределение самих коэффи- циентов разведения; фактически они настолько близки, что допустимо использовать нормаль- ное распределение в качестве математической модели и вычисление доверительного интервала с помощью t-критерия Стьюдента. 8.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ Испытания на присутствие бактериальных эндотоксинов не могут быть проведены без дополнительной подготовки, если: – испытуемый образец не смешивается с реактивами; – рН раствора испытуемого образца нельзя довести до значения 6,0 – 8,0; – испытуемый образец ингибирует или ак- тивирует ферментативную реакцию (например, испытуемый образец содержит β-D-глюканы). Необходимо проводить предварительное испы- тание на наличие мешающих факторов. В случае обнаружения мешающих факторов необходимо доказать эффективность процедуры их удаления и отсутствие влияния процедуры на любые присут- ствующие бактериальные эндотоксины. Целью предварительного испытания явля- ется проверка нулевой гипотезы, что чувстви- тельность лизата амебоцитов в присутствии испытуемого образца не отличается от чувстви- тельности лизата амебоцитов в отсутствие ис- пытуемого образца. В методах А и В нулевую гипотезу принимают, если чувствительность лизата амебоцитов в присутствии испытуемо- го образца составляет не менее 0,5 и не более 2 от чувствительности лизата амебоцитов в отсут- ствие испытуемого образца. В испытаниях на присутствие мешающих факторов методами А и В необходимо ис- пользование испытуемого образца, в котором эндотоксины не обнаруживаются. Это пред- ставляет собой теоретическую проблему при испытании новых лекарственных средств. В связи с этим, для количественных фотоме- трических методов C, D, E и F используют другой подход. Следует обратить внимание, что для проведе- ния испытания методами D и E, в которых исполь- зуют хромогенный пептид, необходимы реактивы, не используемые в методах A, B, C и F. Следо- вательно, соответствие методов A, B, C или F требованиям к мешающим факторам нельзя без экспериментального подтверждения экстра- полировать на метод D или метод E. 61 9. УСТРАНЕНИЕ МЕШАЮЩИХ ФАКТОРОВ Методики устранения мешающих факто- ров не должны приводить к увеличению или уменьшению (например, вследствие адсорбции) количества бактериальных эндотоксинов в ис- пытуемом образце. Корректный способ провер- ки эффективности нейтрализации мешающих факторов состоит в применении метода доба- вок, который представляет собой добавление к испытуемому образцу известного количества бактериальных эндотоксинов с последующим измерением их открываемости. Методы С и D. Если мешающие факторы обусловлены природой субстанции для фарма- цевтического применения или лекарственного препарата и не могут быть устранены общепри- нятыми методами (например, разведением или центрифугированием), возможно построение калибровочной кривой с использованием испы- туемого образца той же субстанции для фарма- цевтического применения или лекарственного препарата, но очищенного от эндотоксинов пу- тем соответствующей обработки или разведе- ния. Испытание на бактериальные эндотоксины проводят путем сравнения с указанной калибро- вочной кривой. Установлено, что в большинстве случаев подходит ультрафильтрация с использовани- ем асимметричных мембранных фильтров из триацетата целлюлозы. Фильтры должны быть надлежащим образом проверены, поскольку при некоторых обстоятельствах производные целлюлозы (β-D-глюканы) могут быть причиной ложноположительных результатов.
Другим вариантом удаления мешающих факторов является двухэтапная процедура, при которой, на первом этапе бактериальные эндо- токсины в испытуемом образце с мешающими факторами фиксируют на твердой фазе (напри- мер, метод предварительного концентрирования с использованием твердофазной экстракции), а на втором – после удаления мешающих факто- ров (например, путем промывки) бактериальные эндотоксины обнаруживают в неизменном виде в подходящих условиях испытания. 10. ЦЕЛЬ ПРОВЕДЕНИЯ КОНТРОЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ Цель проведения контрольных испытаний состоит в проверке активности лизата амебоци- тов в условиях испытаний методами A и B. Выполняют контрольное испытание с раствором стандартного образца эндотоксина в воде для испытания на бактериальные эндоток- сины в концентрации, в два раза превышающем указанную производителем чувствительность лизата амебоцитов. В качестве отрицательного контроля ис- пользуют воду для испытания на бактериальные эндотоксины для подтверждения отсутствия бактериальных эндотоксинов в обнаруживаемой концентрации. Положительный контроль, содержащий ис- пытуемый образец в концентрации, применяе- мой в испытании, предназначен для подтвержде- ния отсутствия мешающих факторов. 11. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Незначительные количества бактериальных эндотоксинов, содержащиеся в воде или в лю- бом другом реактиве или материале, с которыми во время испытания контактирует лизат амебо- цитов, могут не обнаруживаться до тех пор, пока это количество не достигнет предела обнаруже- ния лизата амебоцитов. Даже незначительные количества эндотоксинов могут увеличить их содержание в растворе с испытуемым образцом до значения, несколько превышающего пре- дел обнаружения лизата амебоцитов, и вызвать положительную реакцию. Риск возникновения такого нежелатель- ного явления можно уменьшить путем про- верки воды для испытания на бактериальные эндотоксины, других реактивов и материалов с использованием наиболее чувствительно- го лизата амебоцитов или, по крайней мере, более чувствительного, чем лизат амебоцитов, применяемый при испытании лекарственно- го средства. Даже в этом случае риск такого ложноположительного результата не может быть полностью исключен. 62 12. РЕАЛИЗАЦИЯ МЕТОДОВ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Методы испытаний, приведенные в общих фармакопейных статьях и частных фармако- пейных статьях, валидированы в соответствии с принятой научной практикой и действующими рекомендациями по валидации аналитических методик и являются официальными (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). Сле- довательно, методы, представленные в общих фармакопейных статьях 2.1.6.8. Бактериаль- ные эндотоксины, 2.1.6.13. Испытание на ак- тивацию моноцитов и 2.1.6.12. Испытание на бактериальные эндотоксины с использованием рекомбинантного фактора С не нуждаются в повторной валидации (ревалидации), од- нако требуют подтверждения возможности их использования для конкретной субстанции для фармацевтического применения и (или) лекарственного препарата в конкретных усло- виях испытания. Процедура, а также материалы и реактивы, используемые в методике, должны быть проверены согласно указаниям для соот- ветствующего испытания. Отсутствие мешаю- щих факторов (при необходимости, процедуры их устранения) проверяют на образцах не менее, чем трех производственных серий. Испытание на активацию моноцитов, со- гласно указаниям общей фармакопейной статьи 2.1.6.13. Испытание на активацию моноцитов, в первую очередь, предназначено для замены ис- пытания на пирогенность.
В этой же общей фар- макопейной статье представлены рекомендации по выбору и использованию методов (1, 2 или 3) и валидации испытания. 13. ЗАМЕНА МЕТОДА, ПРЕДПИСАННОГО В ЧАСТНОЙ ФАРМАКОПЕЙНОЙ СТАТЬЕ 13.1. ЗАМЕНА МЕТОДОМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫМ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Замена метода, предписанного в частной фармакопейной статье, на другой метод, пред- ставленный в Фармакопее Союза, необходимо рассматривать как использование альтернатив- ного метода взамен фармакопейного (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). Альтер- нативный метод, представленный в фармакопее не нуждается в повторной валидации, однако необходимо подтверждение возможности его использования для конкретной субстанции для фармацевтического применения или лекарствен- ного препарата в конкретных условиях испыта- ния, а также для подтверждения эквивалентно- сти предписанному методу. 13.2. ЗАМЕНА МЕТОДОМ, НЕ ПРЕДСТАВЛЕННЫМ В ФАРМАКОПЕЕ СОЮЗА Замена метода, предписанного в част- ной фармакопейной статье, методом, не представленным в Фармакопее Союза, необ- ходимо рассматривать как использование аль- тернативного метода взамен фармакопейного (см. раздел 1. Общие сведения Фармакопеи Союза). 63 201080027-2023 2.1.8.27. КОЭФФИЦИЕНТ ПЕНООБРАЗОВАНИЯ (ИНДЕКС ВСПЕНИВАНИЯ) Общая фармакопейная статья предназначена для определения пенообразующей способно- сти лекарственного растительного сырья и др., содержащих сапонины. Для выполнения методики используют 1,0 г испытуемого образца при отсутствии дру- гих указаний в частной фармакопейной статье. ОБОРУДОВАНИЕ Прибор для определения коэффициента пенообразования (см. рисунок 2.1.8.27.-1) обычно состоит из: – штатива с держателем для пипеток; – пипетки класса А вместимостью 50 мл; – стеклянного мерного цилиндра вместимо- стью 250 мл с градуировкой 2 мл и внутренним диаметром (38 ± 3) мм; – резиновой груши для наполнения пипетки. Закрепляют пипетку в штатив с держате- лем так, чтобы наконечник находился в 45 см от основания мерного цилиндра, расположенно- го под ним. Наконечник пипетки выравнивают по центру мерного цилиндра. Перед испытани- ем проверяют правильность установки мерного цилиндра, заполняя его и пипетку водой дис- тиллированной Р так, чтобы вода, вытекающая из пипетки, попадала в центр мерного цилиндра. Отмечают местоположение мерного цилиндра. МЕТОДИКА Приготовление испытуемого раствора. В химический стакан вместимостью 250 мл помещают 1,00 г измельченного испытуемого образца (355) (2.1.1.4). Добавляют 50 мл воды дистиллированной Р и настаивают в течение 30 мин, перемешивая шпателем 3–5 раз для дис- пергирования испытуемого образца, избегая обра- зования пены. Ополаскивают шпатель и внутрен- ние стенки химического стакана дополнительно 50 мл воды дистиллированной Р так, чтобы смыть в воду как можно большее количество испытуемого образца. Продолжают настаивание в течение 30 мин без перемешивания и филь- труют через фильтровальную бумагу диаметром 125 мм. В качестве испытуемого раствора используют фильтрат. Выполнение испытания. Закрепляют пипетку в штативе с держателем, отбирают 50,0 мл испытуемого раствора с помощью пипетки. Оставшийся объем испытуемого рас- твора переносят, избегая образования пены, в мерный цилиндр, стенки которого предва- рительно смочены водой дистиллированной Р. Помещают мерный цилиндр на отмеченное ме- сто под пипеткой. Открывают клапан Е и сли- вают раствор из пипетки в мерный цилиндр. Записывают максимальную высоту пены, пре- жде чем она начнет оседать. Испытание по- вторяют дополнительно два раза, тщательно промывая пипетку и мерный цилиндр водой дис- тиллированной Р между испытаниями. Рисунок 2.1.8.27.-1.
– Прибор для определения коэффи- циента пенообразования А – резиновая груша для наполнения пипетки; Б – пипетка класса А вместимостью 50 мл; В – стеклянный мерный цилиндр вместимостью 250 мл с градуировкой 2 мл и внутренним диаметром (38 ± 3) мм; Г, Д, Е – клапаны груши 2.1.8. МЕТОДЫ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ 64 Результаты испытаний. Коэффициент пенообразования (IF) рассчитывают по формуле: IF = H m где: H — высота образовавшейся пены в сантиметрах; m — масса образца, используемого для приготовления испытуемого раствора, в граммах. Результатом является среднее трех определе- ний. 65 201090030-2023 2.1.9.30. СИТОВОЙ АНАЛИЗ Общая фармакопейная статья распространя- ется на метод определения степени измельчения порошков с помощью ситового анализа. Степень измельчения порошка выражают с учетом номинального размера отверстий сит, применяемых для неаналитических процедур (2.1.1.4, таблица 2.1.1.4.-1), или с применением специальных терминов: крупный, среднекруп- ный, мелкий и очень мелкий порошок (2.1.10.9). Если такие термины не могут быть исполь- зованы, степень измельчения в процентах выра- жают отношением массы порошка, прошедшего через сито определенного номинального разме- ра отверстий, к общей массе порошка. МЕТОДИКА Для определения степени измельчения по- рошков методом просеивания собирают сита так, чтобы сито с более крупным размером от- верстий было верхним, а с более мелким разме- ром отверстий – нижним, и присоединяют к ним собирательную чашку. Порошок просеивают (2.1.10.8), после чего взвешивают каждое сито и определяют массу остатка на нем, а также на собирательной чашке. Для определения суммарного распределения частиц по массе или объему с размером не более x обычно используют величину Q3(x) (2.1.10.9). Степень измельчения порошка, соответствую- щую номинальному размеру отверстий сита, ука- зывают в скобках в частной фармакопейной статье. В случае использования сита одного номи- нального размера отверстий через него должно проходить не менее 97 % массы порошка при отсутствии других указаний в частной фармако- пейной статье. 201090031-2023 2.1.9.31. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ РАСПЫЛЕНИЯ Общая фармакопейная статья определя- ет характеристики лекарственных препаратов для распыления, предназначенных для достав- ки действующих веществ в легкие с помощью небулайзеров. Для определения характеристик используют следующие испытания: – скорость высвобождения действующего вещества и общее содержание высвобождаемого вещества; – аэродинамическая оценка распыляемых аэрозолей. Данные испытания представляют подходы к определению дозы, получаемой пациентом, но не предназначены для оценки качества небу- лайзера. Для определения эффективности лекар- ственного препарата более приемлемым является средневзвешенное распределение частиц по мас- се, чем по количеству. Кроме того, масса действу- ющего вещества как функция аэродинамического диаметра в большей степени отражает их тера- певтическое действие на дыхательные пути. СКОРОСТЬ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА И ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ВЕЩЕСТВА Испытания проводят для определения скорости высвобождения действующего вещества и общего содержания высвобожда- емого вещества, используя стандартные усло- вия волюмометрического измерения скорости потока. Следует отметить, что небулайзеры с усилением дыхания или активируемые ды- ханием, оцениваются с помощью симулятора дыхания, так как выход лекарственного препа- рата из устройства значительно зависит от ско- рости вдыхаемого потока. Приведенная ниже методика основана на применении стандартной 2.1.9.
ФАРМАЦЕВТИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ 66 модели дыхания для взрослых. Если лекар- ственный препарат для распыления показан для применения только в педиатрии (новорожден- ные, младенцы и дети), должна использоваться модель дыхания для ребенка. Для проведения подходящего измерения массы высвобождае- мого вещества использование моделей дыхания является более предпочтительным, чем испы- тания при скорости непрерывного потока. Ско- рость высвобождения действующего вещества и общее содержание высвобождаемого веще- ства являются наиболее подходящими характе- ристиками для оценки высвобождаемой массы стандартным способом независимо от типа не- булайзера. Соответственно, приведенная ниже методика испытания позволит измерить мас- су действующего вещества, высвобождаемого в первом периоде времени, обычно составля- ющем 1 мин (оценка скорости высвобождения действующего вещества), а также общую массу высвобождаемого вещества. ОБОРУДОВАНИЕ Симулятор дыхания. Для испытания используют коммерчески доступный симулятор дыхания, способный воспроизводить определен- ную модель дыхания, технические характери- стики которого приводятся в таблице 2.1.9.31.-1. Модель дыхания взрослого человека применяют за исключением случаев, когда лекарственный препарат предназначен только для педиатрии. Тогда используют альтернативную модель дыха- ния, как указано в таблице 2.1.9.31.-1. Система фильтров. Для испытания ис- пользуют подходящий валидированный фильтр с низким сопротивлением, обеспечивающий ко- личественный сбор аэрозоля и полноту извле- чения действующего вещества соответствую- щим растворителем. Пустой (не используемый) объем корпуса фильтра не должен превышать 10 % дыхательного объема симулятора дыхания. МЕТОДИКА Фильтр вдоха (А), входящий в состав держа- теля фильтра, присоединяют к симулятору ды- хания (Б) в соответствии с рисунком 2.1.9.31.-1. Наполняют распылитель небулайзера (В) лекар- ственным препаратом в необходимом объеме в соответствии с инструкцией по применению. При необходимости, присоединяют мундштук распылителя к фильтру вдоха с помощью адап- тера мундштука, обеспечивая герметичность соединения. Необходимо удостовериться, что распылитель ориентирован надлежащим для использования образом, для этого может потребоваться изменение наклона симулятора дыхания и держателя фильтра. Симулятор дыха- ния настраивают для получения определенной модели дыхания. Рисунок 2.1.9.31.-1. – Установка для испытания с симу- лятором дыхания A – фильтр вдоха и держатель фильтра; Б – симулятор дыхания; В – распылитель Вначале запускают симулятор дыхания, затем, в начале ингаляционного цикла, – небу- лайзер, который функционирует в течение опре- деленного периода времени. Выбранное время, обычно (60 ± 1) с, должно обеспечить накопле- ние действующего вещества на фильтре вдоха, Таблица 2.1.9.31.-1. – Технические характеристики симулятора дыхания (форма волны синусоидальная) Показатель Технические характеристики взрослый новорожденный младенец ребенок дыхательный объем (мл) 500 25 50 155 частота (цикл/мин) 15 40 30 25 отношение вдох:выдох 1:1 1:3 1:3 1:2 67 достаточное для определения его содержания. Если количество действующего вещества, на- копленное на фильтре вдоха в течение 60 с, недостаточно для проведения испытания, про- должительность промежутка времени для сбора аэрозоля можно увеличить. Если фильтр пропи- тывается лекарственным препаратом, указанное время можно уменьшить. Во избежание пропи- тываемости фильтра при необходимости распы- ление прерывают и заменяют фильтр.
Новый фильтр и держатель фильтра помещают в рабо- чее положение и продолжают процесс до оста- новки распыления. По завершению выбранного периода времени останавливают небулайзер. РЕЗУЛЬТАТЫ С помощью подходящего метода испыта- ния определяют массу действующего вещества, накопленного на фильтре вдоха и держателе фильтра в течение каждого промежутка вре- мени. Определяют скорость высвобождения действующего вещества путем деления массы действующего вещества, накопленного на пер- вом фильтре вдоха, на время сбора. Определяют общую массу высвобождаемого действующего вещества, суммируя массу действующего веще- ства, накопленного на всех фильтрах и держате- лях фильтра. АЭРОДИНАМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РАСПЫЛЯЕМЫХ АЭРОЗОЛЕЙ Размер частиц (капель) лекарственных пре- паратов для распыления определяют при более низких скоростях потока, чем обычно исполь- зуются для порошковых ингаляторов и дозиру- ющих ингаляторов. Как правило, рекомендуют использовать скорость потока 15 л/мин, так как указанное значение приближено к средней ско- рости дыхания здорового взрослого человека (дыхательный объем 500 мл). Хотя лазерные приборы рассеяния света под малым углом (лазерная дифрактометрия) могут обеспечить быстрое измерение распределения по размеру частиц аэрозолей, образуемых небулайзером, указанные способы не обнаруживают действу- ющее вещество; в большей степени они изме- ряют частицы (капли) по размеру независимо от их состава. Изложенное выше применимо для гомогенных растворов, но может приводить к существенным ошибкам, если лекарственный препарат для распыления представляет собой суспензию или если происходит значительное испарение капель, как в определенных типах небулайзеров. Каскадные импакторы позволя- ют однозначно охарактеризовать аэрозоли по массе действующего вещества как функции аэродинамического диаметра. Кроме метода каскадной импакции, может применяться диф- ракция лазерного излучения при условии ва- лидации методики. Для проведения испытания используют каскадный импактор (см. раздел Прибор данной общей фармакопейной статьи), откалиброванный на скорость потока 15 л/мин. Для небулайзеров определение баланса масс способом, аналогичным для порошковых инга- ляторов и дозирующих ингаляторов, не прием- лемо, так как доза фиксируется при непрерыв- ном выходе лекарственного препарата. Опыты по количественному извлечению действующе- го вещества должны выполняться как часть разработки методики с целью ее валидации. В процессе измерения размера частиц (капель) важно контролировать испарение образуемых капель в небулайзерах для предотвращения ошибок. Испарение можно минимизировать, охла- див импактор до температуры около 5 °С, по- местив его в холодильник примерно на 90 мин. Вследствие высокого риска коррозии, вызывае- мой конденсацией солесодержащих капель при охлаждении импактора, прибор должен быть полностью очищен, включая межкаскадные ка- налы, после каждого дня использования. После каждого испытания рекомендуется высушивать все поверхности прибора, например, сжатым воздухом. Не следует сушить сжатым воздухом коллектор с микроотверстиями. ПРИБОР Подробное описание прибора, представляю- щего собой каскадный ступенчатый импактор, оснащенный коллектором с микроотверстиями (импактор нового поколения), и индукционно- го порта представлено в соответствующей об- щей фармакопейной статье и включает инфор- мацию о критических размерах и особенностях квалификации импактора (измерение уровня).
Для обеспечения полного количественного из- влечения действующего вещества из распылен- ного аэрозоля при заданной скорости потока в 15 л/мин в добавление к коллектору с микро- 68 отверстиями используют резервный фильтр. Фильтр размещают ниже микроотверстий (оп- ция внутреннего фильтра) или используют в дер- жателе вне импактора для улавливания любых мелких капель, прошедших последний уровень фракционирования по размеру. Для испытания аэрозолей, образуемых небулайзером, пресепа- ратор не применяют. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК Перегрузка импактора. При разработке и валидации методики важно подтвердить, что объем распыляемой жидкости, отобранной из небулайзера, не перегружает импактор. Визу- альный осмотр поверхностей сбора на уровнях, собирающих наибольшее количество капель, может выявить полосы, если произошла пере- грузка. Данное явление может быть связано и с увеличением массы действующего вещества, собранного на последнем уровне и резервном фильтре. Наиболее эффективным способом из- бежать перегрузки для любой системы является уменьшение времени распыления испытуемого образца (Т0) путем уравновешивания перегрузки и аналитической чувствительности. Обратный захват. Отскок и обратный за- хват капель в систему является маловероятным для капель, образующихся в небулайзере в отли- чие от твердых частиц в ингаляторе. Вследствие этого допускается не закрывать импактор. МЕТОДИКА Собранный импактор и индукционный порт предварительно охлаждают в холодильнике (при температуре около 5 °C) в течение 90 мин и начинают испытание в течение 5 мин после из- влечения импактора из холодильника. Допускает- ся применение других методик для поддержания постоянной температуры импактора (например, холодильный шкаф или холодовая комната) после их валидации. Небулайзер соединяют с регуля- тором подачи газа (обычно воздух или кислород) или используют компрессор при давлении и ско- рости потока, указанных производителем устрой- ства. Принимают меры предосторожности для обеспечения того, чтобы линия подачи газа не от- соединялась от небулайзера под давлением. В не- булайзерпомещаютлекарственныйпрепаратвнеоб- ходимом количестве в соответствии с инструкцией по применению. Импактор достают из холодиль- ника, присоединяют к нему индукционный порт, подключают к выходному отверстию импактора или наружного фильтра источник вакуума, спо- собный откачивать воздух из системы со скоро- стью 15 л/мин, как указано на рисунке 2.1.9.31.- 2. Пропускают поток через импактор. К порту Рисунок 2.1.9.31.-2. – Схема использования импактора нового поколения для определения размера частиц лекарственных препаратов для распыления A – небулайзер (распылитель); Б – порт индукции; В – импактор нового поколения; Г – контрольный клапан; Д – источник вакуума 69 индукции подсоединяют измеритель потока, откалиброванный для измерения выходящего по- тока. Регулируют контрольный клапан, располо- женный между импактором и источником вакуу- ма, для обеспечения постоянного потока через систему со скоростью 15 л/мин (± 5 %). Отсоеди- няют измеритель потока. Удостоверяются, что не- булайзер располагается в таком же положении, что и при использовании его пациентом. Затем присо- единяют мундштук небулайзера к индукционно- му порту, используя при необходимости адаптер мундштука для обеспечения герметичности сое- динения. Включают подачу газа или компрессор небулайзера и производят отбор проб в течение предварительно установленного времени (T0). Зна- чение T0 должно использоваться в аналитической методике на данный лекарственный препарат для сопоставимости показателей массы фракций.
По- сле отбора проб выключают подачу газа или ком- прессор, отсоединяют небулайзер от индукцион- ного порта и отключают источник вакуума. Отсоединяют импактор и с помощью под- ходящего метода анализа определяют массу действующего вещества, собранного в индук- ционном порте, на каждом из уровней и ре- зервном/наружном фильтре в соответствии с описанием импактора нового поколения. Массу действующего вещества, собранную в коллекторе с микроотверстиями, суммируют с массой, со- бранной на резервном/наружном фильтре, и да- лее обрабатывают как единый образец для по- следующих расчетов. Массовую долю фракции (Fm) действующего вещества, собранного на каждой составной части импактора, начиная с индукционного порта и других расположенных в нем по порядку элементов, рассчитывают по формуле: Fm = m M где: m — масса действующего вещества, собранная на каждой составной части импактора; М — общая масса действующего вещества, собранная в системе. Величину Fm представляют в виде диаграм- мы ее значений, соответствующих составным частям измерительного оборудования, начиная от индукционного порта и заканчивая резерв- ным фильтром импактора (рисунок 2.1.9.31.-3). Рисунок 2.1.9.31.-3. – Диаграмма распределения значений массовой доли капель, соответствующих составным частям импактора 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Fm 70 При необходимости допускается объединение значений Fm соседних уровней импактора для представления массовой доли фракции дей- ствующего вещества, собранного на нескольких уровнях, в виде одного значения. Определяют кумулятивное средневзвешен- ное распределение частиц аэрозоля по массе, фракционированных в соответствии с разме- ром с помощью импактора нового поколения. Начиная с фильтра распределяют кумулятив- ную массу фракции действующего вещества в зависимости от эффективного предельного диа- метра частиц фракции соответствующего уров- ня (таблица 2.1.9.31.-2 подходящих диаметров частиц фракции при скорости потока 15 л/мин). Строят график зависимости кумулятивной фракции действующего вещества от эффектив- ного предельного диаметра частиц фракции в подходящем формате, например, логарифми- ческом или пробит-анализа. При необходимости с помощью интерполяции определяют значения массовой доли фракции с диаметром частиц ниже указанного в таблице 2.1.9.31.-2 значения или фракцию с размером частиц между верхним и нижним пределами.При необходимости опре- деляют значения медианной массы аэродинами- ческого диаметра и геометрического стандарт- ного отклонения, если приемлемо. Таблица 2.1.9.31.-2. – Диаметры частиц фракции импактора нового поколения при скорости потока 15 л/мин Уровень Диаметр частиц фракции (мкм) 1 14,1 2 8,61 3 5,39 4 3,30 5 2,08 6 1,36 7 0,98 71 2.1.11. АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 201110001-2023 2.1.11.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕИНА С ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведены примеры методик количественного определения протеина С человека (протеин C) хромогенным методом в конечной точке (метод 1) и клоттинго- вым методом (метод 2). МЕТОД 1. ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД Протеин С представляет собой витамин K-зависимый плазменный белок, который по- сле активации (активированный протеин С (activated protein C, APC)) подавляет свертыва- ние крови путем протеолитического расщепле- ния факторов Va и VIIIa.
Активность протеина С определяют с помощью двухстадийного метода: – на первой стадии протеин С в образце ак- тивируют специфическим активатором, выде- ленным из яда змеи; – на второй стадии активированный протеин С расщепляет специфический хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта (хромофо- ра), который может быть количественно определен методом спектрофотометрии. Стадия 1 Стадия 2 Количественное определение протеина С основано на его способности расщеплять хро- могенный субстрат с образованием окрашен- ного продукта и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Для количественного определения про- теина С применяют как метод определения в ко- нечной точке, так и кинетический метод. Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придержи- ваться инструкции производителя набора. РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с рH 8,4. Растворяют 6,055 г трис(гидроксиметил)амино- метана Р и 16,84 г цезия хлорида Р в воде Р, при необходимости корректируют pH раствора (2.1.2.3) и доводят водой Р до объема 1000,0 мл. Активатор протеина С. Белок, специфично активирующий протеин С, выделяют из яда гадю- ки Agkistrodon contortrix contortrix. Восстанавли- вают и хранят в соответствии с инструкцией про- изводителя. Перед использованием в испытании разводят водой Р до концентрации 0,25 ЕД/мл. Хромогенный субстрат для активирован- ного протеина С. Специфический хромоген- ный субстрат для APC, например, L-пироглу- тамил-L-пролил-L-аргинин-паранитроанилина гидрохлорид (пироGlu-Pro-Arg-pNA·HCl), рас- творяют в воде Р и доводят водой Р до получения концентрации 4,5 ммоль/л. Перед использовани- ем разводят буферным раствором для разведе- ния с pH 8,4 до концентрации 1,1 ммоль/л. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят с использовани- ем воды Р не менее трех отдельных разведений до концентраций в диапазоне 0,050 – 0,200 МЕ/мл в двух повторностях. Аналогичным образом го- товят разведения восстановленного стандартно- го образца. 72 Стадия 1. Смешивают по 0,025 мл каждо- го разведения с 0,050 мл активатора протеи- на С, предварительно нагретых до температуры 37 °C, и инкубируют при той же температуре точно 10 мин. Для каждого разведения прово- дят контрольный опыт, используя воду Р вместо активатора протеина С. Стадия 2. К каждой смеси прибавляют по 0,150 мл разбавленного хромогенного суб- страта, предварительно нагретого до темпера- туры 37 °C, и инкубируют при той же темпера- туре точно 10 мин. При необходимости время инкубации должно быть скорректировано таким образом, чтобы получить линейную зависи- мость образования хромофора от времени. Оста- навливают реакцию добавлением 0,050 мл 50 % (об/об) раствора уксусной кислоты ледяной Р. При расщеплении хромогенного субстра- та под действием APC образуется окрашенный продукт в количестве, пропорциональном кон- центрации протеина С в образце. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм (2.1.2.24). Значение оптической плотности кон- трольного опыта вычитают из значения оптиче- ской плотности испытуемого образца.
Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина С в испытуемом образце с использованием об- щепринятых статистических методов (2.3.12.0). МЕТОД 2. КЛОТТИНГОВЫЙ МЕТОД Активность протеина С устанавливают после расщепления его до APC специфиче- ским активатором, выделенным из яда гадюки Agkistrodon contortrix contortrix. Полученный APC инактивирует факторы Va и VIIIa и таким образом удлиняет активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) системы, в которой присутствуют все факторы свер- тывания на постоянном избыточном уровне, за исключением протеина С, поступающего в систему с добавляемым образцом. Увеличение времени свертывания пропорционально концен- трации протеина С в образце. Количественное определение протеина С, основано на его способности увеличивать вре- мя свертывания и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придержи- ваться инструкции производителя набора. РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с pH 7,4. Изотонический буферный раствор, не содержа- щий хелатирующих соединений. Плазма крови человека, дефицитная по про- теину С. Цитратная плазма крови человека, содержащая протеин С ниже определяемого уров- ня. Восстанавливают и хранят в соответствии с инструкцией производителя. Активатор протеина С. Белок, специфич- но активирующий протеин С, выделяют из яда гадюки Agkistrodon contortrix contortrix. Восста- навливают и хранят в соответствии с инструкци- ей производителя. Активатор свертывания. Используют подходящий реактив для АЧТВ, содержащий фосфолипиды и контактный активатор. Акти- ватор свертывания может быть комбинирован с активатором протеина С. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят с использовани- ем воды Р не менее трех отдельных разведенийдо концентраций в диапазоне 0,010 – 0,150 МЕ/мл в двух повторностях с использованием бу- ферного раствора для разведения с pH 7,4. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца. Смешивают один объем каждого раз- ведения с одним объемом плазмы кро- ви человека, дефицитной по протеину С, и одним объемом активатора протеина С (объ- единенного с реагентом для АЧТВ). Все рас- творы должны быть предварительно нагреты до температуры 37 °C. Прибавляют один объ- ем раствора 3,7 г/л кальция хлорида Р, пред- варительно нагретого до температуры 37 °C, и регистрируют время свертывания. 73 Время свертывания пропорционально концен- трации протеина С в каждом разведении. Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность проте- ина С в испытуемом образце с использованием общепринятых статистических методов (2.3.12.0). 201110002-2023 2.1.11.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕИНА S ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведен пример методики количественного определения протеина S человека (протеин S) клоттинговым методом. Протеин S представляет собой витамин K-зависимый белок плазмы, который действу- ет как кофактор активированного протеина С человека (активированный протеин С (activated protein C, APC)).
Активность протеина S может быть определена по реакции свертывания кро- ви, которая чувствительна к способности про- теина S ускорять инактивацию фактора свер- тывания крови человека Va (фактор Va) под действием APC. Испытание заключается в при- бавлении протеина S к смеси реактивов, содер- жащей APC, фактор Va и плазму крови чело- века, дефицитную по протеину S. Увеличение времени свертывания пропорционально кон- центрации протеина S в образце. Методики, в которых APC добавляется непосредственно как реактив, более предпочтительны по срав- нению с теми, в которых APC генерируется во время проведения испытания путем добавле- ния специфического активатора протеина С, выделенного из яда змеи. Активация сверты- вания инициируется добавлением активирую- щего реактива, такого как тромбопластин или активированный фактор свертывания крови человека X (фактор Ха), вместе с фосфолипи- дами и кальция хлоридом. Во время испытания фактор Va генерируется из фактора V в плазме крови человека, дефицитной по протеину S, с последующей активацией свертывания. Про- цедура испытания должна обеспечивать, чтобы единственным фактором, ограничивающим ре- акцию свертывания, являлся протеин S. Количественное определение протеина S основано на его способности увеличивать вре- мя свертывания, и оценивается путем сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина S, выраженной в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества между- народного стандартного образца протеина S человека, устанавливаемую Всемирной органи- зацией здравоохранения. Реактивы для испытания могут быть приоб- ретены по отдельности или в виде коммерческих наборов. Методики и реактивы могут отличать- ся в разных наборах, поэтому следует придер- живаться инструкции производителя набора. КЛОТТИНГОВЫЙ МЕТОД РЕАКТИВЫ Буферный раствор для разведения с рH 7,4. Изотонический буфер, не содержащий хелатиру- ющих соединений, приготовленный следующим образом: растворяют 6,08 г трис(гидроксиме- тил)аминометана Р и 8,77 г натрия хлорида Р в воде Р и при необходимости корректируют pH раствора (2.1.2.3); далее прибавляют 10 г альбумина бычьего Р или альбумина человека Р и доводят водой Р до объема 1000,0 мл. Плазма крови человека, дефицитная по протеину S. Цитратная плазма крови человека с содержанием протеина S ниже определяемо- го уровня и, предпочтительно, не содержащая C4b-связывающего белка. Активатор коагуляции. Реактив применя- ют для инициации свертывания плазмы крови человека, дефицитной по протеину S, а также для обеспечения образования фактора Vа. Акти- ватор может состоять из тканевого фактора, фак- тора Xа или агента, способного прямо активиро- вать фактор X. Такой агент может быть выделен из яда гадюки Рассела (Vipera russelli). Реактив также содержит APC, фосфолипиды и каль- ция хлорид Р, или кальция хлорид может быть добавлен отдельно после определенного перио- да активации. МЕТОДИКА Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по меди- цинскому применению. Готовят не менее трех отдельных разведений до получения концен- траций в диапазоне 0,020 – 0,100 МЕ/мл в двух 74 повторностях с использованием буферного рас- твора для разведения с рН 7,4. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца. Смешивают по одному объему каждого раз- ведения с одним объемом плазмы крови чело- века, дефицитной по протеину S. Все растворы должны быть предварительно нагреты до темпе- ратуры 37 °C.
Прибавляют два объема активато- ра коагуляции, нагретого до температуры 37 °C, и регистрируют время свертывания. Альтернативная процедура может предусма- тривать использование активатора коагуляции без кальция хлорида и требовать точного изме- рения периода активации перед добавлением кальция хлорида и регистрации времени свер- тывания. Время свертывания пропорционально кон- центрации протеина S в каждом разведении. Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина S в испытуемом образце с использованием об- щепринятых статистических методов (2.3.12.0). 201110003-2023 2.1.11.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРА α-1-ПРОТЕИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА В общей фармакопейной статье приведена методика количественного определения инги- битора α-1-протеиназы человека (ингибитор α-1-протеиназы), известного также как α-1-анти- трипсин или α-1-антипротеиназа, хромогенным методом. Методика основана на сравнении испытуемо- го образца со стандартным образцом ингибитора α-1-протеиназы человека, калиброванного в мил- лиграммах активного (функционального) инги- битора α-1-протеиназы, по способности инакти- вировать сериновую протеазу – эластазу (свиную панкреатическуюэластазуилиэластазунейтрофилов человека). Различные количества образца, смешива- ют с заданным количеством эластазы, остаточную активность эластазы измеряют с использованием подходящего хромогенного субстрата. ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД РЕАКТИВЫ Трис-альбуминовый буферный раствор. Растворяют 24,23 г трис(гидроксиметил)ами- нометана Р в воде Р, доводят рН раствора до значения 8,0 ± 0,3 (2.1.2.3), используя хлоро- водородную кислоту Р1, и доводят водой Р до объема 1000 мл. К 100 мл полученного рас- твора прибавляют 0,5 мл 20 % раствора альбу- мина человека Р или альбумина бычьего Р. Буферный раствор, содержащий альбумин человека или альбумин бычий, должен быть приготовлен в день его использования; в про- тивном случае, раствор стерилизуют фильтра- цией (0,2 мкм) и хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение двух недель. МЕТОДИКА Готовят в двух повторностях четыре или пять разведений испытуемого образца и стан- дартного образца в подходящем диапазоне кон- центраций ингибитора α-1-протеиназы, исполь- зуя трис-альбуминовый буферный раствор. В лунки микропланшета помещают по 50 мкл разведений стандартного образца или разведений испытуемого образца, затем в ка- ждую лунку прибавляют по 150 мкл раствора свиной панкреатической эластазы (эластаза), разведенной до необходимой концентрации трис-альбуминовым буферным раствором. Ин- кубируют в течение определенного промежутка времени (3 – 10 мин) при температуре от 15 °C до 25 °C. Поскольку активность различных элас- таз может варьировать, для получения подходя- щих изменений оптической плотности при дли- не волны 405 нм в данных конкретных условиях проведения испытания, концентрация эластазы может быть уточнена путем оценки активности в контрольных лунках, содержащих эластазу без ингибитора α-1-протеиназы. В каждую лунку прибавляют по 100 мкл ра- бочего раствора хромогенного субстрата N-сук- цинил-три-L-аланил-4-п-нитроанилида (Suc-Ala- Ala-Ala-pNA) (раствор 4,5 мг/мл хромогенного субстрата в диметилсульфоксиде Р, разведен- ный трис-альбуминовым буферным раствором до рабочей концентрации 0,45 мг/мл). Измерение оптической плотности (2.1.2.24) начинают сразу 75 же и проводят в течение 5 мин и более при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр ми- кропланшетный. Рассчитывают скорость измене- ния оптической плотности (ΔА/мин).
В качестве альтернативы можно использо- вать метод определения в конечной точке, оста- навливая реакцию уксусной кислотой и измеряя оптическую плотность при длине волны 405 нм. Если испытание выполняют в пробирках и для измерения оптической плотности используют спектрофотометр, пропорционально изменяют объемы растворов реактивов. Скорость изменения оптической плотности (ΔА/мин) обратно пропорциональна активности ингибитора α-1-протеиназы. Проверяют достоверность результатов ис- пытания и рассчитывают активность ингиби- тора α-1-протеиназы в испытуемом образце общепринятыми статистическими методами (2.3.12.0). 201110004-2023 2.1.11.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИ-D ЧЕЛОВЕКА Общая фармакопейная статья распростра- няется на методы количественного определения иммуноглобулина анти-D человека (иммуногло- булина анти-D) в лекарственных препаратах им- муноглобулинов человека. МЕТОД 1 Активность иммуноглобулина анти-D определяют путем сравнения количества ис- пытуемого образца, необходимого для аг- глютинации D-положительных эритроцитов, с необходимым для получения такого же эф- фекта количеством стандартного образца, активность которого выражена в международ- ных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобули- на анти-D, устанавливаемую Всемирной орга- низацией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Используют пулы D-положительных эри- троцитов не менее чем от четырех доноров с группой крови 0R1R1, собранные не ранее чем за семь суток до испытания и хранившиеся соответствующим образом. К подходящему объему клеток, предварительно трижды про- мытых раствором 9 г/л натрия хлорида Р, прибавляют равный объем раствора броме- лайнов Р, выдерживают при температуре 37 °С в течение 10 мин. Далее центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость, промыва- ют трижды раствором 9 г/л натрия хлорида Р. Суспендируют 20 объемов эритроцитов в смеси из 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора 300 г/л альбумина бычьего Р и 45 объ- емов раствора 9 г/л натрия хлорида Р. Полу- ченную суспензию охлаждают на ледяной бане при постоянном перемешивании. Готовят подходящие разведения испытуемо- го образца и стандартного образца (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D челове- ка), используя в качестве разбавителя раствор, содержащий 5 г/л альбумина бычьего Р и 9 г/л натрия хлорида Р. Определение обычно проводят по изложен- ной ниже методике, используя соответствую- щий прибор для непрерывного автоматического анализа. МЕТОДИКА Температуру в трубках, за исключением ин- кубационных петель, поддерживают на уровне 15,0 °С. В трубки аппарата, используя насос, подают суспензию эритроцитов со скоростью 0,1 мл/мин и раствор 3 г/л метилцеллюлозы 450 Р со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 мин со скоростью 0,1 мл/мин вводят растворы испы- туемого и стандартного образцов в соответству- ющих разведениях. Перед введением каждого следующего раствора в течение 4 мин вводят разбавитель со скоростью 0,1 мл/мин. Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инку- бируют при температуре 37 °С в течение 18 мин, после чего разбивают скопления эритроцитов пу- тем введения со скоростью 1,6 мл/мин раствора 9 г/л натрия хлорида Р, содержащего для предот- вращения разрушения агрегированных эритроци- тов подходящий смачивающий агент (например, по- лисорбат 20 Р до получения концентрации 0,2 г/л). 76 После оседания агглютинатов образовавшуюся су- спензию дважды декантируют: вначале – со скоро- стью 0,4 мл/мин, затем – со скоростью 0,6 мл/мин.
Не подвергшиеся агглютинации эритроциты лизируют раствором, содержащим 5 г/л окток- синола 10 Р, 0,2 г/л калия феррицианида Р, 1 г/л натрия гидрокарбоната Р и 0,05 г/л калия ци- анида Р, подаваемым со скоростью 2,5 мл/мин. В течении десяти минут обеспечивают условия, необходимые для выхода гемоглобина. Оптиче- скую плотность (2.1.2.24) гемолизата регистри- руют непрерывно при длине волны от 540 нм до 550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, в котором наблюдается линейная за- висимость между концентрацией и получен- ным изменением оптической плотности (ΔА). Исходя из полученных результатов, строят кали- бровочную кривую, линейный участок которой используют для расчета активности испытуемого образца. Активность испытуемого образца рассчиты- вают с использованием общепринятых стати- стических методов (2.3.12.0). МЕТОД 2 Активность иммуноглобулина анти-D опре- деляют методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, проводимого на ти- трационных микропланшетах, покрытых эритро- цитами человека. Метод основан на конкурентном связывании поликлональным иммуноглобулином анти-D и биотинилированными моноклональны- ми анти-D антителами, специфичными в отноше- нии эпитопа D антигена, с эритроцитами человека. Активность испытуемого образца сравнивают со стандартным образцом, активность которого вы- ражена в международных единицах. За международную единицу принимают ак- тивность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобулина анти-D, устанавливаемую Всемирной организа- цией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Реактивы, при отсутствии особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хло- рида Р, 0,76 г динатрия гидрофосфата безвод- ного Р, 0,2 г калия хлорида Р, 0,2 г калия диги- дрофосфата Р и 0,2 г натрия азида Р и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем. Трис-солевой буферный раствор (ТСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хлорида Р и 0,6 г трис(гидроксиметил)аминометана Р, кор- ректируют рН (2.1.2.3) раствором 103 г/л хлоро- водородной кислоты Р до значения 7,2 и дово- дят водой Р до объема 1000 мл. Раствор папаина. При температуре 37 °С перемешивают в течение 30 мин 1 г папаина Р в 10 мл 0,067 М фосфатного буферного рас- твора с рН 5,4 Р, центрифугируют при 10 000 g в течение 5 мин и фильтруют полученный рас- твор через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл филь- трата, 1 мл раствора 48,44 г/л L-цистеина Р и 1 мл раствора 3,72 г/л натрия эдетата Р и до- водят 0,067 М фосфатным буферным раство- ром с рН 5,4 Р до объема 10 мл. Аликвоты за- мораживают при температуре −20 °С или ниже. Эритроциты. Пул D-положительных эри- троцитов получают не менее чем от трех доно- ров с группой крови 0R2R2. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 мин, надосадочную жидкость уда- ляют, подходящий объем осадка эритроцитов нагревают и смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (на- пример, в объемном соотношении 2:1) и инку- бируют при температуре 37 °С в течение 10 мин. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Хранят при температуре 4 °C с подходящим стабилиза- тором не более недели. Биотинилированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкцией производителя. Авидин, конъюгированный со щелочной фос- фатазой, или стрептавидин, конъюгированный со щелочной фосфатазой. Предпочтительно ис- пользовать модифицированный реактив, соче- тающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания.
Используют в соответствии с инструкциями производителя. Раствор субстрата. Используют пара-ни- трофенилфосфат в соответствии с инструкцией производителя. Буферный раствор для фиксации клеток. Растворяют в воде Р 18,02 г глюкозы Р, 4,09 г натрия хлорида Р, 1,24 г борной кислоты Р, 10,29 г натрия цитрата Р и 0,74 г натрия эде- тата Р. Корректируют рН (2.1.2.3) до значения 7,2 – 7,3, используя раствор 40 г/л натрия ги- дроксида Р или раствор 103 г/л хлороводород- 77 ной кислоты Р, и доводят водой Р до объема 1000 мл. Хранят при температуре 4 °С и ис- пользуют холодным. Раствор глутарового альдегида. Непосред- ственно перед применением 750 мкл раствора 250 г/л глутарового альдегида Р прибавляют к 50 мл холодного ФСБ. Титрационные микропланшеты. Плоско- донные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуно- ферментного анализа, с высокой связывающей способностью по отношению к белкам исполь- зуют для покрытия эритроцитами. Планшеты из полистирола или поливинилхлорида с кру- глой или конусообразной формами лунок ис- пользуют для приготовления разведений раство- ров иммуноглобулина. МЕТОДИКА Готовят 0,1 % (об/об) суспензию обработан- ных папаином эритроцитов в холодном буфер- ном растворе для фиксации клеток. В каждую лунку плоскодонного титрационного микро- планшета помещают по 50 мкл суспензии. Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 мин предпочтительно при темпера- туре 4 °С. Не удаляя надосадочную жидкость, к содержимому каждой из лунок осторожно прибавляют по 100 мкл раствора глутарово- го альдегида и выдерживают 10 мин. Содер- жимое лунок сливают путем быстрого пере- ворачивания планшета и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ФСБ. Эту про- цедуру производят вручную или с использо- ванием автоматического устройства для про- мывания планшетов. После удаления ФСБ планшет используют в испытании или хранят при температуре 4 °С не более 1 месяца по- сле прибавления в каждую лунку по 100 мкл буферного раствора для фиксации клеток и за- печатывания полимерной пленкой. Испытуемые растворы. В случае лиофиль- но высушенных лекарственных препаратов их восстанавливают в соответствии с инструкцией по медицинскому применению. Готовят пять по- следовательных двукратных разведений, начи- ная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р в четырех повторностях. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости «доза – ответ». Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС им- муноглобулина анти-D человека) в соответствии с указаниями производителя. Готовят пять по- следовательных двукратных разведений, начи- ная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р, в четырех повторностях. В каждую серию лунок титрационного ми- кропланшета с круглой или конусообразной формами лунок вносят по 35 мкл соответствую- щего разведения испытуемого раствора или рас- твора сравнения. К содержимому каждой лун- ки прибавляют по 35 мкл биотинилированного Brad-5 в концентрации 250 нг/мл. Осушают лунки планшета, покрытого эри- троцитами, путем переворачивания и высу- шивания бумажным полотенцем. Прибавляют в каждую лунку по 250 мкл ФСБ, содержащего 20 г/л альбумина бычьего Р, и выдерживают при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 30 мин.
Осушают лунки планшета, покрытого эри- троцитами, путем переворачивания и высуши- вания бумажным полотенцем, и помещают в ка- ждую серию лунок по 50 мкл соответствующего испытуемого раствора или раствора сравнения, содержащих биотинилированный Brad-5. В качестве отрицательного контроля исполь- зуют 50 мкл ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего Р. Планшет запечатывают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °C до 25 °C в течение 1 ч. Удаляют жидкость из лунок планшета, по- крытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ТСБ. В каждую лунку прибавляют по 50 мкл авиди- на, конъюгированного со щелочной фосфатазой, или стрептавидина, конъюгированного со щелоч- ной фосфатазой, разбавленного ТСБ, содержащим 10 г/л альбумина бычьего Р. Инкубируют в тече- ние 30 мин при температуре от 15 °С до 25 °С. Удаляют жидкость из лунок планшета, по- крытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 – 300 мкл ТСБ. В каждую лунку прибавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в темноте при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 10 мин. Для остановки реакции в каждую лун- ку прибавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида Р. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. Для построения кри- вой из значений, полученных для испытуемых и 78 стандартных растворов, вычитают значение, по- лученное для отрицательного контроля. Значе- ния оптической плотности в линейной области калибровочной кривой используют для расчета активности испытуемого образца с использова- нием общепринятых статистических методов (2.3.12.0). МЕТОД 3 Активность анти-D иммуноглобулина че- ловека определяют методом проточной ци- тометрии. Метод основан на специфиче- ском связывании иммуноглобулина анти-D с D-положительными эритроцитами. Актив- ность испытуемого образца сравнивают со стан- дартным образцом, активность которого выра- жена в международных единицах. За международную единицу принимают активность определенного количества междуна- родного стандартного образца иммуноглобули- на анти-D, устанавливаемую Всемирной орга- низацией здравоохранения. РЕАКТИВЫ Реактивы, при отсутствии особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ). Растворяют в воде Р 8,0 г натрия хлорида Р, 0,76 г динатрия гидрофосфата безводного Р, 0,2 г калия хлорида Р, 0,2 г калия дигидрофосфа- та Р и 0,2 г натрия азида Р и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем. Раствор ФСБ-БСА (ФСБ-БСА). ФСБ, содер- жащий 10,0 г/л альбумина бычьего Р. Эритроциты. Пул D-положительных эри- троцитов получают от доноров с группой крови 0R1R1 не ранее, чем за две недели до испытания. При необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при температуре 4 °С. Клетки промывают не менее двух раз ФСБ-БСА и го- товят суспензию, содержащую от 1·104 клеток в микролитре до 5·104 клеток в микролитре, с использованием ФСБ-БСА. Пул D-отрицательных эритроцитов получа- ют от доноров с группой крови 0rr и подготавли- вают аналогичным образом. Вторичные антитела. Подходящий фраг- мент анти-IgG-антитела, связанный с флуо- ресцентным красителем, обладающий специ- фичностью в отношении IgG человека или его фрагментов. Хранят и используют в соответ- ствии с инструкцией производителя. Титрационные микропланшеты. Плоско- донные планшеты для иммуноферментного ана- лиза без поверхностной обработки. МЕТОДИКА Испытуемые растворы. Лиофильно высу- шенные лекарственные препараты восстанав- ливают в соответствии с инструкцией по меди- цинскому применению.
Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 – 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимости исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область гра- фика зависимости «доза – ответ». Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D человека) в соответ- ствии с указаниями производителя. Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведе- ний, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 – 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимо- сти исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости «доза – ответ». В каждую лунку титрационного микро- планшета вносят по 50 мкл D-положительных эритроцитов. К содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл соответствую- щего разведения испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрица- тельного контроля в серию соответствую- щих лунок прибавляют по 50 мкл ФСБ-БСА. Для контроля неспецифического связывания вносят по 50 мкл D-отрицательных эритро- цитов в свободные лунки того же микроплан- шета и к содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл наименьшего разведе- ния испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрицательного контроля в серию соответствующих лунок, содержащих по 50 мкл D-отрицательных эритроцитов, вносят по 50 мкл ФСБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при температуре 37 °С в течение 40 мин. Планшет центрифугируют при 50 g в те- чение трех минут, удаляют надосадочную 79 жидкость и промывают лунки 200 – 250 мкл ФСБ-БСА. Планшеты промывают не менее двух раз. Планшеты центрифугируют при 50 g в течение трех минут, удаляют надосадочную жидкость и прибавляют по 50 мкл раствора вто- ричного антитела, полученного разведением с помощью ФСБ-БСА до подходящей концен- трации (рабочий титр вторичных антител зара- нее устанавливают опытным путем). Запечаты- вают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °С до 25 °С в защищенном от света месте в течение 20 мин. По окончании инкубации с вторичными ан- тителами планшет отмывают не менее двух раз путем центрифугирования при 50 g в течение трех минут с 200 – 250 мкл ФСБ. Удаляют надо- садочную жидкость и ресуспендируют эритро- циты в 200 – 250 мкл ФСБ. Суспензию клеток переносят в подходящие пробирки, совместимые с моделью проточно- го цитофлуориметра. При необходимости, для обеспечения подходящей скорости потока объ- ем полученных образцов доводят ФСБ до опти- мального значения. Накопление данных производят не позд- нее 20 мин от окончания пробоподготовки. Для статистического анализа накапливают не менее 10 000 событий без выхода за пределы установленного порогового значения како- го-либо параметра с исключением нецелевых (дебрисных) включений (в том числе мерт- вых клеток). Учитывают медианную интен- сивность флуоресценции и процент положи- тельных клеток. С использованием значения медианной интенсивности флуоресценции в линейной области кривой зависимости «доза – ответ» рассчитывают активность испытуемого образца общепринятыми статистическими ме- тодами (2.3.12.0). 201110006-2023 2.1.11.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ Fс-ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА В общей фармакопейной статье описаны методики определения функционального состо- яния Fс-фрагмента иммуноглобулина методом комплемент-зависимого гемолиза.
Методика 2 является адаптацией методики 1 для микропланшетов при измерении компле- мент-зависимого гемолиза. В статье указаны различия при проведении испытаний методикой 1 и методикой 2. МЕТОД КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМОГО ГЕМОЛИЗА РЕАКТИВЫ Стабилизированная кровь человека. Кровь доноров с группой крови O(I) собирают в кон- тейнеры с антикоагулянтом. Стабилизирован- ную кровь хранят при температуре 4 °C не более 3 недель. Фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,2. Растворяют 1,022 г динатрия гидро- фосфата безводного Р, 0,336 г натрия дигидро- фосфата безводного Р и 8,766 г натрия хлорида Р в 800 мл воды Р и доводят до объема 1000 мл тем же растворителем. Основной раствор магния и кальция. Раство- ряют 1,103 г кальция хлорида Р и 5,083 г магния хлорида Р в воде Р и доводят до объема 25 мл тем же растворителем. Основной раствор барбиталового буфера. Растворяют 207,5 г натрия хлорида Р и 25,48 г барбитала натрия Р в 4000 мл воды Р и до- водят рН раствора до значения 7,3, используя раствор 103 г/л хлороводородной кислоты Р. Прибавляют 12,5 мл основного раствора магния и кальция и доводят водой Р до объема 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при температуре 4 °C в прозрачных емкостях. Альбумин-барбиталовый буферный рас- твор. Растворяют 0,150 г альбумина бычьего Р в 20 мл основного раствора барбиталового буфе- ра и доводят водой Р до объема 100 мл. Готовят непосредственно перед использованием. Раствор таниновой кислоты. Растворяют 10 мг таниновой кислоты Р в 100 мл фосфат- но-солевого буферного раствора с рН 7,2. Гото- вят непосредственно перед использованием. Комплемент морской свинки. Готовят пул сыворотки из крови не менее чем 10 мор- ских свинок. Сыворотку отделяют центри- фугированием при температуре около 4 °C и хранят в небольших количествах при темпера- туре ниже −70 °C. Непосредственно перед нача- лом комплемент-зависимого гемолиза разводят 80 альбумин-барбиталовым буферным раствором до 125 – 200 СН50 /мл и хранят в ледяной бане во время испытания (CH50 (гемолитическая еди- ница активности комплемента) – концентрация комплемента в контрольной сыворотке, вызыва- ющая в данных условиях испытания лизис 50 % эритроцитов). Антиген краснухи. Для определения титра ингибирования гемагглютинации в испытании может быть использован антиген краснухи, титр которого должен быть менее 1:256 гемагглюти- нирующих единиц. ОБРАБОТКА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ТАНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ Эритроциты отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной крови человека. Промывают клетки не менее трех раз фосфатно-солевым буферным раство- ром с рН 7,2 и ресуспендируют в этом же рас- творе до получения концентрации 2 % (об/об). К 14,8 мл фосфатно-солевого буферного рас- твора с рН 7,2 прибавляют 0,2 мл раствора таниновой кислоты и смешивают один объем полученного свежеприготовленного раствора с одним объемом суспензии эритроцитов челове- ка. Инкубируют при температуре 37 °C в течение 10 мин. Клетки отделяют центрифугированием (800 g в течение 10 мин), надосадочную жид- кость удаляют, а клетки однократно промыва- ют фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2. Обработанные таниновой кислотой эритроциты ресуспендируют в фосфатно-соле- вом буферном растворе с рН 7,2 до получения концентрации 1 % (об/об). ФИКСАЦИЯ АНТИГЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ, ОБРАБОТАННЫХ ТАНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ К подходящему объему (Vs) суспен- зии эритроцитов, обработанных танино- вой кислотой, прибавляют антиген краснухи (0,2 мл на 1,0 мл суспензии клеток) и инкуби- руют при температуре 37 °C в течение 30 мин.
Клетки отделяют центрифугированием (800 g в течение 10 мин) и удаляют надосадочную жидкость. Прибавляют альбумин-барбита- ловый буферный раствор в объеме, равном объему удаленной надосадочной жидкости, клетки ресуспендируют, отделяют, как описа- но выше, и повторяют операцию промывки. Клетки ресуспендируют с помощью аль- бумин-барбиталового буферного раствора, используя объем, эквивалентный ¾ Vs, получая таким образом начальный объем (раствор Vi). Смешивают 900 мкл альбумин-барбитало- вого буферного раствора с 100 мкл раствора Vi, получая таким образом объем (Vr), и определяют исходную оптическую плотность при длине вол- ны 541 нм (А). Разводят Vr с коэффициентом раз- ведения, равным А, с помощью альбумин-бар- биталового буферного раствора, получая таким образом конечный скорректированный объем сенсибилизированных человеческих эритроци- тов (Vf = Vr · A) и доводя значение А до 1,0 ± 0,1 для десятикратного разведения. СВЯЗЫВАНИЕ АНТИТЕЛАМИ СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ Готовят последовательно в двух повторно- стях нижеперечисленные растворы, используя для каждого из них отдельную одноразовую кю- вету или пробирку. Испытуемые растворы. При необходимости доводят значение рН испытуемого раствора им- муноглобулина до 7,0. При выполнении методики 1 объемы ис- пытуемого образца разводят альбумин-барби- таловым буферным раствором таким образом, чтобы в 900 мкл раствора содержалось от 30 мг до 40 мг иммуноглобулина. При выполнении методики 2 объемы испы- туемого образца разводят альбумин-барбитало- вым буферным таким образом, чтобы в 1200 мкл раствора содержалось от 15 мг до 30 мг иммуно- глобулина. Растворы сравнения. Готовят так же, как и испытуемые растворы с использованием СО ФЕАЭС иммуноглобулина человека для оцен- ки функционального состояния Fc-фрагмента. Контроль комплемента. Альбумин-барбита- ловый буферный раствор используют в таком же объеме, что и испытуемый раствор. При выполнении методики 1 к содержимо- му каждой кюветы или пробирки прибавляют по 100 мкл сенсибилизированных эритроцитов че- ловека и хорошо перемешивают. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, прибав- ляют 1000 мкл альбумин-барбиталового буферно- го раствора, отделяют клетки центрифугировани- ем (1000 g в течение 10 мин) и удаляют 1900 мкл надосадочной жидкости. Прибавляют 1900 мкл 81 альбумин-барбиталового буферного раствора и повторяют операцию промывки, оставляя объем 200 мкл. Полученные образцы могут храниться в герметично укупоренных кюветах (пробирках) при температуре 4 °C не более 24 ч. При выполнении методики 2 к содержимо- му каждой кюветы или пробирки прибавляют по 300 мкл сенсибилизированных эритроци- тов человека и хорошо перемешивают (конеч- ная концентрация иммуноглобулина в преде- лах от 10 мг/мл до 20 мг/мл). Инкубируют при температуре от 15 °С до 25 °С в течение 15 мин, прибавляют 1500 мкл альбумин-барбиталового буферного раствора, отделяют клетки центрифу- гированием (1000 g в течение 10 мин) и удаляют надосадочную жидкость. Прибавляют 3000 мкл альбумин-барбиталового буферного раствора и повторяют всю операцию промывки четыре раза, оставляя объем 300 мкл. Полученные об- разцы могут храниться в герметично укупорен- ных кюветах (пробирках) при температуре 4 °C не более 24 ч. КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМЫЙ ГЕМОЛИЗ При выполнении методики 1 для измерения гемолиза к полученному образцу прибавляют 600 мкл предварительно нагретого до темпера- туры 37 °C альбумин-барбиталового буферно- го раствора, тщательно ресуспендируют клет- ки путем пипетирования (не менее пяти раз) и помещают кювету в термостатированный держатель кювет спектрофотометра.
Через 2 мин прибавляют 200 мкл разведенного компле- мента морских свинок 125 – 200 СН50/мл, дву- кратно пипетируют для перемешивания и сразу начинают регистрацию оптической плотности через установленные промежутки времени при длине волны 541 нм с использованием альбу- мин-барбиталового буферного раствора в ка- честве компенсационного раствора. Измерение прекращают при очевидном прохождении точки перегиба графика зависимости оптической плот- ности от времени. При выполнении методики 2 для измере- ния степени гемолиза к полученному образцу прибавляют 900 мкл предварительно нагретого до температуры 37 °C альбумин-барбиталово- го буферного раствора, осторожно ресуспен- дируют клетки путем пипетирования (не ме- нее пяти раз). Микропланшеты должны быть предварительно нагреты до температуры 37 °C. Переносят по 240 мкл каждой суспензии в 4 лунки микропланшета и инкубируют при температуре 37 °C в течение шести минут, осторожно встряхи- вая каждые 10 с. В каждую лунку микропланшета прибавляют по 60 мкл разведенного комплемента морских свинок 150 СН50/мл, тщательно переме- шивают в течение 10 с и начинают регистрацию оптической плотности при длине волны 541 нм при температуре 37 °C; измерение проводят каж- дые 20 с. Измерение прекращают при очевидном прохождении точки перегиба графика зависимо- сти оптической плотности от времени. ОЦЕНКА Для каждой кюветы (пробирки, лунки) определяют угол наклона (S) кривой гемолиза в области точки перегиба путем сегментации участка с наибольшим наклоном на подходя- щие временные отрезки (например, ∆t = 1 мин) и вычисляют значения S между соседними точ- ками пересечений, выраженные как изменения оптической плотности в минуту (∆А/мин). Наи- большее значение S является экспериментально установленным углом наклона кривой гемолиза (Sexp). Кроме того, определяют оптическую плот- ность в начале измерения (As) путем экстраполя- ции кривой, практически линейной и параллель- ной оси времени в течение первых нескольких минут. Корректируют значение Sexp по формуле: S' = Sexp AS Рассчитывают среднее арифметическое зна- чений ' S для каждого образца (испытуемого рас- твора и раствора сравнения). Рассчитывают индекс функционального состояния Fc-фрагмента (IFc) по формуле: IFc = 100 · S _' – S _'c S _'s – S _'c где: S _' — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для испыту- емого раствора; S _'s — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для раствора сравнения; S _'c — среднее арифметическое скорректи- рованного угла наклона для контро- ля комплемента. 82 Рассчитывают индекс функционального состояния Fc-фрагмента для испытуемого образца: значение должно быть не менее указан- ного для стандартного образца. 201110007-2023 2.1.11.7. ПОДСЧЕТ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК CD34+/CD45+ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТАХ Общая фармакопейная статья описывает методологию определения количества клеток CD34+/CD45+, содержащихся в биологических продуктах, путем проведения иммунного мече- ния и анализа методом проточной цитометрии (2.1.6.16). Под биологическими продуктами в данной общей фармакопейной статье пони- мают биологические лекарственные средства, а также исходные материалы и промежуточные продукты для их производства, содержащие гемопоэтические клетки. Определение выпол- няют на основе одноплатформенного метода с использованием калиброванных флуоросфер. При необходимости проводят предварительный лизис эритроцитов в образцах крови. Метод применим ко всем типам биологиче- ских продуктов. Особенности метода делают его наиболее подходящим для продуктов с очень низким содержанием клеток CD34+/CD45+.
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА НА ОСНОВЕ ПОДСЧЕТА КЛЕТОК CD34+/CD45+ Установлено, что 1 – 3 % клеток костного мозга, выделяющие поверхностный клеточный антиген CD34, способны к восстановлению долгосрочного многостадийного гемопоэза по- сле миелоаблативной высокодозной терапии. Клетки CD34+/CD45+ также присутствуют в незначительном количестве (от 0,01 % до 0,1 %) в периферической крови здоровых людей. Клет- ки CD34+/CD45+ в значительных количествах могут быть мобилизованы из костного мозга в периферическую кровь под действием гемопо- этических цитокинов, таких как гранулоцитар- ный колониестимулирующий фактор, и (или) химиотерапии. Метод, используемый для под- счета клеток CD34+/CD45+, должен соответ- ствовать следующим требованиям: – высокая чувствительность (в связи с ма- лым количеством гемопоэтических стволовых клеток); – точность (для обеспечения клинически значимых результатов); – воспроизводимость (для обеспечения кли- нически надежных результатов); – скорость (для обеспечения проведения ана- лиза в реальном времени). ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ В проточной цитометрии используют ком- мерчески доступные моноклональные антитела, конъюгированные с флуорофором, стандартные процедуры окрашивания и лизиса цельной кро- ви, а также применяют стратегию гейтирования с использованием светорассеяния и иммунофлуо- ресцентного анализа с применением комбина- ции пан-CD34/CD45 моноклональных антител. Жизнеспособность клеток CD34+/CD45+ можно определить с помощью соответствующего окрашивания нуклеиновых кислот красителем, не проникающим через интактную клеточную мембрану (например, 7-аминоактиномицин D). Выбор моноклональных антител Антитела к CD34. Для обнаружения всех вариантов гликозилирования молекулы (напри- мер, клон 8G12 или 581) используют антите- ла к CD34 класса III. Для обнаружения редких эффектов используют антитела, конъюгирован- ные с флуорофорами (например, фикоэритри- ном), имеющими максимальное свечение при использовании проточного цитометра с аргоно- вым лазером. Антитела к CD45. Необходимо использо- вать пан-CD45 антитела, обнаруживающие все изоформы и все гликоформы этой структуры. Обычно используют антитела к CD45, конъю- гированные с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в качестве флуорофора (например, J33, HLe1, 2D1). Контроли изотипов и изоклонов. Для об- наружения неспецифичных сигналов в обла- сти флуоресценции фикоэритрина использу- ют отрицательный контроль. При применении контроля изотипов (моноклональные антитела к нерелевантным антигенам того же изотипа, что и используемые антитела к CD34) фикоэ- ритрин-конъюгированный изотип объединяют с CD45-ФИТЦ (или PerCP). При применении контроля изоклонов неконъюгированные (в из- 83 бытке) и фикоэритрин-конъюгированные моно- клональные антитела, идентичные антителам к CD34, объединяют с конъюгированными анти- телами к CD45. Могут быть использованы аль- тернативные комбинации. Определение абсолютного количества клеток CD34+/CD45+ Калиброванные флуоросферы. В зависимо- сти от применяемого оборудования, внутренний стандарт может представлять собой калиброван- ные сферы, находящиеся в суспензии, или мо- жет быть помещен непосредственно в прилагае- мые производителем пробирки. Абсолютное количество клеток CD34+/CD45+ в миллилитре рассчитывают по формуле: A · C B где: А — количество подсчитанных клеток CD34+/CD45+; В — количество подсчитанных флуоросфер; С — известная концентрация флуоросфер.
Стратегии гейтирования Целью стратегии гейтирования является по- следовательный выбор интересующей популяции и одновременная минимизация интерференции, вызываемой дебрисом (фрагментами клеток) и зрелыми клетками, с которыми антитела могут неспецифически связываться. При использова- нии коммерческих наборов применяют стратегию гейтирования, рекомендованную производителем набора. При использовании собственной методи- ки применяют существующие рекомендуемые стратегии. Стратегия гейтирования, учитываю- щая параметры светорассеяния и флуоресцен- цию, будет обеспечивать правильную идентифи- кацию и подсчет клеток CD34+/CD45+. Количество обрабатываемых событий Для достижения приемлемых правильности и прецизионности анализируют достаточное ко- личество событий, например, не менее 100 собы- тий CD34+ и не менее 60 000 событий CD45+; общее количество клеток может быть выше при условии, если процентное содержание CD34 со- ставляет 0,1 % или менее. ОТБОР И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ ПРОБ Антикоагулянтом при процедуре афереза является цитрат декстроза (состав А). Данный антикоагулянт позволяет проводить на одном и том же испытуемом образце как автоматизиро- ванный подсчет клеток, так и испытание с по- мощью проточной цитометрии. При отборе проб периферической крови в качестве антикоагулян- та, как правило, используют этилендиаминте- трауксусную кислоту. Условия транспортирования проб должны гарантировать постоянство температуры и фи- зическую сохранность проб. ХРАНЕНИЕ ПРОБ Испытанию могут быть подвергнуты свежие (хранившиеся не более 24 ч) пробы продуктов афереза, цельной крови, пуповинной крови или костного мозга. Пробы, хранившиеся более 24 ч и пробы, которые претерпели заморозку и раз- мораживание, окрашивают красителями, позво- ляющими оценить количество жизнеспособных клеток. При приеме проб проверяют температу- ру внутри упаковки. МЕТОДИКА ПРОБОПОДГОТОВКА ИСПЫТУЕМОГО ОБРАЗЦА Перед окрашиванием с помощью монокло- нальных антител необходимо убедиться, что концентрация клеток является подходящей. При необходимости испытуемый образец разводят средой, совместимой с испытуемым образцом и системой для лизиса. Учитывают коэффициент разведения. Рекомендуется проводить испыта- ние с использованием отрицательного контроля. АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Автоматическая стандартизация Для анализа клеток, меченных с применени- ем коммерчески доступных наборов, произво- дители разрабатывают критерии для настройки проточного цитометра. Данные настройки затем автоматически переносят в протокол анализа испытуемых образцов. Для настройки фото- умножительной трубки на заданные значения используют специальные флуоросферы, уста- навливают поправку и проверяют систему с по- мощью контрольных образцов. Настройки системы Пороговое значение: во избежание учета дебри- са (низкий уровень прямого светорассеяния) вместо 84 мелких форм лимфоцитов, на графике светорассея- ния устанавливают порог прямого угла рассеяния. Высоковольтные настройки фотоумно- жительной трубки: должны быть совместимы с анализом поверхностных клеточных мар- керов; устанавливают в каждой лаборато- рии таким образом, чтобы была возможность различить отрицательные и положительные популяции клеток с умеренной плотностью антигенов; напряжение фотоэлектронных ум- ножителей необходимо периодически прове- рять и настраивать в соответствии со стандарт- ными процедурами, принятыми в лаборатории.
Поправка: должна быть применена в случае интерференции в видимом диапазоне спектра (например, ФИТЦ/фикоэритрин), обнаруженной при анализе поверхностных клеточных марке- ров; поправку на цвет анализируют и настраива- ют в соответствии со стандартными процедура- ми, принятыми в лаборатории. Скорость потока: должна подходить для рутин- ного анализа поверхностных клеточных маркеров. Диапазоны гейтирования: области, уста- новленные для образцов CD34/CD45, которые оставляют неизменными для анализа отрица- тельной области. Расчет абсолютного количества клеток CD34+/CD45+ Абсолютное количество клеток CD34+/ CD45+ рассчитывают по формуле: n · D · V где: n — общее количество клеток CD34+/CD45+ в микролитре; D — фактор разведения; V — объем испытуемого образца, в микролитрах Результаты испытания выражают как содер- жание клеток CD34+/CD45+ в процентах, так и абсолютное количество клеток в микролитре. Если применимо, результаты могут быть выра- жены в абсолютном количестве клеток на кило- грамм массы тела реципиента. 201110008-2023 2.1.11.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПО КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИМ КЛЕТКАМ Количество гемопоэтических прогенитор- ных клеток человека определяют с помощью клоногенного анализа, основанного на их спо- собности образовывать колонии или кластеры клеток в полужидких культуральных средах. Определение в клеточном продукте количе- ства клеток, способных к образованию колоний (колониеобразующих клеток, КОК), представляет собой индикатор функциональной способности прогениторных клеток. Измеренное количество КОК коррелирует с количеством прогениторных клеток, присутствующих в образце. ПОВЕРХНОСТНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ Способность КОК формировать гемопоэти- ческие колонии in vitro и (или) восстанавливать систему гемопоэза коррелирует с экспрессией определенных поверхностных клеточных анти- генов. Экспрессия мембранного антигена CD34 является маркером для большинства гемопоэти- ческих стволовых и прогениторных клеток. ОСОБЕННОСТИ ИСПЫТАНИЯ Колонии КОК могут содержать одну или не- сколько линий гемопоэтических клеток, которые идентифицируют в соответствии с классификаци- ей, основанной на кластерах зрелых клеток, при- сутствующих в колонии в конце культивирования в полужидкой среде (например, смешанные коло- ниеобразующие единицы; колониеобразующие единицы гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, макрофагов (КОЕ-ГЭММ); колониеобразующие единицы гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ); колониеобразующие единицы гранулоцитов (КОЕ-Г); колониеобразующие единицы макро- фагов (КОЕ-М); бурстобразующие единицы эри- троцитов (БОЕ-Э); колониеобразующие единицы эритроцитов (КОЕ-Э); колониеобразующие еди- ницы мегакариоцитов (КОЕ-Мег)). 85 Количество и тип факторов роста, внесен- ных во время культивирования, определяют тип и размер колоний, которые будут сформи- рованы. Время, требуемое для дифференцировки in vitro в зрелые клетки, предоставляет допол- нительную информацию о классе гемопоэтиче- ских прогениторных клеток и их относительном пролиферативном потенциале. Время, необходи- мое для формирования in vitro колоний зрелых клеток (взрослого типа) из постнатальных КОК, составляет от 10 сут до 14 сут. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИСПЫТАНИЯ Важнейшим условием для обеспечения каче- ства испытания клоногенности является исполь- зование строго стандартизованных процедур, в валидацию которых следует включать прове- дение внутри- и межлабораторных испытаний. Источники материалов, в том числе реакти- вов, факторов роста и расходных одноразовых материалов, должны быть идентифицированы и документированы.
Основными факторами, влияющими на вари- абельность испытания клоногенности, являются количество внесенных в лунки клеток и иденти- фикация колоний. Для одного и того же испыта- ния может наблюдаться внутрилабораторная ва- риабельность до 15 %. Если необходимо оценить количество КОК в чистой клеточной популяции, можно использовать подход с предельным разве- дением, при котором количество лунок с наблю- даемой клеточной пролиферацией, измеряют с помощью автоматизированной системы. Другой важной причиной вариабельности является использование в испытании матери- алов сложного неопределенного состава (на- пример, эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота или бычьего сывороточного аль- бумина), полученных из пулов исходных мате- риалов и способствующих неспецифической стимуляции клеточной пролиферации. Однако довольно часто встречаются серии материалов с особыми характеристиками, которые селектив- но стимулируют пролиферацию специфических гемопоэтических линий. Для проведения клоногенного анали- за целесообразно использовать материалы с низким содержанием эндотоксинов (ме- нее 0,01 МЕ/мл или менее 0,01 МЕ/мг), по- скольку более высокое их содержание приводит сначала к последовательному изме- нению экспрессии гемопоэтических клонов в культурах, а впоследствии – в целом к инги- бированию клеточной пролиферации и клоноге- неза. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК Количественное определение КОК основа- но на способности прогениторных клеток фор- мировать колонию при внесении в полужидкую культуральную среду или в гель в присутствии определенных факторов роста. В зависимости от цели испытания и способа регистрации ре- зультатов могут использоваться различные типы полужидких сред (например, метилцеллюлоза, коллаген, агар и свернувшаяся плазма). Коммер- чески доступные среды обычно дают более вос- производимые результаты. МАТЕРИАЛЫ Испытания проводят, как минимум, для сле- дующих критических материалов. Факторы роста Для получения наибольшего числа коло- ний из клеточной суспензии, содержащей сме- шанную популяцию гемопоэтических проге- ниторных клеток, требуются факторы роста, стимулирующие как множество линий (напри- мер, Kit-лиганд или фактор стволовых клеток, интерлeйкин 3, гранулоцитарно-макрофагаль- ный колониестимулирующий фактор), так и определенные линии (эритропоэтин, грануло- цитарный колониестимулирующий фактор). Другие компоненты культуральной среды В среды могут быть добавлены сыворотки (в частности, эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота) и (или) альбумин. КУЛЬТУРА КЛЕТОК Клетки Испытуемый образец для культивирования должен быть репрезентативной пробой клеточ- ного продукта. Для этого испытания необхо- димо использовать суспензии клеток. В случае использования аспирации костного мозга такие суспензии могут быть получены, путем про- давливания костного мозга через решетчатые фильтры или через постепенно уменьшающий- ся диаметр игл. Для диспергирования клеточных 86 кластеров в клеточную суспензию, как правило, достаточно повторных продавливаний через иглу размера 21G. ПОСЕВ В ЧАШКУ И ПОДСЧЕТ Суспензию клеток в культуральной среде смешивают с полужидкой средой. Обычно 1 мл смеси вносят в необработанную стерильную чашку Петри (диаметром 35 мм). Из-за вязкости среды смесь не может быть нанесена на чашку с помощью автоматического дозатора, и требуется использование шприцов с иглами большого диаметра (размер 18G и менее). Количество клеток, высеваемых в чашку Пе- три, зависит от концентрации гемопоэтических прогениторных клеток в испытуемом образце.
Количество клеток должно приводить к образо- ванию от 40 до 80 колоний на чашку (диаметром 35 мм), для предотвращения образования одной колонии из двух разных гемопоэтических проге- ниторных клеток. Целевое количество колоний на чашку может быть рассчитано из процентного содержа- ния клеток CD34+ (или из концентрации клеток CD34+ в миллилитре), определенного методом проточной цитометрии (2.1.6.16) или путем ис- пользования различных разведений клеточной суспензии (как правило, проверяют не менее двух концентраций). Чашки инкубируют в аэробных условиях с концентрацией углекислого газа 5 % при температуре 37 °С во влажной (насыщенной) атмосфере в течение 10 – 14 сут и подсчитывают количество колоний с использованием инвер- тированного микроскопа. При манипуляциях с чашками, содержащими колонии, соблюда- ют меры предосторожности, поскольку среда с метилцеллюлозой является вязкой, но не же- леобразной. Наклон чашки может привести к формированию сливающихся и кометообраз- ных колоний, что делает подсчет некорректным. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛОНИЙ Размер и структура колоний зависят от типа зрелых клеток, из которых они образова- ны. Обычно минимальное количество клеток на колонию составляет 50. Присутствие ге- моглобинизированных клеток указывает на на- личие прогениторных клеток эритробластного ряда. Поскольку количество зрелых клеток для каждой линии дифференцировки в значитель- ной степени зависит от факторов роста, добав- ленных к культурам клеток, выполнение диффе- ренцированного подсчета не рекомендуется, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. ИНТЕПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты испытания обычно выражают как среднее арифметическое количества ко- лоний, посчитанных не менее чем в 3 чашках, которое затем выражают в пересчете на 104 или 105 эукариотических жизнеспособных клеток, составляющих культуру. 201110009-2023 2.1.11.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Определение качества суспензий эукари- отических клеток требует точного измерения как концентрации, так и содержания жизнеспо- собных клеток, выраженного в процентах. Эти данные необходимы для процесса принятия ре- шений при производстве клеточных продуктов и поддержания оптимальных условий культивиро- вания. Количество клеток может быть выражено как число клеток на объем клеточной суспензии, а жизнеспособность клеток – как число живых клеток на объем клеточной суспензии. Проце- дура подсчета клеток может быть выполнена вручную (гемоцитометр) или с использованием автоматических устройств (например, счетчик частиц, проточный цитометр). Также могут быть использованы и другие методы. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК РУЧНОЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА Описание прибора и принцип испытания Необходимо следующее оборудование: – гемоцитометр: специальная камера в раз- личных модификациях для микроскопического исследования. Камера состоит из толстого пред- метного стекла и покровного шлифованного стекла, предназначенного для разграничения ка- меры с определенным объемом для каждой моди- 87 фикации. На предметном стекле выгравированы глубокие бороздки, предназначенные для преду- преждения перекрестного заполнения, и нанесе- на сетка, специфичная для каждой модели; – световой микроскоп от 10× до 40× кратно- го увеличения; – пипетки подходящего объема.
Гемоцитометр используют для определения количества клеток в суспензии путем расчета кон- центрации клеток в миллилитре (С), по формуле: С = a · 10n · d где: a — число подсчитанных клеток; d — коэффициент разведения (при необходимости); n — коэффициент, меняющийся в зависимости от объема камеры гемоцитометра. В смешанной популяции распознавание кле- ток проводят по их различиям в размерах или окраске (например, лейкоциты и эритроциты). Подготовка камеры для подсчета и анализ. Покровное стекло устанавливают на предметное стекло. Притирают покровное стекло, избегая на- личия пузырьков воздуха в камере. Готовят подхо- дящее разведение клеточной суспензии в растворе 9 г/л натрия хлорида Р или буферном растворе с добавками для предотвращения гемолиза. Подходящий объем разведенной клеточной суспензии помещают в камеру подсчета. через щель, образующуюся между покровным стеклом и счетной камерой. Клеточная суспензия запол- няет камеру подсчета благодаря капиллярности. Подсчет клеток в гемоцитометре проводят под микроскопом, настраиваемом так, чтобы были отчетливо различимы нанесенная сетка и клетки, распределенные на ней. Подсчитывают количе- ство клеток на сетке и рассчитывают их концен- трацию в разведенных и неразведенных образцах. Для увеличения точности измерения необходи- мо соблюдать следующие меры предосторожности: – используют покровное стекло подходящей толщины; – по возможности, подсчитывают более 100 клеток (в случае необходимости, считают большее количество квадратов); – при обнаружении кластеров клеток (кле- точная суспензия содержит не только единичные клетки, но и их скопления) суспензию ресуспен- дируют, отбирают образец и снова подсчитывают; – для надлежащего подсчета клеток следует избегать неполного заполнения или переполне- ния счетной камеры. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА Счетчики частиц, основанные на изменении проводимости Электронные счетные устройства измеряют размер и число частиц в растворе. Перед ис- пользованием счетчики частиц калибруют рас- твором с известной концентрацией и размером частиц. Для подсчета частиц большего размера, применяют пробирки, оснащенные другими ка- либровочными насадками. Подобные приборы не позволяют различать нежизнеспособные и жизнеспособные клетки. Поскольку фрагменты клеток (дебрис) могут производить импульсы, которые вызывают ошибки, счетные устройства также оснащают пороговым контролем, позво- ляющим подсчитывать только большие частицы. Прибор должен быть пригоден для подсчета клеточных продуктов (с точки зрения линейно- сти, точности, и т.д.). Счетчики частиц, основанные на проточной цитометрии (2.1.6.16) Проточный цитометр калибруют по стандарт- ным частицам известной концентрации и разме- ра для подсчета абсолютного количества клеток в объеме. Для приборов с двумя электродами, погруженными в счетную камеру с постоянным размером и возможностью проведения измерений в фиксированном объеме, повторную калибровку проводят только при необходимости. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК Приведенные методы определения процента жизнеспособных клеток основаны на окраши- вании клеток красителями и анализе суспензии клеток с помощью ручного или автоматизиро- ванного методов подсчета. В зависимости от типа клеток и используемых методов подсчета результаты могут отличаться. РУЧНОЙ МЕТОД Принцип испытания Испытание основано на проницаемости ци- топлазматических мембран: нежизнеспособные 88 (мертвые или поврежденные клетки) абсорбиру- ют краситель и окрашиваются, жизнеспособные клетки не окрашиваются.
Испытание дает инфор- мацию о целостности мембраны, но его резуль- таты не обязательно отражают функциональную активность клетки. Мембраны недавно трипси- низированных или размороженных жизнеспособ- ных клеток способны абсорбировать краситель. Краситель Наиболее часто используемым красителем для определения жизнеспособности клеток, является трипановый синий, но также могут быть использованы и другие подходящие краси- тели, такие как эритрозин В или нигрозин. Трипановый синий – кислотный краситель (Mr 961), анион с четырьмя сульфонатными группами, легко связывающимися с белками, поэтому концентрация белка в испытуемом образце должна быть настолько низкой, насколько возможно. Условия проведения испытания Фиксация окраски клеток сильно зависит от значения рН, поэтому необходимо проведение окрашивания при рН в пределах от 6,6 до 7,6. Оптимальная фиксация осуществляется при зна- чении рН 7,5. Другие условия, такие как концен- трация красителя и время окрашивания, должны быть валидированы. Условия хранения красителя. Обычно используют 0,4 % или 0,5 % раствор три- панового синего в стерильном подходящем фосфатно-солевом буферном растворе. Хранят в защищенном от воздействия света и воздуха месте. Подготовка к испытанию и анализ. Суспензию клеток, разведенную до необходи- мой концентрации в подходящем фосфатно-со- левом буферном растворе, окрашивают, напри- мер, с использованием раствора трипанового синего с конечной концентрацией от 0,1 % до 0,2 %. Аккуратно перемешивают. Инкубируют не более 2 ‒ 4 мин при комнатной температу- ре. Вновь аккуратно перемешивают, помещают подходящий объем в счетную камеру и прово- дят подсчет клеток. Определяют процент жизнеспособных кле- ток как отношение числа неокрашенных клеток к общему количеству клеток, подсчитанному с использованием оптического микроскопа, счи- тая все окрашенные клетки нежизнеспособными. Жизнеспособность клеток (V) в процентах рассчитывают по формуле: V = n · 100 N где: n — число неокрашенных (жизнеспособных) клеток; N — общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных). Время инкубации не должно превышать 4 мин, так как впоследствии число окрашенных клеток может значительно увеличиться. В связи с этим для повторного определения необходимо подготовить новый образец. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ Проточная цитометрия Принцип испытания. Испытание основано на способности определенных красителей про- никать через поврежденные мембраны и связы- ваться с ДНК путем интеркалирования между основаниями, вследствие чего флюоресцен- цию нежизнеспособных клеток можно зареги- стрировать с помощью проточной цитометрии (2.1.6.16). Нежизнеспособные клетки оцени- вают по различиям, выявляемым при окраши- вании клеток, тогда как жизнеспособные клет- ки остаются неокрашенными. Анализ обычно выполняют с использованием 7-аминоактино- мицина D (7-ААД) или пропидий-йодида, до- пустимо использование других подходящих красителей. Красители. Мембранопроникающие веще- ства, например, 7-ААД и пропидий-йодид, мо- гут быть использованы в качестве красителей для определения жизнеспособности клеток. 7-ААД является аналогом актиномицина D, у которого в положении 7 хромофора за- менена аминокислотная группа. 7-ААД ин- теркалирует между цитозиновыми и гуани- новыми основаниями ДНК. Спектральные свойства 7-ААД позволяют использовать его как краситель для анализа методом проточ- ной цитометрии. Максимум поглощения ком- плекса 7-ААД/ДНК расположен в зеленом ди- апазоне спектра и является подходящим для определения количества клеток с помощью цитометра, оснащенного аргоновым лазером (длина волны возбуждения 488 нм).
Насыщен- ная красная флуоресцентная эмиссия 7-ААД (от 635 нм до 675 нм) обуславливает воз- можность его применения в комбинации 89 с антителами, конъюгированными с флуо- ресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) и фи- коэритрином (ФЭ), поскольку, в отличие от пропидий-йодида, комплекс 7-ААД/ДНК имеет минимальное спектральное наложение с ФИТЦ и ФЭ. Пропидий-йодид связывается с двухнитевой ДНК путем интеркалирования между парами оснований с небольшими предпочтениями или без них и со стехиометрией, соответствующей одной молекуле красителя на 4 ‒ 5 пар основа- ний ДНК. Флуоресценция образовавшегося ком- плекса красителя с нуклеиновыми кислотами увеличивается в 20 ‒ 30 раз, при этом максимум возбуждения флуоресценции смещается при- близительно на 30 ‒ 40 нм в красную область, а максимум эмиссии флуоресценции (615 нм) – приблизительно на 15 нм в синюю область. Хотя способность пропидий-йодида к оптическому поглощению довольно низка, он проявляет до- статочно большой Стоксовский сдвиг (разница длин волн максимумов спектров поглощения и флуоресценции), что позволяет одновременно обнаруживать нуклеиновые кислоты и антитела, меченные флуоресцеином при условии исполь- зования подходящих оптических фильтров. Условия хранения растворов красителей нукле- иновой кислоты. При температуре от 2 °С до 8 °С. Подготовка к испытанию и анализ. В случае гемопоэтических клеток краситель может быть добавлен после маркирования CD45+ на клет- ках для лучшего разделения клеток от клеточных фрагментов (дебриса) и тромбоцитов на осно- ве установления области соответствия объектов по боковому светорассеянию (SS) и мечения CD45+. Условия инкубации клеточной суспензии с красителем должны быть валидированы. Инкубацию выполняют при температуре от 15 °С до 25 °С, в защищенном от света условиях. При необходимости выполняют ли- зис эритроцитов, используя, например, аммония хлорид. Если в проведении лизиса нет необхо- димости, прибавляют только буферный раствор. Процентное содержание жизнеспособных клеток определяют непосредственно с помощью проточного цитометра и анализа положительных клеток (нежизнеспособные клетки) на SS/7-ААД или SS/пропидий-йодид цитограммах графиках. Положительные контроли могут состоять из стабилизированных клеток (нежизнеспособ- ные клетки), смешанных со свежими жизнеспо- собными клетками в необходимом соотношении. Цифровое изображение окрашенных клеток Цифровое изображение позволяет автома- тизировать методы с использованием световой микроскопии. Суспензию клеток и раствор кра- сителя смешивают непосредственно в приборе. Система, которая позволяет проводить аспира- цию образца, работу с реактивами и последу- ющую очистку оборудования, полностью авто- матизирована. Как только клеточная суспензия была отобрана и смешана с раствором красите- ля, она подается в проточную ячейку для ана- лиза. Окрашенная клеточная суспензия проте- кает через камеру, где стробоскопический свет позволяет фотокамере фотографировать прохо- дящие через счетную камеру клетки. Изображе- ние оцифровывается, и число нежизнеспособ- ных или жизнеспособных клеток подсчитывают с использованием программного обеспечения. 201110010-2023 2.1.11.10. АЛЮМИНИЙ В АДСОРБИРОВАННЫХ ВАКЦИНАХ И АЛЛЕРГЕНАХ МЕТОДИКА 1 Испытуемый образец. В колбу для минера- лизации вместимостью 50 мл помещают соот- ветствующее количество гомогенизированного образца, содержащего от 5 мг до 6 мг алюминия. Прибавляют 1 мл серной кислоты Р, 0,1 мл азотной кислоты Р и несколько стеклянных ша- риков. Полученный раствор нагревают до вы- деления плотного белого дыма.