Текст очень длинный, поэтому разбит на части. Часть 3 из 13.
 íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî çíà÷åíèå 2 %. Îöåíèâàþò íàáëþäàå- ìûå çíà÷åíèÿ ïîãëîùåíèÿ îò- íîñèòåëüíî ñòàíäàðòíûõ, íà- ïðèìåð, ñ ïîìîùüþ ëèíåéíîé ðåãðåññèè. Äëÿ ïåðâîé ïðî- âåðêè ôîòîìåòðè÷åñêîé ëè- íåéíîñòè ïðèáîðà äîïóñòè- ìûìè ÿâëÿþòñÿ îòêëîíåíèÿ 1,00 ± 0,05 äëÿ íàêëîíà è 0,00 ± 0,05 äëÿ îòñåêàåìîãî îòðåçêà. Ïðè ïîñëåäóþùèõ ïðîâåðêàõ ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè â êà÷åñòâå ñòàí- äàðòíûõ ïîêàçàòåëåé ïîãëî- ùåíèÿ ìîãóò áûòü èñïîëüçî- âàíû ïîêàçàòåëè, ïîëó÷åííûå ïðè ïåðâîé ïðîâåðêå. Ïðè èçìåðåíèÿõ ïðîïóñêà- íèÿ-îòðàæåíèÿ ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû ïîäõîäÿùèå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû îòðàæå- íèÿ èëè ïðîïóñêàíèÿ è êðèòå- ðèè îöåíêè. Àíàëèçèðóþò 4 ñòàíäàðòíûõ îáðàçöà ïðîïóñêàíèÿ âî âñåì ðàáî÷åì äèàïàçîíå ïîãëîùå- íèÿ ìîäåëèðóåìûõ äàííûõ. Îöåíèâàþò íàáëþäàåìûå çíà- ÷åíèÿ ïîãëîùåíèÿ îòíîñè- òåëüíî ñòàíäàðòíûõ, íàïðè- ìåð, ñ ïîìîùüþ ëèíåéíîé ðåãðåññèè. Äëÿ ïåðâîé ïðî- âåðêè ôîòîìåòðè÷åñêîé ëè- íåéíîñòè ïðèáîðà äîïóñòè- ìûìè ÿâëÿþòñÿ îòêëîíåíèÿ 1,00 ± 0,05 äëÿ íàêëîíà è 0,00 ± 0,05 äëÿ îòñåêàåìîãî îòðåçêà. Ïðè ïîñëåäóþùèõ ïðîâåðêàõ ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè â êà÷åñòâå ñòàí- äàðòíûõ ïîêàçàòåëåé ïîãëî- ùåíèÿ ìîãóò áûòü èñïîëüçî- âàíû ïîêàçàòåëè, ïîëó÷åííûå ïðè ïåðâîé ïðîâåðêå. Ïðèáîðû äëÿ ïðîèçâîäñòâåí- íîãî ïðîöåññà  ñëó÷àå åñëè íåâîçìîæíî èçìåðèòü ôîòîìåòðè÷åñêèé ñòàíäàðòíûé îáðàçåö îòðàæåíèÿ èëè ïðîïóñêàíèÿ â òî÷êå èçìåðåíèÿ îáðàçöà, èñïîëüçóþò ôîòîìåòðè÷åñêèå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû, âñòðîåííûå â ïðèáîð. Äëÿ ïðèáîðîâ äëÿ ïðîèçâîäñòâåííîãî ïðîöåññà äëÿ ïðîâåðêè ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû âíóòðåííèå ôîòîìåòðè÷åñêèå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû.  ýòèõ ñëó- ÷àÿõ ñëåäóþò ïðîâåðåííûì äîïóñêàì îò ïðîèçâîäèòåëÿ ïðèáîðà. Ïðîâåðêà ôîòî- ìåòðè÷åñêîãî øóìà(1) Ôîòîìåòðè÷åñêèé øóì â ñîîòâåòñòâóþùåé ôîòîìåòðè÷åñêîé îáëàñòè ñïåêòðà îïðåäåëÿþò ñ èñïîëüçîâàíèåì ïîäõîäÿùèõ ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ îòðàæåíèÿ, íàïðèìåð, ñòàíäàðòû áå- ëûõ êåðàìè÷åñêèõ ïëèòîê èëè ñòàíäàðòû ïîëèìåðîâ, ëåãèðîâàííûõ óãëåðîäîì. Èñïîëüçó- þò ìåòîäîëîãèþ è ñïåöèôèêàöèè ïðîèçâîäèòåëÿ ïðèáîðà. Ñòåíäîâûå/ ìîáèëüíûå ïðèáîðû Ñêàíèðóþò ñòàíäàðòíûé îáðàçåö îòðàæåíèÿ íèçêîãî ïîòîêà (íàïðèìåð, 5 % èëè 10 %, ñòàíäàðòíûé îáðàçåö ïîëèìåðà, ëåãèðîâàííîãî óãëåðîäîì) â ñîîòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿ- ìè èçãîòîâèòåëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðà â ïîäõîäÿùåì äèàïàçî- íå äëèí âîëí è ðàññ÷èòûâàþò ôîòîìåòðè÷åñêèé øóì êàê ñî- îòíîøåíèå ïèê ñèãíàëà/ïèê áàçîâîé ëèíèè. Ñêàíèðóþò ñòàíäàðòíûé îáðà- çåö ïðîïóñêàíèÿ âûñîêîãî ïîòî- êà (íàïðèìåð, 90 % èëè 99 %, ñòàíäàðòíûé îáðàçåö ïîëèìåðà, ëåãèðîâàííîãî óãëåðîäîì) â ñî- îòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿìè èçãîòîâèòåëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðà â ñîîòâåòñòâóþùåì äèàïàçîíå äëèí âîëí/âîëíîâûõ ÷èñåë è ðàññ÷èòûâàþò ôîòîìåòðè÷å- ñêèé øóì êàê ñîîòíîøåíèå ïèê ñèãíàëà/ïèê áàçîâîé ëèíèè. Òàáëèöà 2.1.2.34.-1. — (ïðîäîëæåíèå) ëåæàùåé ðàáîòû ïðèáîðà (ïðîâåðêà ïðàêòè÷íî- ñòè). Ïåðåä ñêàíèðîâàíèåì îáðàçöà ìîæåò ïîíà- äîáèòüñÿ ïðîâåäåíèå èñïûòàíèÿ ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû, à òàêæå äîëæíû áûòü ïðîâåðåíû õà- ðàêòåðèñòèêè ïðèáîðà, îêàçûâàþùèå âîçìîæ- íîå âëèÿíèå íà ðåçóëüòàò èçìåðåíèÿ (îáû÷íî ôîòîìåòðè÷åñêèé øóì è òî÷íîñòü óñòàíîâêè äëèí âîëí). ×àñòîòà ïðîâåäåíèÿ êàæäîé ïðîâåð- êè ðàáîòîñïîñîáíîñòè ïðèáîðà äîëæíà îñíîâû- âàòüñÿ íà îöåíêå ðèñêîâ ñ ó÷åòîì òèïà ïðèáîðà è óñëîâèé îêðóæàþùèé åãî ñðåäû. Íàïðèìåð, äëÿ ïðèáîðîâ, ýêñïëóàòèðóþùèõñÿ â íåáëàãî- ïðèÿòíûõ óñëîâèÿõ îêðóæàþùåé ñðåäû ñ êîëå- áàíèÿìè òåìïåðàòóðû è âëàæíîñòè, ìîãóò ïî- òðåáîâàòüñÿ ÷àñòûå ïðîâåðêè ðàáîòîñïîñîáíî- ñòè. Òàêæå íåîáõîäèìî ó÷èòûâàòü ñëó÷àè, êîãäà èçìåðèòåëüíàÿ ñèñòåìà íå ìîæåò áûòü èçâëå÷å- íà, íàïðèìåð, in-line çîíä èëè ïðîòî÷íàÿ êþ- âåòà.
Íåêîòîðûå ýëåìåíòû ïðèáîðà ìîãóò áûòü âûïîëíåíû ïî èíäèâèäóàëüíîìó çàêàçó, â òàêîì ñëó÷àå íåîáõîäèìà è àäåêâàòíàÿ ïðîâåðêà ðàáî- òîñïîñîáíîñòè. Ïðîâåðêà è êàëèáðîâêà øêàëû äëèí âîëí èëè âîëíîâûõ ÷èñåë (êðîìå ïðèáîðà, îñíàùåííîãî ôèëüòðîì).Èñïîëüçóåìóþ øêàëó äëèí âîëí, îáû÷íî â îáëàñòè ìåæäó 780 íì è 2500 íì (îò 12 800 ñì–1 äî 4000 ñì–1) èëè â òðåáóåìîé ñïåê- òðàëüíîé îáëàñòè, ïðîâåðÿþò ñ ïîìîùüþ îäíî- ãî èëè áîëåå ïîäõîäÿùèõ ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ äëÿ îïðåäåëåíèÿ äëèí âîëí, êîòîðûå èìåþò õà- ðàêòåðèñòè÷åñêèå ìàêñèìóìû èëè ìèíèìóìû â äèàïàçîíå èñïîëüçóåìûõ äëèí âîëí. Ïîäõîäÿ- ùèìè ñòàíäàðòíûìè îáðàçöàìè ÿâëÿþòñÿ íà- ïðèìåð, ìåòèëåíõëîðèä Ð, òàëüê Ð, ëàìïû ñ ðå- ôåðåíñíûìè äëèíàìè âîëí èëè ñìåñü îêñèäîâ ðåäêîçåìåëüíûõ ìåòàëëîâ. Ìîãóò áûòü èñïîëü- çîâàíû è äðóãèå ïîäõîäÿùèå ñòàíäàðòíûå îá- ðàçöû. Ñíèìàþò ñïåêòð è èçìåðÿþò ïîëîæåíèÿ íå ìåíåå 3 ïèêîâ, íàõîäÿùèõñÿ â ðàáî÷åì äèà- ïàçîíå. Ïîäõîäÿùèå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû îê- ñèäîâ ðåäêîçåìåëüíûõ ìåòàëëîâ äîñòóïíû îò Íàöèîíàëüíîãî Èíñòèòóòà Ñòàíäàðòîâ è Òåõíî- ëîãèé (NIST). Ïðèáîðû ñ Ôóðüå-ïðåîáðàçîâàòå- ëåì èìåþò ëèíåéíûé äèàïàçîí ÷àñòîò, ïîýòîìó äîñòàòî÷íî ñåðòèôèêàöèè äëèíû âîëíû íà îä- íîé ÷àñòîòå. Ïðîâåðêà è êàëèáðîâêà ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè. Ïðîâåðêà ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåé- íîñòè ïðîâîäèòñÿ ñ ïîìîùüþ íàáîðà ñòàíäàðò- íûõ îáðàçöîâ ïðîïóñêàíèÿ èëè îòðàæåíèÿ ñ èç- âåñòíûìè ïðîöåíòíûìè ïîêàçàòåëÿìè ïðîïóñ- êàíèÿ èëè îòðàæåíèÿ. Äëÿ èçìåðåíèÿ îòðàæåíèÿ äîñòóïíû ñòàíäàðòû ïîëèìåðîâ ëåãèðîâàííûõ óãëåðîäîì. Óäîñòîâåðÿþòñÿ, ÷òî ïîãëîùåíèå èñïîëüçóåìûõ ìàòåðèàëîâ ÿâëÿåòñÿ ïîäõîäÿ- ùèì äëÿ ïðåäïîëàãàåìîãî ëèíåéíîãî ðàáî÷åãî äèàïàçîíà ìåòîäèêè. Ïåðâîíà÷àëüíûå çíà÷åíèÿ ïîãëîùåíèÿ ìîãóò ñëóæèòü â êà÷åñòâå ñòàíäàðò- íûõ çíà÷åíèé ïðè ïîñëåäóþùèõ ïðîâåðêàõ ôî- òîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè. Ìîäåëè íåëèíåé- íûõ êàëèáðîâîê è, ñëåäîâàòåëüíî, íåëèíåéíûå îòêëèêè ÿâëÿþòñÿ äîïóñòèìûìè ïðè äåìîíñò- ðàöèè ïîëüçîâàòåëåì ïîíèìàíèÿ äàííîãî ïðî- öåññà. Ñïåêòðû ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ îòðàæåíèÿ è ïðîïóñêàíèÿ ïîäâåðæåíû âàðèàáåëüíîñòè âñëåäñòâèå ðàçëè÷èé ýêñïåðèìåíòàëüíûõ óñëî- âèé, â êîòîðûõ ïðîèçâîäèëàñü èõ çàâîäñêàÿ êà- ëèáðîâêà, è óñëîâèÿìè, â êîòîðûõ îíè âïîñëåä- ñòâèè èñïîëüçîâàëèñü. Ïîýòîìó ïðîöåíòíûå çíà÷åíèÿ êîýôôèöèåíòîâ îòðàæåíèÿ, ïðåäîñ- òàâëÿåìûå âìåñòå ñ íàáîðîì êàëèáðîâî÷íûõ ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ, ìîãóò áûòü íå ïðèìåíè- ìû äëÿ ïîëó÷åíèÿ «àáñîëþòíîé» êàëèáðîâêè 92 Ðåæèì èçìåðåíèÿ Îòðàæåíèå Ïðîïóñêàíèå-îòðàæåíèå Ïðîïóñêàíèå Ïðèáîðû äëÿ ïðîèçâîäñòâåí- íîãî ïðîöåññà Êàê îïèñàíî âûøå èëè, ïðè îòñóòñòâèè òàêîé ïðàêòè÷åñêîé âîçìîæíîñòè, äëÿ ïðîâåðêè øóìà è ñïåöèôèöèðîâàííûõ õàðàêòåðèñòèê èñïîëüçóþò ñòàíäàðòíûé îáðàçåö, âñòðîåí- íûé â ïðèáîð. Êàê îïèñàíî âûøå èëè, ïðè îòñóòñòâèè òàêîé ïðàêòè÷å- ñêîé âîçìîæíîñòè, äëÿ ïðî- âåðêè øóìà è ñïåöèôèöèðî- âàííûõ õàðàêòåðèñòèê èñ- ïîëüçóþò ñòàíäàðòíûé îáðà- çåö, âñòðîåííûé â ïðèáîð. (1)Ïðîâåðêà ôîòîìåòðè÷åñêîé ëèíåéíîñòè è Ïðîâåðêà ôîòîìåòðè÷åñêîãî øóìà íå òðåáóåòñÿ äëÿ ïðèáîðîâ, èñïîëüçóþùèõñÿ äëÿ ïðîñòûõ èñïûòàíèé íà ïîäëèííîñòü, äëÿ êîòîðûõ ôîòîìåòðè÷åñêîå ïîãëîùåíèå íå èñ- ïîëüçóåòñÿ êàê ÷àñòü ñòðàòåãèè ìîäåëèðîâàíèÿ (íàïðèìåð, ïðîñòàÿ êîððåëÿöèÿ ñ ïîãëîùàþùèìè äëèíàìè âîëí). Òàáëèöà 2.1.2.34.-1. — (îêîí÷àíèå) êîíêðåòíîãî ïðèáîðà. Îäíàêî ïðè óñëîâèè îò- ñóòñòâèÿ èçìåíåíèé ôèçè÷åñêèõ èëè õèìè÷å- ñêèõ ñâîéñòâ ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ è èñïîëüçî- âàíèÿ òàêîãî æå ôîíîâîãî ìàòåðèàëà ñðàâíåíèÿ, êàê è ïðè ïîëó÷åíèè ñåðòèôèöèðîâàííûõ çíà- ÷åíèé, ïîñëåäóþùèå èçìåðåíèÿ ýòèõ ñòàíäàðò- íûõ îáðàçöîâ ïðè èäåíòè÷íûõ óñëîâèÿõ, âêëþ- ÷àÿ òî÷íîå ïîëîæåíèå ïðîáû, èñïîëüçóþòñÿ äëÿ îöåíêè ïåðèîäà ñîõðàíåíèÿ ñòàáèëüíîñòè ôîòî- ìåòðè÷åñêîãî îòêëèêà.
Îòêëîíåíèå ±2 % îò çíà- ÷åíèÿ ïîãëîùåíèÿ ÿâëÿåòñÿ ïðèåìëåìûì äëÿ äëèòåëüíîé ñòàáèëüíîñòè; äàííàÿ ïðîâåðêà íå- îáõîäèìà òîëüêî â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ ñïåê- òðîâ áåç ïðåäâàðèòåëüíîé îáðàáîòêè.  òàáëèöå 2.1.2.34.-1 ïðèâåäåíû ðåêîìåíäî- âàííûå óñëîâèÿ äëÿ ïðîâåðêè ïðèãîäíîñòè ïðè- áîðà äëÿ ðàçëè÷íûõ ðåæèìîâ èçìåðåíèÿ. ÊÀ×ÅÑÒÂÅÍÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ (ÈÄÅÍÒÈÔÈÊÀÖÈß È ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ) Ñîçäàíèå áèáëèîòåêè ñòàíäàðòíûõ ñïåê- òðîâ. Ñíèìàþò ñïåêòðû ïîäõîäÿùåãî êîëè÷åñò- âà ðåïðåçåíòàòèâíûõ îáðàçöîâ èçâåñòíîãî âå- ùåñòâà ñ ïðîñëåæèâàåìûìè ñâîéñòâàìè è òè- ïè÷íîé èçìåí÷èâîñòüþ (íàïðèìåð, ïî ôîðìå òâåðäîãî òåëà, ðàçìåðó ÷àñòèö è ò.ï.). Áèáëèîòå- êè ñîçäàþòñÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåïðåçåíòàòèâ- íûõ îáðàçöîâ â ïîäõîäÿùèõ óñëîâèÿõ îêðóæàþ- ùåé ñðåäû. Íàáîð ïîëó÷åííûõ ñïåêòðîâ ïðåä- ñòàâëÿåò ñîáîé èíôîðìàöèþ, êîòîðàÿ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà äëÿ èäåíòèôèêàöèè àíàëè- çèðóåìîãî îáðàçöà. Êîëëåêöèÿ ñïåêòðîâ â áèáëèîòåêå ìîæåò áûòü ïðåäñòàâëåíà ðàçëè÷íûìè ñïîñîáàìè, îï- ðåäåëÿåìûìè ìàòåìàòè÷åñêèì ìåòîäîì, èñ- ïîëüçóåìûì äëÿ èäåíòèôèêàöèè. Òàêèìè ñïîñî- áàìè ìîãóò áûòü: – âñå èíäèâèäóàëüíûå ñïåêòðû, ïðåäñòàâ- ëÿþùèå âåùåñòâî; – óñðåäíåííûé ñïåêòð èçìåðåííûõ ñåðèé äëÿ êàæäîãî õèìè÷åñêîãî âåùåñòâà; – ïðè íåîáõîäèìîñòè, îïèñàíèå èçìåí÷èâî- ñòè â ñïåêòðàõ âåùåñòâà. Êîëè÷åñòâî ñïåêòðîâ âåùåñòâ â áèáëèîòåêå çàâèñèò îò åå ñïåöèôè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ. Âñå ñïåêòðû â èñïîëüçóåìîé áèáëèîòåêå äîëæíû èìåòü îäèíàêîâûå: – ñïåêòðàëüíûé äèàïàçîí è êîëè÷åñòâî èñ- õîäíûõ òî÷åê; – òåõíèêó èçìåðåíèÿ; – ïðåäâàðèòåëüíóþ îáðàáîòêó äàííûõ. Åñëè ñîçäàþòñÿ ïîäãðóïïû (ïîäáèáëèîòå- êè), òî äëÿ êàæäîé ãðóïïû íåçàâèñèìî ïðèìåíÿ- þòñÿ âûøåóïîìÿíóòûå êðèòåðèè. Ïîäáèáëèîòå- êè âàëèäèðóþò èíäèâèäóàëüíî. Èñõîäíûå ñïåê- òðàëüíûå äàííûå äëÿ ïîäãîòîâêè áèáëèîòåêè ñïåêòðîâ äîëæíû áûòü àðõèâèðîâàíû. Ïðè ëþ- áîì ìàòåìàòè÷åñêîì ïðåîáðàçîâàíèè ñëåäóåò ñîáëþäàòü îñòîðîæíîñòü, òàê êàê â äàííûå ìî- ãóò áûòü âíåñåíû àðòåôàêòû èëè ìîæåò áûòü ïîòåðÿíà ñóùåñòâåííàÿ èíôîðìàöèÿ (íåîáõîäè- ìàÿ äëÿ ìåòîäîâ êâàëèôèêàöèè). Ïðèãîäíîñòü èñïîëüçóåìîãî àëãîðèòìà äîëæíà áûòü ïîäòâåð- æäåíà óñïåøíîé âàëèäàöèåé ìåòîäèêè, è âî âñåõ ñëó÷àÿõ íåîáõîäèìî äàòü ðàöèîíàëüíîå îáîñíîâàíèå èñïîëüçîâàíèÿ ìàòåìàòè÷åñêîãî ïðåîáðàçîâàíèÿ. Ïðÿìîå ñðàâíåíèå ñïåêòðîâ èñïûòóåìîãî âåùåñòâà è ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà. Åñëè ïî- çâîëÿåò ñïåöèôè÷íîñòü, äëÿ öåëåé êà÷åñòâåí- íîé õèìè÷åñêîé èëè ôèçè÷åñêîé èäåíòèôèêà- öèè èñïîëüçîâàíèå ñïåêòðàëüíîé áèáëèîòåêè ñðàâíåíèÿ ìîæåò íå òðåáîâàòüñÿ. Îöåíêà äàííûõ. Ïðîâîäèòñÿ ïðÿìîå ñðàâ- íåíèå ñïåêòðà èñïûòóåìîãî âåùåñòâà ñ èíäèâè- äóàëüíûì èëè ñðåäíèì ñòàíäàðòíûì ñïåêòðîì âñåõ âåùåñòâ â áàçå äàííûõ íà îñíîâå èõ ìàòå- ìàòè÷åñêîé êîððåëÿöèè èëè äðóãèõ ñîîòâåòñò- âóþùèõ àëãîðèòìîâ.  àëãîðèòìå, ïðèìåíÿþ- ùåìñÿ äëÿ öåëåé èäåíòèôèêàöèè, ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí íàáîð èçâåñòíûõ ñðåäíèõ ñòàí- äàðòíûõ ñïåêòðîâ è èçìåí÷èâîñòü ýòèõ ñðåäíèõ ñïåêòðîâ; êðîìå òîãî, ìîæíî äîáèòüñÿ âèçóàëü- íîãî ñðàâíåíèÿ ïóòåì íàëîæåíèÿ ñïåêòðàëüíûõ äàííûõ åñëè ïðèñóòñòâóåò ñïåöèôè÷íîñòü. Ñó- ùåñòâóþò ðàçëè÷íûå àëãîðèòìû, òàêèå êàê àíà- ëèç ãëàâíûõ êîìïîíåíòîâ, êëàñòåðíûé àíàëèç, ìÿãêîå íåçàâèñèìîå ìîäåëèðîâàíèå ïî àíàëî- ãèè êëàññîâ. Íàäåæíîñòü ìåòîäèêè, âûáðàííîé äëÿ êîíêðåòíîãî èñïîëüçîâàíèÿ, äîëæíà áûòü âàëèäèðîâàíà. Âàëèäàöèÿ ìîäåëè. Ìåòîäèêè èäåíòèôèêà- öèè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðÿìîãî ñðàâíåíèÿ ñïåê- òðîâ äîëæíû áûòü âàëèäèðîâàíû â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðîöåäóðàìè âàëèäàöèè ìåòîäèêè èäåíòèôè- êàöèè. Äëÿ êà÷åñòâåííûõ ìåòîäèê âàëèäàöèîí- íûìè õàðàêòåðèñòèêàìè ÿâëÿþòñÿ ðîáàñòíîñòü è ñïåöèôè÷íîñòü. ÀÍÀËÈÇ ÏÐÅÄÅËÜÍÎÃÎ ÑÎÄÅÐÆÀÍÈß Îòíîñèòåëüíîå ñðàâíåíèå ñïåêòðîâ.
Äëÿ öåëåé òàêîãî àíàëèçà ïðåäåëüíîãî ñîäåðæàíèÿ, êàê ìàêñèìàëüíàÿ èëè ìèíèìàëüíàÿ îïòè÷åñêàÿ 93 ïëîòíîñòü, ïðè êîòîðûõ ïîãëîùàåò àíàëèò, êî- ãäà ïðîèñõîäèò ñðàâíåíèå ñïåêòðîâ, êàëèáðîâêà íå òðåáóåòñÿ. Êðîìå òîãî, äëÿ êîíòðîëÿ êîíå÷- íîé òî÷êè ñóøêè, â ïðåäåëàõ ñïåöèôè÷íûõ äëèí âîëí ïîãëîùåíèÿ, ìîæåò áûòü èñïîëüçî- âàí ïîäõîä, êàê â êà÷åñòâåííîì àíàëèçå. Íåîá- õîäèìî ïðîäåìîíñòðèðîâàòü ïðèãîäíîñòü ñïåê- òðàëüíîãî äèàïàçîíà è ïðåäâàðèòåëüíîé îáðà- áîòêè äàííûõ (ïðè åå èñïîëüçîâàíèè) äëÿ íàìå÷åííûõ öåëåé. Ñïåöèôè÷íîñòü. Äëÿ ïðåäåëüíîãî èñïûòà- íèÿ äîëæíà áûòü ïðîäåìîíñòðèðîâàíà îòíîñè- òåëüíàÿ îòëè÷èòåëüíàÿ ñïîñîáíîñòü. Îáúåì èñ- ïûòàíèé ïî îïðåäåëåíèþ ñïåöèôè÷íîñòè çàâè- ñèò îò ïðèìåíåíèÿ è êîíòðîëèðóåìûõ ðèñêîâ. Èçìåí÷èâîñòü â êîíöåíòðàöèÿõ ìàòðèêñà â ïðå- äåëàõ ðàáî÷åãî äèàïàçîíà íå äîëæíà îêàçûâàòü âëèÿíèå íà èçìåðåíèå. ÀÍÀËÈÇ ÒÐÅÍÄΠÎòíîñèòåëüíîå ñðàâíåíèå ñïåêòðîâ. Êà- ëèáðîâêà íå îáÿçàòåëüíà ïðè ñðàâíåíèè ñïåê- òðîâ ñ öåëüþ àíàëèçà òðåíäîâ, òàêèõ êàê ïîäõîä ïîäâèæíîãî áëîêà äëÿ ðàñ÷åòà ñòàòèñòè÷åñêèõ ïàðàìåòðîâ, òàêèõ êàê ñðåäíåå, ìåäèàííîå è ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå. Íàïðèìåð, äëÿ êîí- òðîëÿ îäíîðîäíîñòè ñìåñè ñ èñïîëüçîâàíèåì ÁÈÊ ñïåêòðîñêîïèè ïðèíÿò òàêîé ìåòîä àíàëè- çà äàííûõ. Äëÿ àíàëèçà òðåíäîâ äîëæíû èñ- ïîëüçîâàòüñÿ ïîäõîäÿùèå ñïåêòðàëüíûå äèàïà- çîíû è àëãîðèòìû. Ñïåöèôè÷íîñòü. Äîëæíà áûòü ïðîäåìîíñò- ðèðîâàíà îòíîñèòåëüíàÿ îòëè÷èòåëüíàÿ ñïîñîá- íîñòü àíàëèçà òðåíäîâ. Îáúåì èñïûòàíèé ïî îïðåäåëåíèþ ñïåöèôè÷íîñòè çàâèñèò îò ïðèìå- íåíèÿ è êîíòðîëèðóåìûõ ðèñêîâ. Èçìåí÷èâîñòü â êîíöåíòðàöèÿõ ìàòðèêñà â ïðåäåëàõ ðàáî÷åãî äèàïàçîíà íå äîëæíà îêàçûâàòü âëèÿíèå íà àíà- ëèç òðåíäîâ. ÊÎËÈ×ÅÑÒÂÅÍÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ Ñîçäàíèå áèáëèîòåêè ñïåêòðîâ ñðàâíå- íèÿ äëÿ êàëèáðîâî÷íîé ìîäåëè. Êàëèáðîâ- êà — ïðîöåññ ïîñòðîåíèÿ ìàòåìàòè÷åñêîé ìî- äåëè, ñâÿçûâàþùåé îòêëèê, ïîëó÷åííûé ïðè ñêàíèðîâàíèè îáðàçöà àíàëèòè÷åñêèì ïðèáî- ðîì, ñî ñâîéñòâàìè îáðàçöîâ. Ìîæåò èñïîëüçî- âàòüñÿ ëþáàÿ ìîäåëü êàëèáðîâêè, êîòîðàÿ ìî- æåò áûòü ÿñíî îïèñàíà òî÷íûì ìàòåìàòè÷åñêèì âûðàæåíèåì è îáåñïå÷èâàåò ïîëó÷åíèå ñîîòâåò- ñòâóþùèõ ðåçóëüòàòîâ. Ðåãèñòðèðóþò ñïåêòðû ñîîòâåòñòâóþùåãî êîëè÷åñòâà ðåïðåçåíòàòèâ- íûõ îáðàçöîâ ñ èçâåñòíûìè èëè â ïîñëåäñòâèè óñòàíàâëèâàåìûìè çíà÷åíèÿìè ïîêàçàòåëÿ (íà- ïðèìåð, ñîäåðæàíèå âîäû) ïî âñåìó èçìåðÿåìî- ìó äèàïàçîíó. Êîëè÷åñòâî îáðàçöîâ äëÿ êàëèá- ðîâêè áóäåò çàâèñåòü îò ñëîæíîñòè ìàòðèöû îá- ðàçöà è îêàçûâàåìûõ âîçäåéñòâèé (íàïðèìåð, òåìïåðàòóðà, ðàçìåð ÷àñòèö è ò.ï.). Âñå îáðàçöû äîëæíû äàâàòü êîëè÷åñòâåííûå ðåçóëüòàòû â ïðåäåëàõ êàëèáðîâî÷íîãî èíòåðâàëà, îïðåäå- ëåííîãî â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðåäïîëàãàåìûì íà- çíà÷åíèåì ìåòîäèêè. Îáû÷íî èñïîëüçóþòñÿ ìî- äåëü ìíîæåñòâåííîé ëèíåéíîé ðåãðåññèè, ðåã- ðåññèÿ ãëàâíûõ êîìïîíåíò è ìåòîä ÷àñòíûõ íàèìåíüøèõ êâàäðàòîâ. Äëÿ êàëèáðîâî÷íûõ ìî- äåëåé, ïîëó÷åííûõ ìåòîäîì ðåãðåññèè ãëàâíûõ êîìïîíåíò è ìåòîäîì ÷àñòíûõ íàèìåíüøèõ êâàäðàòîâ, ïî êîýôôèöèåíòàì ðåãðåññèè è/èëè âåñîâûì êîýôôèöèåíòàì ìîæíî ïîñòðîèòü ãðà- ôèê è îáëàñòè íàèáîëüøèõ êîýôôèöèåíòîâ èëè âåñîâûõ êîýôôèöèåíòîâ ñîïîñòàâèòü ñî ñïåê- òðîì àíàëèòà. Äèàãðàììû ðàñ÷åòíîé îñòàòî÷- íîé îøèáêè ñóììû êâàäðàòîâ ñïîñîáñòâóþò îï- òèìèçàöèè ÷èñëà ôàêòîðîâ ìåòîäà ðåãðåññèè ãëàâíûõ êîìïîíåíò è ìåòîäà ÷àñòíûõ íàèìåíü- øèõ êâàäðàòîâ. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ îáðàáîòêà äàííûõ. Âû- áîð äëèíû âîëíû èëè èñêëþ÷åíèå íåêîòîðûõ äèàïàçîíîâ äëèí âîëí ìîãóò óâåëè÷èòü ïðà- âèëüíîñòü è ðîáàñòíîñòü êàëèáðîâî÷íûõ ìîäå- ëåé. Ê äàííûì ìîæåò áûòü ïðèìåíåíî ñæàòèå äëèí âîëí (óñðåäíåíèå äëèí âîëí). Ïàðàìåòðû âàëèäàöèè ìîäåëè. Âàëèäàöè- îííûå õàðàêòåðèñòèêè ìåòîäèê íà îñíîâå ñïåê- òðîñêîïèè â ÁÈÊ îáëàñòè, àíàëîãè÷íû ïàðàìåò- ðàì âàëèäàöèè ëþáîé äðóãîé àíàëèòè÷åñêîé ìåòîäèêè.
Ñïåöèôè÷åñêèå êðèòåðèè ïðèåìëå- ìîñòè äëÿ êàæäîãî ïàðàìåòðà âàëèäàöèè äîëæ- íû ñîîòâåòñòâîâàòü ïðåäïîëàãàåìîìó íàçíà÷å- íèþ ìåòîäèêè. Äëÿ êîëè÷åñòâåííûõ ìåòîäèê âàëèäàöèîííûìè õàðàêòåðèñòèêàìè ÿâëÿþòñÿ ïðàâèëüíîñòü, ëèíåéíîñòü, ïðåöèçèîííîñòü (ñõîäèìîñòü è âíóòðèëàáîðàòîðíàÿ ïðåöèçèîí- íîñòü), ðîáàñòíîñòü è ñïåöèôè÷íîñòü. ÏÎÑËÅÄÓÞÙÀß ÎÖÅÍÊÀ ÌÎÄÅËÈ Âàëèäèðîâàííûå äëÿ èñïîëüçîâàíèÿ ÁÈÊ ìîäåëè ïîäëåæàò ïîñëåäóþùåé ðåãóëÿðíîé îöåíêå ïðèãîäíîñòè è ìîíèòîðèíãó ïàðàìåòðîâ âàëèäàöèè. 94 ÏÅÐÅÍÎÑ ÁÀÇ ÄÀÍÍÛÕ Ïðè ïåðåíîñå áàç äàííûõ íà äðóãîé ïðèáîð äîëæíû áûòü ó÷òåíû ñïåêòðàëüíûé äèàïàçîí, êîëè÷åñòâî ýêñïåðèìåíòàëüíûõ òî÷åê, ñïåê- òðàëüíîå ðàçðåøåíèå è äðóãèå ïàðàìåòðû. Äëÿ äåìîíñòðàöèè òîãî, ÷òî ìîäåëü îñòàåòñÿ ïðè- ãîäíîé äëÿ íîâîé áàçû äàííûõ èëè íîâîãî ïðè- áîðà, â äàëüíåéøåì äîëæíû áûòü ïðåäóñìîòðå- íû ïðîöåäóðû è óñòàíîâëåíû ñîîòâåòñòâóþùèå êðèòåðèè. 201020035-2019 2.1.2.35. Îáùèé îðãàíè÷åñêèé óãëåðîä â âîäå äëÿ ôàðìàöåâòè- ÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ Îïðåäåëåíèå ñîäåðæàíèÿ îáùåãî îðãàíè÷å- ñêîãî óãëåðîäà (ÎÎÓ) ÿâëÿåòñÿ êîñâåííûì ìåòî- äîì îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ îðãàíè÷åñêèõ âå- ùåñòâ â âîäå äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìåíå- íèÿ. Îïðåäåëåíèå ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ ìîæåò òàêæå èñïîëüçîâàòüñÿ ïðè êîíòðîëå âûïîëíåíèÿ ðàçëè÷íûõ îïåðàöèé â ïðîèçâîäñòâå ëåêàðñò- âåííûõ ñðåäñòâ. Ïîñêîëüêó äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ ìîãóò ïðèìåíÿòüñÿ ðàçëè÷íûå ìåòîäèêè, â äàííîé îáùåé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå ïðèâåäå- íû íå îïèñàíèÿ ìåòîäèê, à èõ êâàëèôèêàöèÿ è èíòåðïðåòàöèÿ ðåçóëüòàòîâ â ïðåäåëüíûõ èñïû- òàíèÿõ. Èñïûòàíèÿ ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ ïðîâî- äÿò ÷åðåç îïðåäåëåííûå èíòåðâàëû âðåìåíè â çàâèñèìîñòè îò ÷àñòîòû èçìåðåíèé; ðàñòâîð ãî- òîâÿò ñ èñïîëüçîâàíèåì ëåãêîîêèñëÿþùåéñÿ ñóáñòàíöèè (íàïðèìåð, ñàõàðîçû) ñ òàêîé êîí- öåíòðàöèåé, ÷òîáû ñèãíàë ïðèáîðà ñîîòâåòñòâî- âàë èçìåðÿåìîìó ïðåäåëó ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ. Ïðèãîäíîñòü ñèñòåìû ïðîâåðÿþò ñ èñïîëüçîâà- íèåì òðóäíîîêèñëÿþùåéñÿ ñóáñòàíöèè (íàïðè- ìåð, 1,4-áåíçîõèíîíà). Ðàçíûå òèïû ïðèáîðîâ äëÿ îïðåäåëåíèÿ ÎÎÓ â âîäå äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìåíå- íèÿ, êàê ïðàâèëî, ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ïîëíîãî îêèñëåíèÿ îðãàíè÷åñêèõ ìîëåêóë â îáðàçöå âîäû äî óãëåðîäà äèîêñèäà ñ ïîñëåäóþùèì èç- ìåðåíèåì åãî êîëè÷åñòâà, èñïîëüçóåìîãî çàòåì äëÿ ðàñ÷åòà êîíöåíòðàöèè óãëåðîäà â âîäå. Èñïîëüçóåìûé ïðèáîð â ïðîöåññå ðàáîòû äîëæåí ðàçëè÷àòü îðãàíè÷åñêèé óãëåðîä è íåîð- ãàíè÷åñêèé óãëåðîä, êîòîðûé ïðèñóòñòâóåò â âèäå êàðáîíàòîâ. Ýòî ìîæåò îáåñïå÷èâàòüñÿ ïó- òåì îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà íåîðãàíè÷åñêîãî óãëåðîäà è âû÷èòàíèåì åãî èç êîëè÷åñòâà îáùå- ãî óãëåðîäà èëè óäàëåíèåì íåîðãàíè÷åñêîãî óã- ëåðîäà èç îáðàçöà ïðè ïîìîùè ïðîäóâàíèÿ ïåðåä îêèñëåíèåì.  ïðîöåññå ïðîäóâàíèÿ èç èñïûòóåìîãî îáðàçöà ìîãóò óäàëÿòüñÿ è îðãàíè- ÷åñêèå ìîëåêóëû, íî ÷àñòü ñâÿçàííîãî ñ íèìè óãëåðîäà â âîäå äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìå- íåíèÿ íåçíà÷èòåëüíà. Ïðèáîð. Èñïîëüçóþò îòêàëèáðîâàííûé ïðè- áîð, óñòàíîâëåííûé â ðåæèì «on-line» èëè «off-line». Ïðèãîäíîñòü ñèñòåìû ïðîâåðÿþò, êàê îïèñàíî íèæå, ÷åðåç îïðåäåëåííûé ïðîìåæóòîê âðåìåíè. Ïðèáîð äîëæåí èìåòü ïðåäåë îáíàðó- æåíèÿ óãëåðîäà 0,05 ìã/ë èëè ìåíåå, ñîîòâåòñò- âåííî ïàñïîðòó èçãîòîâèòåëÿ ïðèáîðà. Âîäà äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ. Èñ- ïîëüçóþò âîäó âûñîêîî÷èùåííóþ, ñîîòâåòñò- âóþùóþ ñëåäóþùèì òðåáîâàíèÿì: – ýëåêòðîïðîâîäíîñòü íå áîëåå 1,0 ìêÑì·ñì–1 ïðè òåìïåðàòóðå 25 °Ñ; – ñîäåðæàíèå îáùåãî îðãàíè÷åñêîãî óãëå- ðîäà: íå áîëåå 0,1 ìã/ë.  çàâèñèìîñòè îò òèïà èñïîëüçóåìîãî ïðè- áîðà êðèòè÷åñêèì ïàðàìåòðîì ìîæåò áûòü òàê- æå ñîäåðæàíèå â âîäå òÿæåëûõ ìåòàëëîâ èëè ìåäè, ÷òî äîëæíî áûòü óêàçàíî â èíñòðóêöèè èçãîòîâèòåëÿ ïðèáîðà. Ïîäãîòîâêà ïîñóäû. Èñïîëüçóþò ïîñóäó, òùàòåëüíî âûìûòóþ ñ ïîìîùüþ ìåòîäà, ïîçâî- ëÿþùåãî óäàëèòü îðãàíè÷åñêèå âåùåñòâà.
Äëÿ ïîñëåäíåãî ïðîìûâàíèÿ èñïîëüçóþò âîäó äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ. Ðàñòâîð ñðàâíåíèÿ. Ñàõàðîçó Ð, ïðåäâàðè- òåëüíî âûñóøåííóþ ïðè òåìïåðàòóðå 105 °Ñ â òå÷åíèå 3 ÷, ðàñòâîðÿþò â âîäå äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ, ïîëó÷àÿ ðàñòâîð, ñîäåðæà- ùèé 1,19 ìã/ë ñàõàðîçû (0,50 ìã/ë óãëåðîäà). Èñïûòóåìûé ðàñòâîð. Èñïûòóåìóþ âîäó ñîáèðàþò, èñêëþ÷àÿ ìèíèìàëüíîå âîçäóøíîå ïðîñòðàíñòâî, â âîçäóõîíåïðîíèöàåìûé êîí- òåéíåð, èñïîëüçóÿ âñå âîçìîæíûå ìåðû äëÿ ïðå- äîòâðàùåíèÿ çàãðÿçíåíèÿ. Èñïûòàíèå ïðîâîäÿò ñ ìèíèìàëüíîé çàäåðæêîé ïî âðåìåíè ñ öåëüþ óìåíüøåíèÿ âîçìîæíîãî çàãðÿçíåíèÿ âîäû îò êîíòåéíåðà è åãî óêóïîðî÷íîãî ìàòåðèàëà. Ðàñòâîð äëÿ ïðîâåðêè ïðèãîäíîñòè ñèñòå- ìû. Ãîòîâÿò ðàñòâîð 0,75 ìã/ë 1,4-áåíçîõèíîíà Ð â âîäå äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ (0,50 ìã/ë óãëåðîäà). Êîíòðîëüíàÿ âîäà äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåð- æàíèÿ ÎÎÓ. Èñïîëüçóþò âîäó äëÿ îïðåäåëåíèÿ 95 ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ, ïîëó÷åííóþ îäíîâðåìåííî ñ âîäîé äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ è ðàñòâîðà äëÿ ïðîâåðêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Êîíòðîëüíûå ðàñòâîðû. Êðîìå êîíòðîëü- íîé âîäû äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ ãî- òîâÿò ïîäõîäÿùèå êîíòðîëüíûå ðàñòâîðû èëè äðóãèå ðàñòâîðû, íåîáõîäèìûå äëÿ âîññòàíîâ- ëåíèÿ áàçîâîé ëèíèè èëè êîððåêòèðîâàíèÿ êà- ëèáðîâêè â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé èçãîòî- âèòåëÿ ïðèáîðà; èñïîëüçóÿ êîíòðîëüíûå ðàñòâî- ðû, óñòàíàâëèâàþò íîëü ïðèáîðà. Ïðîâåðêà ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Ïðîâîäÿò èñïûòàíèÿ óêàçàííûõ ðàñòâîðîâ è çàïèñûâàþò ñèãíàëû ïðèáîðà: âîäà äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåð- æàíèÿ ÎÎÓ, ðàñòâîð ñðàâíåíèÿ, ðàñòâîð äëÿ ïðîâåðêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Ýôôåêòèâ- íîñòü ñèãíàëîâ, â ïðîöåíòàõ, ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: r r r r ss w s w - - ×100, ãäå: rw — ñèãíàë ïðèáîðà äëÿ âîäû äëÿ îïðåäå- ëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÎÎÓ; rs — ñèãíàë ïðèáîðà äëÿ ðàñòâîðà ñðàâíå- íèÿ; rss — ñèãíàë ïðèáîðà äëÿ ðàñòâîðà äëÿ ïðîâåðêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Ñèñòåìà ñ÷èòàåòñÿ ïðèãîäíîé, åñëè ýôôåê- òèâíîñòü ñèãíàëà ïðèáîðà ñîñòàâëÿåò íå ìåíåå 85 % è íå áîëåå 115 % îò òåîðåòè÷åñêîãî ñèãíà- ëà. Ìåòîäèêà. Çàïèñûâàþò ñèãíàë(ru) äëÿ èñïû- òóåìîãî ðàñòâîðà. Èñïûòóåìûé ðàñòâîð âûäåð- æèâàåò èñïûòàíèå, åñëè çíà÷åíèå ru íå ïðåâû- øàåò çíà÷åíèå rs – rw. Äàííàÿ ìåòîäèêà ìîæåò áûòü âûïîëíåíà â ðåæèìå «on-line» íà ïðèáîðå, êîòîðûé ñîîòâåò- ñòâóþùèì îáðàçîì îòêàëèáðîâàí è ñîîòâåòñò- âóåò òðåáîâàíèÿì ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Âû- áðàííîå ìåñòî ðàñïîëîæåíèÿ ïðèáîðà äîëæíî îáåñïå÷èâàòü ðåïðåçåíòàòèâíîñòü ïîêàçàíèé ïðèáîðà â îòíîøåíèè èñïîëüçóåìîé âîäû. 201020036-2019 2.1.2.36. Õðîìàòîãðàôè÷åñêèå ìåòîäû ðàçäåëåíèÿ Õðîìàòîãðàôè÷åñêèìè íàçûâàþò ìíîãîñòà- äèéíûå ìåòîäû ðàçäåëåíèÿ, â êîòîðûõ êîìïî- íåíòû îáðàçöà ðàñïðåäåëÿþòñÿ ìåæäó äâóìÿ ôàçàìè (íåïîäâèæíîé è ïîäâèæíîé). Íåïîä- âèæíàÿ ôàçà ìîæåò áûòü òâåðäûì âåùåñòâîì, æèäêîñòüþ, íàíåñåííîé íà òâåðäûé íîñèòåëü, èëè ãåëåì. Íåïîäâèæíàÿ ôàçà ìîæåò ïîìåùàòü- ñÿ â êîëîíêó, íàíîñèòüñÿ â âèäå òîíêîãî ñëîÿ èëè ïëåíêè è ò.ä. Ïîäâèæíàÿ ôàçà ìîæåò áûòü ãàçîì, æèäêîñòüþ èëè ñâåðõêðèòè÷åñêèì ãàçîì (ôëþèäîì). Ðàçäåëåíèå ìîæåò áûòü îñíîâàíî íà àäñîðáöèè, ðàñïðåäåëåíèè (ðàçäåëåíèè) ìàññ, èîííîì îáìåíå è ò.ä. èëè íà ðàçëè÷èÿõ â ôèçè- êî-õèìè÷åñêèõ ñâîéñòâàõ ìîëåêóë, òàêèõ, êàê ðàçìåð, ìàññà, îáúåì è ò.ä. Äàííûé ðàçäåë ñîäåðæèò îïðåäåëåíèÿ è ðàñ- ÷åòû îáùèõ ïàðàìåòðîâ è ïðèìåíèìûõ êî âñåì õðîìàòîãðàôè÷åñêèì ìåòîäàì òðåáîâàíèé äëÿ ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû.
Ïðèíöèïû ðàçäåëåíèÿ, îïèñàíèå ïðèáîðîâ è ìåòîäèê ïðèâîäÿòñÿ â ñëå- äóþùèõ îáùèõ ñòàòüÿõ: – Áóìàæíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (2.1.2.25); – Òîíêîñëîéíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (2.1.2.26); – Ãàçîâàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (2.1.2.27); – Âûñîêîýôôåêòèâíàÿ æèäêîñòíàÿ õðîìà- òîãðàôèÿ (2.1.2.28); – Ýêñêëþçèîííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (2.1.2.29); – Ñâåðõêðèòè÷åñêàÿ ôëþèäíàÿ õðîìàòîãðà- ôèÿ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß Äëÿ óñòàíîâëåíèÿ ïðèãîäíîñòè õðîìàòî- ãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû è ðàñ÷åòà êðèòåðèåâ ïðèåìëåìîñòè â ÷àñòíûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòüÿõ èñïîëüçîâàíû ïðèâåäåííûå íèæå îïðå- äåëåíèÿ. Ðÿä ïàðàìåòðîâ (íàïðèìåð, îòíîøå- íèå ñèãíàë/øóì è ðàçðåøåíèå) ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàí ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììíîãî îáåñïå÷å- íèÿ, ïðåäîñòàâëÿåìîãî ïðîèçâîäèòåëåì èñïîëü- çóåìîãî îáîðóäîâàíèÿ. Îáåñïå÷åíèå ñîîòâåò- ñòâèÿ ñïîñîáîâ ðàñ÷åòà, èñïîëüçóåìûõ â ïðîãðàììíîì îáåñïå÷åíèè, òðåáîâàíèÿì Ôàð- ìàêîïåè è âíåñåíèå íåîáõîäèìûõ ïîïðàâîê â ñëó- ÷àå èõ íåñîîòâåòñòâèÿ âõîäèò â îòâåòñòâåí- íîñòü ïîëüçîâàòåëÿ. Õðîìàòîãðàììà — (ãðàôè÷åñêîå èëè èíîå ïðåäñòàâëåíèå çàâèñèìîñòè ñèãíàëà äåòåêòîðà, öâåòà è èíòåíñèâíîñòè çîí, êîíöåíòðàöèè âå- ùåñòâ â ýëþàòå èëè äðóãîé êîëè÷åñòâåííîé âå- ëè÷èíû, èñïîëüçóåìîé äëÿ èçìåðåíèÿ êîíöåí- òðàöèè âåùåñòâ â ýëþàòå, îò âðåìåíè, îáúåìà èëè ðàññòîÿíèÿ.  èäåàëå õðîìàòîãðàììû ïðåä- ñòàâëÿþò ñîáîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãàóññîâûõ ïèêîâ, ðàñïîëîæåííûõ íà áàçîâîé ëèíèè (ðèñó- íîê 2.1.2.36.-1). Ïèê — ó÷àñòîê õðîìàòîãðàììû ñ çàïèñàí- íûì ñèãíàëîì äåòåêòîðà ïðè ýëþèðîâàíèè èç 96 êîëîíêè îäíîãî êîìïîíåíòà (èëè äâóõ è áîëåå íåðàçäåëåííûõ êîìïîíåíòîâ). Ïèê ìîæåò áûòü îõàðàêòåðèçîâàí ïëîùàäüþ ïèêà, èëè âûñîòîé ïèêà (h) è øèðèíîé ïèêà íà ïîëîâèíå âûñîòû (wh), èëè âûñîòîé ïèêà (h) è øèðèíîé ïèêà ìåæäó òî÷êàìè ïåðåãèáà (wi). Äëÿ ãàóññîâûõ ïèêîâ (ðèñóíîê 2.1.2.36.-1) âû- ïîëíÿåòñÿ ñîîòíîøåíèå: w wh i=118, . Çîíà àäñîðáöèè — ÷àñòü õðîìàòîãðàôè÷å- ñêîé ïëàñòèíêè, ñîäåðæàùàÿ àäñîðáèðîâàííîå îïðåäåëÿåìîå âåùåñòâî è âèçóàëèçèðóåìàÿ â âèäå ïÿòíà (êðóãëîãî èëè ýëëèïñîâèäíîãî) èëè ïîëîñû. Âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ (tR) — âðåìÿ, íåîáõîäè- ìîå äëÿ ýëþèðîâàíèÿ êîìïîíåíòà (ðèñóíîê 2.1.2.36.-1, øêàëà áàçîâîé ëèíèè â ìèíóòàõ). Îáúåì óäåðæèâàíèÿ (VR) — îáúåì ïîäâèæ- íîé ôàçû, íåîáõîäèìûé äëÿ ýëþèðîâàíèÿ êîì- ïîíåíòà. Îáúåì óäåðæèâàíèÿ ìîæåò áûòü ðàñ- ñ÷èòàí ïî âðåìåíè óäåðæèâàíèÿ è ñêîðîñòè ïîä- âèæíîé ôàçû (F) (â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó) ïî ôîðìóëå: V t FR R= ´ . «Ìåðòâîå» âðåìÿ (tM) — âðåìÿ, íåîáõîäè- ìîå äëÿ ýëþèðîâàíèÿ íåóäåðæèâàåìîãî êîìïî- íåíòà (ðèñóíîê 2.1.2.36.-1, øêàëà áàçîâîé ëèíèè â ìèíóòàõ).  ýêñêëþçèîííîé õðîìàòîãðàôèè èñïîëüçóþò ñèìâîë t0 (ñì. íèæå). «Ìåðòâûé» îáúåì (VÌ) — îáúåì ïîäâèæíîé ôàçû, íåîáõîäèìûé äëÿ ýëþèðîâàíèÿ íåóäåð- æèâàåìîãî êîìïîíåíòà. «Ìåðòâûé» îáúåì ìî- æåò áûòü ðàññ÷èòàí ïî «ìåðòâîìó» âðåìåíè è ñêîðîñòè ïîäâèæíîé ôàçû (F) (â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó) ïî ôîðìóëå: V t FM M= ´  ýêñêëþçèîííîé õðîìàòîãðàôèè èñïîëüçó- þò ñèìâîë V0 (ñì. íèæå). Êîýôôèöèåíò óäåðæèâàíèÿ (k) — õàðàêòå- ðèñòèêà, îïðåäåëÿåìàÿ ïî ôîðìóëå: k = êîëè÷åñòâî âåùåñòâà â íåïîäâèæíîé ôàçå êîëè÷åñòâî âåùåñòâà â ïîäâèæíîé ôàçå = = K V V C s M , ãäå: KC — êîíñòàíòà ðàñïðåäåëåíèÿ (èçâåñòíàÿ òàêæå êàê êîýôôèöèåíò ðàâíîâåñíî- ãî ðàñïðåäåëåíèÿ); Vs — îáúåì íåïîäâèæíîé ôàçû; VM — îáúåì ïîäâèæíîé ôàçû. Êîýôôèöèåíò óäåðæèâàíèÿ êîìïîíåíòà ìî- æåò áûòü îïðåäåëåí èç õðîìàòîãðàììû ïî ôîð- ìóëå: k t t t R M M = - . 97 Ðèñóíîê 2.1.2.36-1. — Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå õðîìàòîãðàììû. Îáùåå âðåìÿ ïîäâèæíîé ôàçû (tt) — âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ êîìïîíåíòà, ìîëåêóëû êîòîðîãî ìåíüøå, ÷åì ðàçìåð íàèìåíüøåé ïîðû ãåëÿ â ýêñêëþçèîííîé õðîìàòîãðàôèè (èçâåñòíîå òàê- æå êàê ïîëíîå âðåìÿ ýêñêëþçèè) (ðèñóíîê 2.1.2.36.-2).
Ïîëíûé îáúåì ýêñêëþçèè (Vt) — îáúåì óäåð- æèâàíèÿ êîìïîíåíòà, ìîëåêóëû êîòîðîãî ìåíü- øå, ÷åì ðàçìåð íàèìåíüøåé ïîðû ãåëÿ â ýêñ- êëþçèîííîé õðîìàòîãðàôèè. Ïîëíûé îáúåì ýêñêëþçèè ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàí ïî îáùåìó âðåìåíè ïîäâèæíîé ôàçû è ñêîðîñòè ïîäâèæ- íîé ôàçû (F) (â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó) ïî ôîð- ìóëå: V t Ft t= ´ . Âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ íåóäåðæèâàåìîãî êîì- ïîíåíòà (t0) — âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ êîìïîíåíòà, ìîëåêóëû êîòîðîãî áîëüøå, ÷åì ðàçìåð íàè- áîëüøåé ïîðû ãåëÿ â ýêñêëþçèîííîé õðîìàòî- ãðàôèè (ðèñóíîê 2.1.2.36.-2). Îáúåì óäåðæèâàíèÿ íåóäåðæèâàåìîãî êîì- ïîíåíòà (V0) — îáúåì óäåðæèâàíèÿ êîìïîíåí- òà, ìîëåêóëû êîòîðîãî áîëüøå, ÷åì ðàçìåð íàè- 98 Ðèñóíîê 2.1.2.36.-2 — Âðåìåííûå/îáúåìíûå ïîêàçàòåëè õðîìàòîãðàìì. áîëüøåé ïîðû ãåëÿ â ýêñêëþçèîííîé õðîìàòî- ãðàôèè. Îáúåì óäåðæèâàíèÿ íåóäåðæèâàåìîãî êîìïîíåíòàìîæåò áûòü ðàññ÷èòàí ïî âðåìåíè óäåðæèâàíèÿ íåóäåðæèâàåìîãî êîìïîíåíòà è ñêîðîñòè ïîäâèæíîé ôàçû (F) (â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó) ïî ôîðìóëå: V t F0 0= ´ . Êîíñòàíòà ðàñïðåäåëåíèÿ (K0) — õàðàêòå- ðèñòèêà ýëþåíòíûõ ñâîéñòâ êîìïîíåíòà â îïðå- äåëåííîé êîëîíêå â ýêñêëþçèîííîé õðîìàòîãðà- ôèè, ðàññ÷èòûâàåìàÿ ïî ôîðìóëå: K t t t t R t 0 0 0 = - - . Êîýôôèöèåíò çàìåäëåíèÿ (RF) — õàðàêòå- ðèñòèêà îòíîñèòåëüíîé ñêîðîñòè ïåðåìåùåíèÿ êîìïîíåíòà â òîíêîì ñëîå (èçâåñòíàÿ òàêæå êàê êîýôôèöèåíò óäåðæèâàíèÿ (Rf) â ïëîñêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè). Êîýôôèöèåíò çàìåäëåíèÿ ðà- âåí îòíîøåíèþ ðàññòîÿíèÿ îò òî÷êè íàíåñåíèÿ ïðîáû äî öåíòðà çîíû àäñîðáöèè è ðàññòîÿíèÿ, ïðîéäåííîãî ôðîíòîì ðàñòâîðèòåëÿ îò òî÷êè íàíåñåíèÿ ïðîáû (ðèñóíîê 2.1.2.36.-3): R b a F = , ãäå: b — ðàññòîÿíèå, ïðîéäåííîå êîìïîíåíòîì; a — ðàññòîÿíèå, ïðîéäåííîå ôðîíòîì ðàñ- òâîðèòåëÿ. ×èñëî òåîðåòè÷åñêèõ òàðåëîê (N) — õàðàê- òåðèñòèêà ýôôåêòèâíîñòè (êàæóùåéñÿ ýôôåê- òèâíîñòè) êîëîíêè. ×èñëî òåîðåòè÷åñêèõ òàðå- ëîê ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàíî ïî äàííûì, ïîëó- ÷åííûì â çàâèñèìîñòè îò ìåòîäèêè êàê ïðè èçîòåðìè÷åñêîì èëè èçîêðàòè÷åñêîì ðåæèìàõ, òàê è ðåæèìå ïîñòîÿííîé ïëîòíîñòè ïî ôîðìó- ëå, â êîòîðîé âåëè÷èíû tR è wh äîëæíû áûòü âû- ðàæåíû â îäèíàêîâûõ åäèíèöàõ: N t w R h = æ è ç ö ø ÷5 54 2 , , ãäå: tR — âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ ïèêà êîìïîíåíòà; wh — øèðèíà ïèêà íà ïîëîâèíå åãî âûñîòû. ×èñëî òåîðåòè÷åñêèõ òàðåëîê çàâèñèò êàê îò êîìïîíåíòà, òàê è èñïîëüçóåìîé êîëîíêè è åå òåìïåðàòóðû, à òàêæå îò ïîäâèæíîé ôàçû è âðå- ìåíè óäåðæèâàíèÿ. Îáúåì çàäåðæêè (D) — îáúåì ìåæäó òî÷- êîé, ïðè êîòîðîé ïðîèñõîäèò ñìåøåíèå ýëþåí- òîâ, è âõîäîì â êîëîíêó (èçâåñòíûé òàêæå êàê îáúåì çàäåðæêè ãðàäèåíòà). Îáúåì çàäåðæêè ìîæåò áûòü îïðåäåëåí â ïðèâåäåííûõ íèæå óñ- ëîâèÿõ õðîìàòîãðàôèðîâàíèÿ. Êîëîíêà: õðîìàòîãðàôè÷åñêóþ êîëîíêó çà- ìåíÿþò ïîäõîäÿùåé êàïèëëÿðíîé òðóáêîé (íà- ïðèìåð, äëèíîé 1 ì è âíóòðåííèì äèàìåòðîì 0,12 ìì); Ïîäâèæíàÿ ôàçà: – ïîäâèæíàÿ ôàçà À: âîäà Ð; – ïîäâèæíàÿ ôàçà Â: 0,1 % (îá/îá) ðàñòâîð àöåòîíà Ð; Âðåìÿ (ìèí) Ïîäâèæíàÿ ôàçà À (%, îá/îá) Ïîäâèæíàÿ ôàçà  (%, îá/îá) 0 – 20 100 ® 0 0 ® 100 20 – 30 0 100 Ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû: óñòàíàâëèâàþò äî äîñòàòî÷íîãî îáðàòíîãî äàâëåíèÿ (íàïðèìåð, 2 ìë/ìèí); Äåòåêòèðîâàíèå: ñïåêòðîôîòîìåòð, ïðè äëè- íå âîëíû 265 íì. Îïðåäåëÿþò âðåìÿ (t0,5) (â ìèíóòàõ), ïðè êî- òîðîì îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü óâåëè÷èâàåòñÿ íà 50 % (ðèñóíîê 2.1.2.36.-4). D t FD= ´ , ãäå: tD — t0,5 – 0,5tG (â ìèíóòàõ); tG — ïðåäâàðèòåëüíî óñòàíîâëåííîå âðåìÿ ãðàäèåíòà (ðàâíîå 20 ìèí); F — ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû (â ìèëëè- ëèòðàõ â ìèíóòó). 99 Ðèñóíîê 2.1.2.36.-3 — Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàììû. À — ôðîíò ïîäâèæ- íîé ôàçû;  — ïÿòíî; Ñ — ëèíèÿ íàíåñåíèÿ ïðîáû (ëèíèÿ ñòàðòà).
Êîýôôèöèåíò ñèììåòðèè (As) — õàðàêòå- ðèñòèêà ñèììåòðè÷íîñòè ïèêà, (ðèñóíîê 2.1.2.36.-5), ðàññ÷èòûâàåìàÿ ïî ôîðìóëå: A w d s = 0 05 2 , , ãäå: w0,05 — øèðèíà ïèêà íà îäíîé äâàäöàòîé åãî âûñîòû; d — ðàññòîÿíèå ìåæäó ïåðïåíäèêóëÿ- ðîì, îïóùåííûì èç ìàêñèìóìà ïèêà, è ïåðåäíåé ãðàíèöåé ïèêà íà îäíîé äâàäöàòîé åãî âûñîòû. Çíà÷åíèå As, ðàâíîå 1,0, îçíà÷àåò ïîëíóþ ñèììåòðèþ. Åñëè As > 1,0, ïèê èìååò ðàñòÿíó- òûé çàäíèé ôðîíò («õâîñò»); åñëè As < 1,0, ïèê èìååò ðàñòÿíóòûé ïåðåäíèé ôðîíò. Ðàçðåøåíèå (Rs) — õàðàêòåðèñòèêà ñòåïåíè ðàçäåëåíèÿ ìåæäó ïèêàìè äâóõ êîìïîíåíòîâ (ðèñóíîê 2.1.2.36.-1), êîòîðàÿ ìîæåò áûòü ðàñ- ñ÷èòàíà ïî ôîðìóëå: R t t w w s R R h h = - + 118 2 1 1 2 , ( ), ãäå: tR2 > tR1 tR1 è tR2 — âðåìåíà óäåðæèâàíèÿ ïèêîâ; wh1 è wh2 — øèðèíà ïèêîâ íà ïîëîâèíå âû- ñîòû.  êîëè÷åñòâåííîé ïëîñêîñòíîé õðîìàòîãðà- ôèè ñ èñïîëüçîâàíèåì äåíñèòîìåòðèè âìåñòî âðåìåí óäåðæèâàíèÿ èñïîëüçóþò ïðîéäåííûå ðàññòîÿíèÿ, è ðàçðåøåíèå ìåæäó ïèêàìè äâóõ êîìïîíåíòîâ ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: R a R R w w s F F h h = - + 118 2 1 1 2 , ( ), ãäå: RF1 è RF2 — êîýôôèöèåíòû çàìåäëåíèÿ ïè- êîâ; wh1 è wh2 — øèðèíà ïèêîâ íà ïîëîâèíå èõ âûñîòû; a — ðàññòîÿíèå, ïðîéäåííîå ôðîí- òîì ðàñòâîðèòåëÿ. Îòíîøåíèå ïèê/âïàäèíà (p/v) — õàðàêòåðè- ñòèêà, èñïîëüçóåìàÿ â êà÷åñòâå êðèòåðèÿ ïðè- ãîäíîñòè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû â èñïû- òàíèè íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè, êîãäà ðàçäåëå- íèå äâóõ ïèêîâ äî áàçîâîé ëèíèè íå äîñòèãíóòî 100 Ðèñóíîê 2.1.2.36.-4. — Îïðåäåëåíèå îáúåìà ãðàäè- åíòíîé çàäåðæêè. Ðèñóíîê 2.1.2.36.-5. — Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå ïèêà ñ ðàñòÿíóòûì çàäíèì ôðîíòîì. Ðèñóíîê 2.1.2.36.-6. — Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå íåðàçäåëèâøèõñÿ ïèêîâ. (ðèñóíîê 2.1.2.36.-6). Îòíîøåíèå ïèê/âïàäèíà ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: p v H H p v / = , ãäå: Hp — âûñîòà ìåíüøåãî ïèêà îòíîñèòåëüíî ýêñòðàïîëèðîâàííîé áàçîâîé ëèíèè; Hv — âûñîòà íàä ýêñòðàïîëèðîâàííîé áàçî- âîé ëèíèåé íàèáîëåå íèçêîé òî÷êè êðèâîé, ðàçäåëÿþùåé ìåíüøèé è áîëüøèé ïèêè. Îòíîñèòåëüíîå óäåðæèâàíèå (r) (õàðàêòå- ðèñòèêà, ðàññ÷èòûâàåìàÿ ïî ôîðìóëå: r t t t t Ri M Rst M = - - , ãäå: tRi — âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ ïèêà îïðåäåëÿå- ìîãî êîìïîíåíòà; tRst — âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ ïèêà ñðàâíåíèÿ (îáû÷íî ïèê èñïûòóåìîãî âåùåñòâà); tM — «ìåðòâîå» âðåìÿ. Íåîòêîððåêòèðîâàííîå îòíîñèòåëüíîå óäåð- æèâàíèå (rG) ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: r t t G Ri Rst = . Ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé çíà÷åíèÿ îòíîñèòåëüíîãî óäåðæèâàíèÿ, óêàçàííûå â ÷àñò- íûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòüÿõ, ñîîòâåòñòâóþò íå- îòêîððåêòèðîâàííîìó îòíîñèòåëüíîìó óäåðæè- âàíèþ.  ïëîñêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè âìåñòî tRst è tRi èñïîëüçóþò êîýôôèöèåíòû çàìåäëåíèÿ RFst è RFi. Ïîëó÷åííîå çíà÷åíèå ÿâëÿåòñÿ êîýôôèöè- åíòîì RSt. Îòíîøåíèå ñèãíàë/øóì (S/N) — õàðàêòåðè- ñòèêà âëèÿíèÿ êðàòêîâðåìåííîãî øóìà íà ïðå- öèçèîííîñòü êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ. Îò- íîøåíèå ñèãíàë/øóì ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîð- ìóëå: S N H h / = 2 , ãäå: H — âûñîòà ïèêà (ðèñóíîê 2.1.2.36.-7) ðàñ- ñìàòðèâàåìîãî êîìïîíåíòà íà õðîìà- òîãðàììå óêàçàííîãî ðàñòâîðà ñðàâíå- íèÿ; âûñîòó èçìåðÿþò îò ìàêñèìóìà ïèêà äî ýêñòðàïîëèðîâàííîé áàçîâîé ëèíèè ñèãíàëà, íàáëþäàåìîãî íà ðàñ- ñòîÿíèè, ðàâíîì íå ìåíåå ïÿòèêðàò- íîé øèðèíå ïèêà íà ïîëîâèíå åãî âû- ñîòû; h — îáëàñòü ôîíîâîãî øóìà íà õðîìàòî- ãðàììå, ïîëó÷åííîé ïðè ââåäåíèè èëè íàíåñåíèè êîíòðîëüíîãî ðàñòâîðà, íà- áëþäàåìàÿ íà ðàññòîÿíèè, ðàâíîì íå ìåíåå ïÿòèêðàòíîé øèðèíå ïèêà íà ïîëîâèíå âûñîòû ïèêà íà õðîìàòî- ãðàììå óêàçàííîãî ðàñòâîðà ñðàâíå- íèÿ, è, ïî âîçìîæíîñòè, ðàñïîëîæåí- íàÿ ïî îáå ðàâíûå ñòîðîíû îò ìåñòà âîçìîæíîãî îáíàðóæåíèÿ ïèêà.
Ïîâòîðÿåìîñòü ñèñòåìû — õàðàêòåðèñòè- êà ñèãíàëà, âûðàæàåìàÿ â âèäå ðàññ÷èòàííîãî îòíîñèòåëüíîãî ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ â ïðîöåíòàõ (sr(%)) ïîñëåäîâàòåëüíûõ ñåðèé èç- ìåðåíèé äëÿ íå ìåíåå òðåõ ââåäåíèé èëè íàíå- ñåíèé ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ è ðàññ÷èòûâàåìàÿ ïî ôîðìóëå: s y y y n r i (%) ( ) = - - å100 1 2 , ãäå: yi — èíäèâèäóàëüíûå çíà÷åíèÿ ïëîùàäè ïèêà, âûñîòû ïèêà èëè îòíîøåíèÿ ïëîùàäåé â ìåòîäå âíóòðåííåãî ñòàí- äàðòà; y — ñðåäíåå èíäèâèäóàëüíûõ çíà÷åíèé; n — ÷èñëî èíäèâèäóàëüíûõ çíà÷åíèé. Íåó÷èòûâàåìûé ïðåäåë — ïðåäåë, ïðè êîòî- ðîì è íèæå êîòîðîãî ïèêè íå ó÷èòûâàþòñÿ. ÏÐÈÃÎÄÍÎÑÒÜ ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈ×ÅÑÊÎÉ ÑÈÑÒÅÌÛ Ðàçëè÷íûå ÷àñòè ïðèìåíÿåìîãî îáîðóäîâà- íèÿ äîëæíû áûòü êâàëèôèöèðîâàíû è ñïîñîá- 101 Ðèñóíîê 2.1.2.36.-7. — Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå ïàðàìåòðîâ äëÿ ðàñ÷åòà îòíîøåíèÿ ñèãíàë/øóì. íû ê äîñòèæåíèþ óðîâíÿ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ, íåîáõîäèìîãî äëÿ ïðîâåäåíèÿ èñïûòàíèÿ èëè êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ. Èñïûòàíèÿ ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû ÿâëÿþòñÿ íåîòúåìëåìîé ÷àñòüþ ìåòîäèêè è èñïîëüçóþòñÿ äëÿ îáåñïå÷åíèÿ íàäëåæàùåãî ôóíêöèîíèðîâà- íèÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû. Äëÿ îöåíêè ðàáîòû êîëîíêè îáû÷íî èñïîëüçóþò ñëåäóþùèå ïàðàìåòðû: êàæóùàÿñÿ ýôôåêòèâíîñòü, êîýôôè- öèåíò óäåðæèâàíèÿ (êîýôôèöèåíò ðàñïðåäåëå- íèÿ ìàññ), ðàçðåøåíèå è êîýôôèöèåíò ñèììåò- ðèè. Íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîå ïîâåäåíèå ìîãóò âëèÿòü ñëåäóþùèå ôàêòîðû: – ñîñòàâ, èîííàÿ ñèëà, òåìïåðàòóðà è êàæó- ùèéñÿ ðÍ ïîäâèæíîé ôàçû; – ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû, ðàçìåðû êî- ëîíêè, òåìïåðàòóðà êîëîíêè è äàâëåíèå; – õàðàêòåðèñòèêà íåïîäâèæíîé ôàçû, â òîì ÷èñëå òèï õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî íîñèòåëÿ (ñî- ñòîÿùèé èç ÷àñòèö, èëè ìîíîëèòíûé), ðàçìåð ÷àñòèö èëè ìàêðîïîð, ïîðèñòîñòü, óäåëüíàÿ ïëîùàäü ïîâåðõíîñòè; – õèìè÷åñêàÿ ìîäèôèêàöèÿ ïîâåðõíîñòè íåïîäâèæíîé ôàçû (îáðàùåííî-ôàçîâàÿ è äðó- ãèå ìîäèôèêàöèè), ñòåïåíü õèìè÷åñêîé ìîäè- ôèêàöèè (áëîêèðîâàíèå êîíöåâûõ ãðóïï, ò.å. ýíäêåïèðîâàíèå), ñîäåðæàíèå óãëåðîäà â ïðî- öåíòàõ è ò.ä.). Ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé äîëæíû âûïîëíÿòüñÿ ñëåäóþùèå òðåáîâàíèÿ è ëþáûå äðóãèå äîïîëíèòåëüíûå òðåáîâàíèÿ, ïðèâåäåí- íûå â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå: – ïðè èñïûòàíèè íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè è êîëè÷åñòâåííîì îïðåäåëåíèè âåëè÷èíà êîýô- ôèöèåíòà ñèììåòðèè ïèêà, ïîëó÷åííîãî íà õðî- ìàòîãðàììå ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ, èñïîëüçóåìîãî äëÿ êîëè÷åñòâåííûõ ðàñ÷åòîâ, äîëæíà íàõî- äèòüñÿ â ïðåäåëàõ îò 0,8 äî 1,5 ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé; – ïðè êîëè÷åñòâåííîì îïðåäåëåíèè äåéñò- âóþùåãî âåùåñòâà ïðè çíà÷åíèè 100 % äëÿ ÷èñ- òîãî âåùåñòâà, ìàêñèìàëüíî äîïóñòèìîå îòíî- ñèòåëüíîå ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå (sr(%)) äëÿ çàäàííûõ ïðåäåëîâ ðàññ÷èòûâàþò èç ñåðèè ââå- äåíèé ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ ïî ôîðìóëå: s KB n t r n (%) max %, = -90 1 , ãäå: K — êîíñòàíòà (0,349), ïîëó÷åííàÿ èç óðàâíåíèÿ K t = × 0 6 2 6 90 5, %, , â êîòî- ðîì 0 6 2 , ñîîòâåòñòâóåò çíà÷åíèþ îòíîñèòåëüíîãî ñòàíäàðòíîãî îò- êëîíåíèÿ (â ïðîöåíòàõ) ïðè øåñ- òè ïîâòîðíûõ ââîäàõ ïðîáû äëÿ B = 1,0; B — âåðõíèé ïðåäåë êîëè÷åñòâåííîãî ñîäåðæàíèÿ, óêàçàííûé â ÷àñò- íîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå, ìè- íóñ 100 %; n — ÷èñëî ïîâòîðíûõ ââîäîâ ðàñòâî- ðà ñðàâíåíèÿ (3 £ n £ 6); t90 %, n–1 — êîýôôèöèåíò Ñòüþäåíòà t ïðè äîâåðèòåëüíîé âåðîÿòíîñòè 90 % â äâóñòîðîííåì èíòåðâàëå ñ ÷èñ- ëîì ñòåïåíåé ñâîáîäû n – 1. Ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé, ìàêñè- ìàëüíî äîïóñòèìîå îòíîñèòåëüíîå ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå íå äîëæíî ïðåâûøàòü ñîîòâåòñò- âóþùèõ çíà÷åíèé, ïðèâåäåííûõ â òàáëèöå 2.1.2.36.-1. Äàííîå òðåáîâàíèå íå ðàñïðîñòðà- íÿåòñÿ íà èñïûòàíèÿ íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè. – â èñïûòàíèè íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè ïðåäåë êîëè÷åñòâåííîãî ñîäåðæàíèÿ (ñîîòâåò- ñòâóþùèé îòíîøåíèþ ñèãíàë/øóì, ðàâíîìó 10) äîëæåí áûòü ðàâåí èëè ìåíüøå íåó÷èòûâàåìîãî ïðåäåëà.
Ñîîòâåòñòâèå òðåáîâàíèÿì ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû äîëæíî ïîääåðæèâàòüñÿ â òå÷åíèå âñå- ãî ïðîöåññà õðîìàòîãðàôèðîâàíèÿ.  çàâèñèìî- ñòè îò ðàçëè÷íûõ ôàêòîðîâ, òàêèõ êàê ÷àñòîòà èñïîëüçîâàíèÿ ìåòîäèêè, îïûòà ðàáîòû ñ õðî- ìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìîé, àíàëèòèê ïîäáèðà- åò ïîäõîäÿùóþ ñõåìó ïðîâåðêè äëÿ êîíòðîëÿ äàííîãî ñîîòâåòñòâèÿ. ÐÅÃÓËÈÐÎÂÀÍÈÅ ÓÑËÎÂÈÉ ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈÐÎÂÀÍÈß Íèæå ïðèâåäåíû ïðåäåëû, â êîòîðûõ ìîãóò êîððåêòèðîâàòüñÿ ðàçëè÷íûå ïàðàìåòðû õðîìà- òîãðàôè÷åñêèõ èñïûòàíèé äëÿ ñîîòâåòñòâèÿ êðèòåðèÿì ïðèãîäíîñòè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé 102 Òàáëèöà 2.1.2.36.-1. — Òðåáîâàíèÿ ê ïîâòîðÿåìîñòè  (%) ×èñëî îòäåëüíûõ ââîäîâ ïðîáû 3 4 5 6 Ìàêñèìàëüíî äîïóñòèìîå îòíîñèòåëüíîå ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå 2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 3,0 0,62 0,89 1,10 1,27 ñèñòåìû áåç ïðèíöèïèàëüíîãî èçìåíåíèÿ ìåòî- äèêè. Ðåãóëèðîâàíèå óñëîâèé õðîìàòîãðàôèðîâà- íèÿ ñ ãðàäèåíòíûì ýëþèðîâàíèåì ÿâëÿåòñÿ áî- ëåå êðèòè÷íûì, ÷åì ñ èçîêðàòè÷åñêèì ýëþèðî- âàíèåì, òàê êàê ìîæåò âûçâàòü ñäâèã ïèêîâ íà ðàçëè÷íûõ óðîâíÿõ ãðàäèåíòà, è, òàêèì îáðà- çîì, ïðèâåñòè ê íåêîððåêòíîìó óñòàíîâëåíèþ ïèêîâ, ìàñêèðîâàíèþ ïèêîâ èëè ê òàêîìó èõ ñìåùåíèþ, ïðè êîòîðîì ýëþèðîâàíèå áóäåò ïðîèñõîäèòü çà ïðåäåëàìè óêàçàííîãî âðåìåíè ýëþèðîâàíèÿ. Èçìåíåíèÿ, îòëè÷íûå îò óêàçàííûõ, òðåáó- þò ðåâàëèäàöèè ìåòîäèêè. Îïèñàííûå óñëîâèÿ õðîìàòîãðàôèðîâàíèÿ äîëæíû áûòü âàëèäèðî- âàíû ïðè ðàçðàáîòêå ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüè. Ïðîâåðêó ïðèãîäíîñòè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû âêëþ÷àþò ñ öåëüþ ïîäòâåðæäåíèÿ äîñ- òèæåíèÿ ñòåïåíè ðàçäåëåíèÿ, íåîáõîäèìîé äëÿ íàäëåæàùåãî ïðîâåäåíèÿ èñïûòàíèÿ èëè êîëè- ÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ. Òåì íå ìåíåå, ïî- ñêîëüêó íåïîäâèæíûå ôàçû îïèñàíû â îáùåì âèäå è ñóùåñòâóåò øèðîêîå ðàçíîîáðàçèå äîñ- òóïíûõ â ïðîäàæå ôàç, îòëè÷àþùèõñÿ õðîìàòî- ãðàôè÷åñêèì ïîâåäåíèåì, ìîæåò ïîòðåáîâàòüñÿ íåêîòîðîå êîððåêòèðîâàíèå óñëîâèé õðîìàòî- ãðàôèðîâàíèÿ äëÿ âûïîëíåíèÿ óêàçàííûõ òðå- áîâàíèé ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû.  ÷àñòíîñòè, â ìåòîäèêàõ îáðàùåííî-ôàçîâîé õðîìàòîãðàôèè êîððåêòèðîâàíèå ðàçëè÷íûõ ïàðàìåòðîâ íå âñå- ãäà ïðèâîäèò ê óäîâëåòâîðèòåëüíîìó ðàçäåëå- íèþ.  äàííîì ñëó÷àå ìîæåò áûòü íåîáõîäèìîé çàìåíà êîëîíêè äðóãîé îäíîòèïíîé êîëîíêîé (íàïðèìåð, ñèëèêàãåëü îêòàäåöèëñèëèëüíûé), ïðîÿâëÿþùåé òðåáóåìîå õðîìàòîãðàôè÷åñêîå ïîâåäåíèå. Êîððåêòèðîâàíèå êðèòè÷åñêèõ ïàðàìåòðîâ äëÿ îáåñïå÷åíèÿ ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû ÷åòêî óêàçûâàþò â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. Òîíêîñëîéíàÿ è áóìàæíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ Ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû: ñîäåðæàíèå êîì- ïîíåíòà-ðàñòâîðèòåëÿ, ïðèñóòñòâóþùåãî â ìåíüøåì êîëè÷åñòâå, ìîæåò êîððåêòèðîâàòüñÿ â ïðåäåëàõ ± 30 % (îòíîñèòåëüíîå ñîäåðæàíèå) èëè ± 2 % (àáñîëþòíîå ñîäåðæàíèå), â çàâèñè- ìîñòè îò òîãî, ÷òî èç íèõ áîëüøå. Íàïðèìåð, äëÿ ìåíüøåãî ïî ñîäåðæàíèþ êîìïîíåíòà, ñî- ñòàâëÿþùåãî 10 % ïîäâèæíîé ôàçû, êîððåêòè- ðîâàíèå îòíîñèòåëüíîãî ñîäåðæàíèÿ íà 30 % äîïóñêàåò ïðåäåëüíûå çíà÷åíèÿ îò 7 % äî 13 %, à êîððåêòèðîâàíèå àáñîëþòíîãî ñîäåðæàíèÿ íà 2 % äîïóñêàåò ïðåäåëüíûå çíà÷åíèÿ îò 8 % äî 12 %, ò.å. êîððåêòèðîâàíèå ïî îòíîñèòåëüíîìó ñîäåðæàíèþ áîëüøå. Äëÿ ìåíüøåãî ïî ñîäåðæà- íèþ êîìïîíåíòà, ñîñòàâëÿþùåãî 5 % ïîäâèæ- íîé ôàçû, êîððåêòèðîâàíèå îòíîñèòåëüíîãî ñî- äåðæàíèÿ íà 30 % äîïóñêàåò ïðåäåëüíûå çíà÷å- íèÿ îò 3,5 % äî 6,5 %, à êîððåêòèðîâàíèå àáñîëþòíîãî ñîäåðæàíèÿ íà 2 % äîïóñêàåò ïðå- äåëüíûå çíà÷åíèÿ îò 3 % äî 7 %, ò.å. â äàííîì ñëó÷àå êîððåêòèðîâàíèå ïî àáñîëþòíîìó ñîäåð- æàíèþ áîëüøå. Àáñîëþòíîå ñîäåðæàíèå äðóãèõ êîìïîíåíòîâ íå ìîæåò áûòü èçìåíåíî áîëåå ÷åì íà 10 %. pH âîäíîãî êîìïîíåíòà ïîäâèæíîé ôàçû: ±0,2 pH ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé â ÷àñò- íîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå èëè ±1,0 pH â ñëó÷àå èñïûòàíèÿ íåèîíèçèðîâàííûõ âåùåñòâ.
Êîíöåíòðàöèÿ ñîëåé â áóôåðíîì êîìïîíåí- òå ïîäâèæíîé ôàçû: ±10 %. Íàíîñèìûé îáúåì ïðîáû: îò 10 % äî 20 % îò óêàçàííîãî îáúåìà ïðè èñïîëüçîâàíèè ïëàñòè- íîê ñ ìàëûì ðàçìåðîì ÷àñòèö (îò 2 ìêì äî 10 ìêì). Æèäêîñòíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ: èçîêðàòè÷åñêîå ýëþèðîâàíèå Ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû: ñîäåðæàíèå êîì- ïîíåíòà-ðàñòâîðèòåëÿ, ïðèñóòñòâóþùåãî â ìåíüøåì êîëè÷åñòâå, ìîæåò êîððåêòèðîâàòüñÿ â ïðåäåëàõ ±30 % (îòíîñèòåëüíîå ñîäåðæàíèå) èëè ±2 % (àáñîëþòíîå ñîäåðæàíèå), â çàâèñè- ìîñòè îò òîãî, ÷òî èç íèõ áîëüøå (ñì. ïðèìåð âûøå). Àáñîëþòíîå ñîäåðæàíèå äðóãèõ êîìïî- íåíòîâ íå ìîæåò áûòü èçìåíåíî áîëåå ÷åì íà 10 %. pH âîäíîãî êîìïîíåíòà ïîäâèæíîé ôàçû: ±0,2 pH ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé â ÷àñò- íîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå, èëè ±1,0 pH â ñëó- ÷àå èñïûòàíèÿ íåèîíèçèðîâàííûõ âåùåñòâ. Êîíöåíòðàöèÿ ñîëåé â áóôåðíîì êîìïîíåí- òå ïîäâèæíîé ôàçû: ±10 %. Ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû: ±50 %; ïðè èç- ìåíåíèè ðàçìåðîâ êîëîíêè äîïóñêàåòñÿ áîëü- øåå êîððåêòèðîâàíèå (ñì. ôîðìóëó íèæå). Õàðàêòåðèñòèêè êîëîíêè: Íåïîäâèæíàÿ ôàçà: – íå äîïóñêàåòñÿ èçìåíåíèå çàìåñòèòåëåé íåïîäâèæíîé ôàçû (ò.å. íå äîïóñêàåòñÿ çàìåíà Ñ18 íà Ñ8); – ðàçìåð ÷àñòèö: äîïóñêàåòñÿ ìàêñèìàëü- íîå óìåíüøåíèå ðàçìåðà íà 50 %, óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ. 103 Ðàçìåð êîëîíêè: – äëèíà: ± 70 %; – âíóòðåííèé äèàìåòð: ± 25 %. Ïðè èçìåíåíèè ðàçìåðà êîëîíêè ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû ìîæåò êîððåêòèðîâàòüñÿ, ïðè íåîáõîäèìîñòè, ïî ôîðìóëå: F F l d l d 2 1 2 2 2 1 1 2 = × × , ãäå: F1 — ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû, óêàçàííàÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå, â ìèë- ëèëèòðàõ â ìèíóòó; F2 — ñêîððåêòèðîâàííàÿ ñêîðîñòü ïîäâèæ- íîé ôàçû â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó; l1 — äëèíà êîëîíêè, óêàçàííàÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå, â ìèëëèìåò- ðàõ; l2 — äëèíà èñïîëüçóåìîé êîëîíêè, â ìèë- ëèìåòðàõ; d1 — âíóòðåííèé äèàìåòð êîëîíêè, óêàçàí- íûé â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå, â ìèëëèìåòðàõ; d2 — âíóòðåííèé äèàìåòð èñïîëüçóåìîé êî- ëîíêè â ìèëëèìåòðàõ. Òåìïåðàòóðà: ±10 °Ñ â ñëó÷àå êîíòðîëèðóå- ìîé ðàáî÷åé òåìïåðàòóðû ïðèîòñóòñòâèè äðó- ãèõ óêàçàíèé â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. Äëèíà âîëíû äåòåêòîðà: êîððåêòèðîâàíèå íå äîïóñêàåòñÿ. Îáúåì ââîäèìîé ïðîáû: ìîæåò áûòü óìåíü- øåí ïðè óñëîâèè, ÷òî èñïîëüçóåìîå äåòåêòèðî- âàíèå è ïîâòîðÿåìîñòü ïèêà(îâ) îñòàþòñÿ óäîâ- ëåòâîðèòåëüíûìè; óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ. Æèäêîñòíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ: ãðàäèåíòíîå ýëþèðîâàíèå Ðåãóëèðîâàíèå óñëîâèé õðîìàòîãðàôèðîâà- íèÿ ïðè ãðàäèåíòíîì ýëþèðîâàíèè òðåáóåò áîëüøåé îñòîðîæíîñòè, ÷åì ïðè èçîêðàòè÷å- ñêîì ýëþèðîâàíèè. Ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû/ãðàäèåíòíîãî ýëþèðîâàíèÿ: íåçíà÷èòåëüíîå êîððåêòèðîâàíèå ñîñòàâà ïîäâèæíîé ôàçû è ñèñòåìû ãðàäèåíòà äîïóñòèìî ïðè ñëåäóþùèõ óñëîâèÿõ: – âûïîëíÿþòñÿ òðåáîâàíèÿ ïðèãîäíîñòè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû; – îñíîâíîé(ûå) ïèê(è) ýëþèðóåòñÿ â ïðåäå- ëàõ ±15 % îò óêàçàííîãî(ûõ) âðåìåíè(åí) óäåð- æèâàíèÿ; – ýëþèðóþùàÿ ñïîñîáíîñòü êîíå÷íîãî ñî- ñòàâà ïîäâèæíîé ôàçû äîëæíà áûòü íå íèæå, ÷åì ó ñîñòàâà, óêàçàííîãî â ÷àñòíîé ôàðìàêî- ïåéíîé ñòàòüå. Åñëè ñîîòâåòñòâèå òðåáîâàíèÿì ïðèãîäíî- ñòè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû íå ìîæåò áûòü äîñòèãíóòî, ïðåäïî÷òèòåëüíûì çà÷àñòóþ ÿâëÿåòñÿ îöåíêà îáúåìà çàäåðæêè èëè çàìåíà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêè. Îáúåì çàäåðæêè. Êîíôèãóðàöèÿ èñïîëüçóå- ìîãî îáîðóäîâàíèÿ ìîæåò çíà÷èòåëüíî èçìå- íèòü ðàçðåøåíèå, âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ èëè îòíî- ñèòåëüíîå óäåðæèâàíèå, îïèñàííûå â ìåòîäèêå, ÷òî ìîæåò ïðîèçîéòè èç-çà èçáûòî÷íîãî îáúåìà çàäåðæêè.
 ÷àñòíûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòüÿõ îáû÷íî âêëþ÷àþò èçîêðàòè÷åñêóþ ñòàäèþ äî íà÷àëà ïðîãðàììû ãðàäèåíòíîãî ýëþèðîâàíèÿ, îáåñïå÷èâàÿ àäàïòàöèþ ê âðåìåííûì òî÷êàì ãðàäèåíòà ñ ó÷åòîì ðàçíèöû â îáúåìå çàäåðæêè ìåæäó ñèñòåìîé, èñïîëüçîâàííîé ïðè ðàçðàáîò- êå ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüè, è ôàêòè÷å- ñêè èñïîëüçóåìîé ñèñòåìû. Àäàïòàöèÿ ïðîäîë- æèòåëüíîñòè èçîêðàòè÷åñêîé ñòàäèè â çàâèñè- ìîñòè îò èñïîëüçóåìîãî àíàëèòè÷åñêîãî îáîðóäîâàíèÿ âõîäèò â îòâåòñòâåííîñòü ïîëüçî- âàòåëÿ. Åñëè â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå ïðèâåäåí îáúåì çàäåðæêè, óñòàíîâëåííûé ïðè åå ðàçðàáîòêå, òî âðåìåííûå òî÷êè (t, ìèí), óêà- çàííûå â òàáëèöå ãðàäèåíòà, ìîãóò áûòü çàìåíå- íû íà àäàïòèðîâàííûå âðåìåííûå òî÷êè (tñ, ìèí), ðàññ÷èòàííûå ïî ôîðìóëå: t t D D F c = - -( )0 , ãäå: D — îáúåì çàäåðæêè â ìèëëèëèòðàõ; D0 — îáúåì çàäåðæêè, èñïîëüçîâàííûé ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèêè, â ìèëëèëèòðàõ; F — ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû â ìèëëè- ëèòðàõ â ìèíóòó. Èçîêðàòè÷åñêàÿ ñòàäèÿ, ââåäåííàÿ ñ äàííîé öåëüþ, ìîæåò áûòü èñêëþ÷åíà ïðè íàëè÷èè äàííûõ ïî âàëèäàöèè ìåòîäèêè, ïðèìåíÿåìîé áåç óêàçàííîé ñòàäèè. pH âîäíîãî êîìïîíåíòà ïîäâèæíîé ôàçû: êîððåêòèðîâàíèå íå äîïóñêàåòñÿ. Êîíöåíòðàöèÿ ñîëåé â áóôåðíîì êîìïîíåí- òå ïîäâèæíîé ôàçû: êîððåêòèðîâàíèå íå äî- ïóñêàåòñÿ. Ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû: êîððåêòèðîâà- íèå äîïóñêàåòñÿ ïðè èçìåíåíèè ðàçìåðîâ êî- ëîíêè (ñì. ôîðìóëó íèæå). Õàðàêòåðèñòèêè êîëîíêè: Íåïîäâèæíàÿ ôàçà: 104 – íå äîïóñêàåòñÿ èçìåíåíèå çàìåñòèòåëåé íåïîäâèæíîé ôàçû (ò.å. íå äîïóñêàåòñÿ çàìåíà Ñ18 íà Ñ8); – ðàçìåð ÷àñòèö: êîððåêòèðîâàíèå íå äî- ïóñêàåòñÿ. Ðàçìåð êîëîíêè: – äëèíà: ±70 %; – âíóòðåííèé äèàìåòð: ±25 %. Ïðè èçìåíåíèè ðàçìåðà êîëîíêè ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû ìîæåò êîððåêòèðîâàòüñÿ, ïðè íåîáõîäèìîñòè, ïî ôîðìóëå: F F l d l d 2 1 2 2 2 1 1 2 = × , ãäå: F1 — ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû, óêàçàííàÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå â ìèë- ëèëèòðàõ â ìèíóòó; F2 — ñêîððåêòèðîâàííàÿ ñêîðîñòü ïîäâèæ- íîé ôàçû â ìèëëèëèòðàõ â ìèíóòó; l1 — äëèíà êîëîíêè, óêàçàííàÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå â ìèëëèìåòðàõ; l2 — äëèíà èñïîëüçóåìîé êîëîíêè â ìèëëè- ìåòðàõ; d1 — âíóòðåííèé äèàìåòð êîëîíêè, óêàçàí- íûé â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå â ìèëëèìåòðàõ; d2 — âíóòðåííèé äèàìåòð èñïîëüçóåìîé êî- ëîíêè â ìèëëèìåòðàõ. Òåìïåðàòóðà: ±5 °Ñ â ñëó÷àå êîíòðîëèðóå- ìîé ðàáî÷åé òåìïåðàòóðû ïðè îòñóòñòâèè äðó- ãèõ óêàçàíèé â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. Äëèíà âîëíû äåòåêòîðà: êîððåêòèðîâàíèå íå äîïóñêàåòñÿ. Îáúåì ââîäèìîé ïðîáû: ìîæåò áûòü óìåíü- øåí ïðè óñëîâèè, ÷òî èñïîëüçóåìîå äåòåêòèðî- âàíèå è ïîâòîðÿåìîñòü ïèêà(îâ) îñòàþòñÿ óäîâ- ëåòâîðèòåëüíûìè; óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ. Ãàçîâàÿ õðîìàòîãðàôèÿ Õàðàêòåðèñòèêè êîëîíêè: Íåïîäâèæíàÿ ôàçà: – ðàçìåð ÷àñòèö: äîïóñêàåòñÿ ìàêñèìàëü- íîå óìåíüøåíèå ðàçìåðà íà 50 %, óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ (íàáèâíûå êîëîíêè); – òîëùèíà ñëîÿ: îò –50 % äî +100 % (êà- ïèëëÿðíûå êîëîíêè). Ðàçìåð êîëîíêè: – äëèíà: ± 70 %; – âíóòðåííèé äèàìåòð: ±50 %. Ñêîðîñòü ïîòîêà: ±50 %. Òåìïåðàòóðà: ±10 %. Ââîäèìûé îáúåì ïðîáû: ìîæåò áûòü èçìå- íåí ïðè óñëîâèè, ÷òî èñïîëüçóåìîå äåòåêòèðî- âàíèå è ïîâòîðÿåìîñòü îñòàþòñÿ óäîâëåòâîðè- òåëüíûìè. Ñâåðõêðèòè÷åñêàÿ ôëþèäíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ Ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû: äëÿ íàáèâíûõ êî- ëîíîê ñîäåðæàíèå êîìïîíåíòà-ðàñòâîðèòåëÿ, ïðèñóòñòâóþùåãî â ìåíüøåì êîëè÷åñòâå, ìî- æåò êîððåêòèðîâàòüñÿ â ïðåäåëàõ ±30 % (îòíî- ñèòåëüíîå ñîäåðæàíèå) èëè ±2 % (àáñîëþòíîå ñîäåðæàíèå) â çàâèñèìîñòè îò òîãî, ÷òî èç íèõ áîëüøå. Äëÿ êàïèëëÿðíûõ êîëîíîê èçìåíåíèÿ íå äîïóñêàþòñÿ. Äëèíà âîëíû äåòåêòîðà: êîððåêòèðîâàíèå íå äîïóñêàþòñÿ.
Õàðàêòåðèñòèêè êîëîíêè: Íåïîäâèæíàÿ ôàçà: – ðàçìåð ÷àñòèö: äîïóñêàåòñÿ ìàêñèìàëü- íîå óìåíüøåíèå ðàçìåðà íà 50 %, óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ (íàáèâíûå êîëîíêè); Ðàçìåð êîëîíêè: – äëèíà: ±70 %; – âíóòðåííèé äèàìåòð: ±25 % (íàáèâíûå êîëîíêè); ±50 % (êàïèëëÿðíûå êîëîíêè). Ñêîðîñòü ïîòîêà: ±50 %. Òåìïåðàòóðà: ±5 °Ñ â ñëó÷àå êîíòðîëèðóå- ìîé ðàáî÷åé òåìïåðàòóðû. Ââîäèìûé îáúåì ïðîáû: ìîæåò áûòü óìåíü- øåí ïðè óñëîâèè, ÷òî èñïîëüçóåìîå äåòåêòèðî- âàíèå è ïîâòîðÿåìîñòü îñòàþòñÿ óäîâëåòâîðè- òåëüíûìè; óâåëè÷åíèå íå äîïóñêàåòñÿ. ÊÎËÈ×ÅÑÒÂÅÍÍÎÅ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ Ïðè êîëè÷åñòâåííîì îïðåäåëåíèè íå ó÷èòû- âàþò ïèêè ðàñòâîðèòåëåé è ðåàêòèâîâ, à òàêæå ïèêè ïîäâèæíîé ôàçû è ìàòðèöû èñïûòóåìîãî îáðàçöà. – ×óâñòâèòåëüíîñòü äåòåêòîðà. ×óâñòâè- òåëüíîñòü äåòåêòîðà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñèãíàë íà âûõîäå íà åäèíèöó êîíöåíòðàöèè èëè åäèíè- öó ìàññû âåùåñòâà â ïîäâèæíîé ôàçå, âõîäÿùåé â äåòåêòîð. Êîýôôèöèåíò îòíîñèòåëüíîé ÷óâñò- âèòåëüíîñòè äåòåêòîðà, íàçûâàåìûé îáû÷íî êî- ýôôèöèåíòîì ÷óâñòâèòåëüíîñòè âûðàæàåò ÷óâ- ñòâèòåëüíîñòü äåòåêòîðà ê äàííîìó âåùåñòâó îòíîñèòåëüíî ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà. Ïîïðà- âî÷íûé êîýôôèöèåíò îáðàòíî ïðîïîðöèîíàëåí êîýôôèöèåíòó ÷óâñòâèòåëüíîñòè. 105 – Ìåòîä âíåøíåãî ñòàíäàðòà. Êîíöåíòðà- öèþ îïðåäåëÿåìîãî(ûõ) êîìïîíåíòà(îâ) íàõî- äÿò ïóòåì ñðàâíåíèÿ ñèãíàëà(îâ) äåòåêòîðà (ïèêà(îâ)), ïîëó÷åííîãî(ûõ) äëÿ èñïûòóåìîãî ðàñòâîðà, è ñèãíàëà(îâ) äåòåêòîðà (ïèêà(îâ)), ïîëó÷åííîãî(ûõ) äëÿ ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ. – Ìåòîä âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà.  èñïû- òóåìûé ðàñòâîð è ðàñòâîð ñðàâíåíèÿ ââîäÿò ðàâíûå êîëè÷åñòâà êîìïîíåíòà (âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà), êîòîðûé ðàçäåëÿþò ñ èññëåäóåìûì âåùåñòâîì. Âíóòðåííèé ñòàíäàðò íå äîëæåí âçàèìîäåéñòâîâàòü ñ èññëåäóåìûì âåùåñòâîì, äîëæåí áûòü ñòàáèëüíûì è íå ñîäåðæàòü ïðè- ìåñåé ñ âðåìåíåì óäåðæèâàíèÿ, ñîâïàäàþùèì ñ èññëåäóåìûì âåùåñòâîì. Êîíöåíòðàöèþ èññëå- äóåìîãî âåùåñòâà îïðåäåëÿþò ïóòåì ñðàâíåíèÿ îòíîøåíèÿ ïëîùàäåé èëè âûñîò ïèêîâ, ñîîòâåò- ñòâóþùèõ èññëåäóåìîìó âåùåñòâó è âíóòðåí- íåìó ñòàíäàðòó â èñïûòóåìîì ðàñòâîðå, è îòíî- øåíèÿ ïëîùàäåé èëè âûñîò ïèêîâ, ñîîòâåòñò- âóþùèõ èññëåäóåìîìó âåùåñòâó è âíóòðåííåìó ñòàíäàðòó â ðàñòâîðå ñðàâíåíèÿ. – Ìåòîä âíóòðåííåé íîðìàëèçàöèè. Ñîäåð- æàíèå êîìïîíåíòà èññëåäóåìîãî âåùåñòâà â ïðîöåíòàõ ðàññ÷èòûâàþò ïóòåì îïðåäåëåíèÿ ïëîùàäè ñîîòâåòñòâóþùåãî ïèêà êàê ÷àñòè, âû- ðàæåííîé â ïðîöåíòàõ îò îáùåé ïëîùàäè âñåõ ïèêîâ, çà èñêëþ÷åíèåì ïèêîâ ðàñòâîðèòåëåé èëè ðåàêòèâîâ, èëè ïèêîâ, îáóñëîâëåííûõ êîì- ïîíåíòàìè ïîäâèæíîé ôàçû èëè ìàòðèöû èñïû- òóåìîãî îáðàçöà, à òàêæå ïèêîâ âåùåñòâ, ñ ïëî- ùàäüþ, ðàâíîé èëè ìåíüøåé íåó÷èòûâàåìîãî ïðåäåëà. – Ìåòîä êàëèáðîâî÷íîé ôóíêöèè. Îïðåäå- ëÿþò çàâèñèìîñòü ìåæäó èçìåðåííûì èëè ðàñ- ñ÷èòàííûì ñèãíàëîì (y) è êîëè÷åñòâîì (êîíöåí- òðàöèåé, ìàññîé è ò.ä.) èññëåäóåìîãî âåùåñòâà (x) è ðàññ÷èòûâàþò óðàâíåíèå êàëèáðîâî÷íîé ôóíêöèè. Ðåçóëüòàòû èñïûòàíèÿ îïðåäåëÿþò, èñõîäÿ èç èçìåðåííîãî èëè ðàññ÷èòàííîãî ñèã- íàëà èññëåäóåìîãî âåùåñòâà, ñ ïîìîùüþ îáðàò- íîé ôóíêöèè.  èñïûòàíèÿõ íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè êàê ìåòîäîì âíåøíåãî ñòàíäàðòà ñ èñïîëüçîâàíèåì â êà÷åñòâå ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ ðàçâåäåííîãî èñ- ïûòóåìîãî ðàñòâîðà, òàê è ìåòîäîì âíóòðåííåé íîðìàëèçàöèè ïðèìåíÿþò ïîïðàâî÷íûå êîýô- ôèöèåíòû, ïðèâåäåííûå â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåé- íîé ñòàòüå (ò.å. êîãäà êîýôôèöèåíò ÷óâñòâèòåëü- íîñòè âûõîäèò çà ïðåäåëû îò 0,8 äî 1,2). Åñëè â èñïûòàíèè íà ðîäñòâåííûå ïðèìåñè îïðåäåëÿþò ñóììó ïðèìåñåé èëè ïðîâîäÿò êî- ëè÷åñòâåííîå îïðåäåëåíèå ïðèìåñè, âàæíî âû- áðàòü ñîîòâåòñòâóþùèå ïîðîãîâûå çíà÷åíèÿ è ïîäõîäÿùèå óñëîâèÿ äëÿ èíòåãðèðîâàíèÿ ïëî- ùàäåé ïèêîâ.  òàêèõ èñïûòàíèÿõ íåó÷èòûâàå- ìûé ïðåäåë îáû÷íî ñîñòàâëÿåò 0,05 %.
Èíòåãðè- ðîâàíèå ïëîùàäè ïèêà ëþáîé ïðèìåñè, êîòîðàÿ íå ïîëíîñòüþ ðàçäåëÿåòñÿ ñ îñíîâíûì ïèêîì, ïðåèìóùåñòâåííî ïðîâîäÿò ýêñòðàïîëÿöèåé ïî íèæíèì òî÷êàì ïèêà (ïî êàñàòåëüíîé). 201020037-2019 2.1.2.37. Êàïèëëÿðíûé ýëåêòðîôîðåç ÎÁÙÈÅ ÏÐÈÍÖÈÏÛ Êàïèëëÿðíûé ýëåêòðîôîðåç ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ôèçè÷åñêèé ìåòîä àíàëèçà, îñíîâàííûé íà ìèãðàöèè âíóòðè êàïèëëÿðà çàðÿæåííûõ ÷àñ- òèö îïðåäåëÿåìûõ âåùåñòâ, ðàñòâîðåííûõ â ðàñòâîðå ýëåêòðîëèòà, ïîä âëèÿíèåì ïîñòîÿííî- ãî ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ. Ñêîðîñòü ìèãðàöèè ÷àñòèö îïðåäåëÿåìîãî âåùåñòâà ïîä âëèÿíèåì ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ ñ íàïðÿæåííîñòüþ E îïðåäåëÿåòñÿ èõ ýëåêòðîôî- ðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòüþ è ýëåêòðîîñìîòè÷å- ñêîé ïîäâèæíîñòüþ áóôåðíîãî ðàñòâîðà âíóòðè êàïèëëÿðà. Ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà (mep) çàâèñèò îò åãî ñâîéñòâ (ýëåêòðè÷åñêèé çàðÿä, ðàçìåð è ôîðìà ìîëåêóë) è îò ñâîéñòâ áóôåðíîãî ðàñòâîðà, â êî- òîðîì ïðîèñõîäèò ïðîöåññ ìèãðàöèè (òèï è èîííàÿ ñèëà ýëåêòðîëèòà, çíà÷åíèå ðÍ, âÿçêîñòü è íàëè÷èå äîáàâîê). Ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ñêî- ðîñòü ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà (vep), ÷àñòèöû êî- òîðîãî ïðèíèìàþòñÿ çà ñôåðè÷åñêèå, îïèñûâà- åòñÿ óðàâíåíèåì: v E q r V L ep ep= × = × × æ è ç ö ø ÷ ×æ è ç ö ø ÷m p h6 , ãäå: q — ýôôåêòèâíûé çàðÿä âåùåñòâà; r — Ñòîêñîâñêèé ðàäèóñ ÷àñòèö âåùåñòâà; h — âÿçêîñòü ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà; V — ïðèëîæåííîå íàïðÿæåíèå; L — îáùàÿ äëèíà êàïèëëÿðà. Ïðè ïîìåùåíèè êàïèëëÿðà, çàïîëíåííîãî áóôåðíûì ðàñòâîðîì, â ýëåêòðè÷åñêîå ïîëå âíóòðè êàïèëëÿðà íà÷èíàåòñÿ ïåðåìåùåíèå ðàñ- òâîðèòåëÿ, íàçûâàåìîå ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèì ïîòîêîì. Ñêîðîñòü ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòî- êà çàâèñèò îò ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîé ïîäâèæíî- 106 ñòè (meo), êîòîðàÿ, â ñâîþ î÷åðåäü, çàâèñèò îò ïëîòíîñòè çàðÿäà íà âíóòðåííåé ñòåíêå êàïèë- ëÿðà è ñâîéñòâ áóôåðíîãî ðàñòâîðà. Ýëåêòðîîñ- ìîòè÷åñêàÿ ñêîðîñòü (veo) îïèñûâàåòñÿ óðàâíå- íèåì: v E V L eo eo= × = ×æ è ç ö ø ÷ ×æ è ç ö ø ÷m e z h , ãäå: e — äèýëåêòðè÷åñêàÿ ïîñòîÿííàÿ áóôåðíî- ãî ðàñòâîðà; z — äçåòà-ïîòåíöèàë ïîâåðõíîñòè êàïèë- ëÿðà. Ñêîðîñòü âåùåñòâà (v ) îïðåäåëÿåòñÿ êàê: v v vep eo= + .  çàâèñèìîñòè îò çàðÿäà ÷àñòèö âåùåñòâà åãî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü è ýëåê- òðîîñìîòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü ìîãóò èìåòü îäèíàêîâîå èëè ïðîòèâîïîëîæíîå íàïðàâëåíèå.  óñëîâèÿõ íîðìàëüíîãî êàïèëëÿðíîãî ýëåêòðî- ôîðåçà àíèîíû ïåðåìåùàþòñÿ â íàïðàâëåíèè, ïðîòèâîïîëîæíîì íàïðàâëåíèþ ýëåêòðîîñìî- òè÷åñêîãî ïîòîêà, à èõ ñêîðîñòè ìåíüøå ýëåê- òðîîñìîòè÷åñêîé ñêîðîñòè. Êàòèîíû ìèãðèðó- þò â íàïðàâëåíèè, ñîâïàäàþùåì ñ íàïðàâëåíè- åì ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà, à èõ ñêîðîñòè ïðåâûøàþò ýëåêòðîîñìîòè÷åñêóþ ñêîðîñòü.  óñëîâèÿõ, êîãäà ýëåêòðîîñìîòè÷åñêàÿ ñêîðîñòü ïðåâûøàåò ýëåêòðîôîðåòè÷åñêóþ, êàòèîíû è àíèîíû ìîãóò áûòü ðàçäåëåíû â òå÷åíèå îäíîãî àíàëèçà. Âðåìÿ (t), íåîáõîäèìîå âåùåñòâó äëÿ ìèãðà- öèè íà ðàññòîÿíèå (l) îò êîíöà êàïèëëÿðà, â êî- òîðûé ââîäèòñÿ âåùåñòâî, äî òî÷êè äåòåêöèè (ýôôåêòèâíàÿ äëèíà êàïèëëÿðà), îïðåäåëÿåòñÿ óðàâíåíèåì: t I v v I L Vep eo ep eo = + = × + ×( ) . m m  îáùåì, ïðè çíà÷åíèè ðÍ áîëåå 3 êàïèëëÿ- ðû ñ íåìîäèôèöèðîâàííîé ïîâåðõíîñòüþ, èçãî- òîâëåííûå èç ïëàâëåíîãî êâàðöà, èìåþò îòðèöà- òåëüíûé çàðÿä, îáóñëîâëåííûé èîíèçàöèåé ñèëàíîëüíûõ ãðóïï, ðàñïîëîæåííûõ íà âíóò- ðåííåé ñòåíêå êàïèëëÿðà. Ñîîòâåòñòâåííî, ýëåê- òðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê íàïðàâëåí îò àíîäà ê êàòîäó. Äëÿ äîñòèæåíèÿ íàäëåæàùåé âîñïðîèç- âîäèìîñòè ñêîðîñòè ìèãðàöèè ðàñòâîðåííûõ âåùåñòâ îò àíàëèçà ê àíàëèçó, ýëåêòðîîñìîòè÷å- ñêèé ïîòîê äîëæåí îñòàâàòüñÿ ïîñòîÿííûì.  íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ òðåáóåòñÿ óìåíüøèòü èëè óñòðàíèòü ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê ïóòåì ìîäèôèêàöèè âíóòðåííåé ñòåíêè êàïèëëÿðà èëè èçìåíåíèÿ êîíöåíòðàöèè, ñîñòàâà è/èëè ðÍ áó- ôåðíîãî ðàñòâîðà.
Ïîñëå ââåäåíèÿ èñïûòóåìîãî îáðàçöà â êà- ïèëëÿð êàæäûé èîí îïðåäåëÿåìîãî âåùåñòâà, âõîäÿùåãî â ñîñòàâ ïðîáû, ìèãðèðóåò â ñðåäå ôîíîâîãî ýëåêòðîëèòà ñîãëàñíî ñâîåé ýëåêòðî- ôîðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòè êàê íåçàâèñèìàÿ çîíà. Äèñïåðñèÿ çîíû, ïðåäñòàâëÿþùàÿ ñîáîé óøèðåíèå ïîëîñû êàæäîãî âåùåñòâà, ÿâëÿåòñÿ ñëåäñòâèåì ðàçëè÷íûõ ÿâëåíèé.  èäåàëüíûõ óñëîâèÿõ âêëàä â ïðîöåññ óøèðåíèÿ çîíû âåùå- ñòâà âíîñèò òîëüêî ìîëåêóëÿðíàÿ äèôôóçèÿ âå- ùåñòâà âäîëü êàïèëëÿðà (ïðîäîëüíàÿ äèôôó- çèÿ).  òàêîì èäåàëüíîì ñëó÷àå ýôôåêòèâíîñòü çîíû, âûðàæàåìàÿ ÷èñëîì òåîðåòè÷åñêèõ òàðå- ëîê (N), îïðåäåëÿåòñÿ êàê: N V I D L ep eo = + × × × × ( ) , m m 2 ãäå: D — êîýôôèöèåíò ìîëåêóëÿðíîé äèôôóçèè âåùåñòâà â áóôåðíîì ðàñòâîðå. Íà ïðàêòèêå çíà÷èòåëüíûé âêëàä â äèñïåð- ñèþ ïîëîñû âíîñÿò ïðîöåññû òåïëîâîé êîíâåê- öèè, àäñîðáöèè îáðàçöà íà ñòåíêàõ êàïèëëÿðà, à òàêæå íåîäèíàêîâàÿ ïðîâîäèìîñòü ìåæäó îá- ðàçöîì è áóôåðíûì ðàñòâîðîì, äëèíà óñòðîéñò- âà äëÿ ââîäà ïðîáû, ðàçìåð ÿ÷åéêè äåòåêòîðà è ðàñïîëîæåíèå åìêîñòåé ñ áóôåðíûìè ðàñòâîðà- ìè íà ðàçíûõ óðîâíÿõ. Ðàçäåëåíèå äâóõ ïîëîñ (âûðàæàåìîå êàê ðàç- ðåøåíèå, Rs) ìîæåò áûòü äîñòèãíóòî ïðè èçìå- íåíèè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòè ÷àñ- òèö îïðåäåëÿåìûõ âåùåñòâ èýëåêòðîîñìîòè÷å- ñêîé ïîäâèæíîñòè, à òàêæå ïðè óâåëè÷åíèè ýôôåêòèâíîñòè ïîëîñû äëÿ êàæäîãî îïðåäåëÿå- ìîãî âåùåñòâà, ñîãëàñíî óðàâíåíèþ: R N s epb epa ep eo = - + ( ) ( ) , m m m m4 ãäå: mepa è mepb — ýëåêòðîôîðåòè÷åñêèå ïîä- âèæíîñòè äâóõ ðàçäåëÿåìûõ âåùåñòâ; mep — ñðåäíÿÿ ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü äâóõ îïðåäåëÿåìûõ âåùåñòâ m m mep epb epa= + 1 2 ( ). ÏÐÈÁÎÐ Ïðèáîð äëÿ êàïèëëÿðíîãî ýëåêòðîôîðåçà ñîñòîèò èç: – ðåãóëèðóåìîãî âûñîêîâîëüòíîãî èñòî÷íè- êà ïîñòîÿííîãî òîêà; 107 – äâóõ ðåçåðâóàðîâ ñ áóôåðíûìè ðàñòâîðà- ìè, ðàñïîëîæåííûõ íà îäíîì è òîì æå óðîâíå è ñîäåðæàùèõ óêàçàííûå àíîäíûé è êàòîäíûé ðàñòâîðû; – äâóõ ýëåêòðîäîâ (êàòîäà è àíîäà), ïîãðó- æåííûõ â ðåçåðâóàðû ñ áóôåðíûìè ðàñòâîðàìè è ñîåäèíåííûõ ñ èñòî÷íèêîì ïèòàíèÿ; – êàïèëëÿðà, â êîòîðîì ïðîâîäèòñÿ ðàçäåëå- íèå (îáû÷íî èçãîòîâëåííîãî èç ïëàâëåíîãî êâàðöà); ïðè èñïîëüçîâàíèè íåêîòîðûõ òèïîâ äåòåêòîðîâ êàïèëëÿð èìååò îïòè÷åñêîå îêîøêî, ðàñïîëîæåííîå íà óðîâíå äåòåêòîðà; êîíöû êà- ïèëëÿðà ïîìåùåíû â ðåçåðâóàðû ñ áóôåðíûìè ðàñòâîðàìè; êàïèëëÿð çàïîëíÿþò ðàñòâîðîì, óêàçàííûì â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå; – ïîäõîäÿùåé ñèñòåìû ââîäà ïðîáû; – äåòåêòîðà, ñïîñîáíîãî êîíòðîëèðîâàòü êî- ëè÷åñòâî îïðåäåëÿåìûõ âåùåñòâ, ïðîõîäÿùèõ- ÷åðåç ðàçäåëÿþùèé ñåãìåíò êàïèëëÿðà â òå÷å- íèå îïðåäåëåííîãî âðåìåíè; äåòåêòèðîâàíèå îáû÷íî îñíîâàíî íà àáñîðáöèîííîé ñïåêòðîôî- òîìåòðèè (â óëüòðàôèîëåòîâîé è âèäèìîé îá- ëàñòÿõ) èëè ôëóîðèìåòðèè, â ðÿäå ñëó÷àåâ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî òàêæå êîíäóêòîìåò- ðè÷åñêîå, àìïåðîìåòðè÷åñêîå èëè ìàññ-ñïåê- òðîìåòðè÷åñêîå äåòåêòèðîâàíèå; àëüòåðíàòèâ- íûì ñïîñîáîì äåòåêòèðîâàíèÿ âåùåñòâ, êîòî- ðûå íå ïîãëîùàþò ÓÔ-èçëó÷åíèå è íå ôëóîðåñöèðóþò, ÿâëÿåòñÿ íåïðÿìîå äåòåêòèðî- âàíèå; – òåðìîñòàòà, ñïîñîáíîãî ïîääåðæèâàòü ïî- ñòîÿííóþ òåìïåðàòóðó âíóòðè êàïèëëÿðà äëÿ ïîëó÷åíèÿ âîñïðîèçâîäèìûõ ðåçóëüòàòîâ ðàçäå- ëåíèÿ; – ðåãèñòðèðóþùåãî óñòðîéñòâà è ïîõîäÿ- ùåãî èíòåãðàòîðà èëè êîìïüþòåðà. Äëÿ òî÷íîãî êîëè÷åñòâåííîãî àíàëèçà êðè- òè÷åñêèìè ôàêòîðàìè ÿâëÿþòñÿ îïðåäåëåíèå ïðîöåññà ââîäà ïðîáû è åãî àâòîìàòèçàöèÿ. Ââîä ïðîáû ìîæåò áûòü îñíîâàí íà èñïîëüçîâà- íèè ñèëû òÿæåñòè, äàâëåíèÿ, âàêóóìà è ýëåêòðî- êèíåòè÷åñêèõ ñèë. Êîëè÷åñòâî êàæäîãî êîìïî- íåíòà îáðàçöà, ââåäåííîãî ýëåêòðîêèíåòè÷å- ñêèì ñïîñîáîì, çàâèñèò îò åãî ýëåêòðîôîðåòè- ÷åñêîé ïîäâèæíîñòè, ÷òî ïðèâîäèò ê âîçìîæ- íûì íåðàâíûì óñëîâèÿì äëÿ ðàçíûõ âåùåñòâ ïðè èñïîëüçîâàíèè äàííîãî ðåæèìà ââîäà ïðîáû.
Èñïîëüçóþò êàïèëëÿð, áóôåðíûå ðàñòâîðû, ïðåäâàðèòåëüíóþ ïîäãîòîâêó, ðàñòâîð ïðîáû è óñëîâèÿ ìèãðàöèè, óêàçàííûå â ÷àñòíîé ôàðìà- êîïåéíîé ñòàòüå äëÿ èñïûòóåìîãî îáðàçöà. Ïðè- ìåíÿåìûé ðàñòâîð ýëåêòðîëèòà ôèëüòðóþò äëÿ óäàëåíèÿ òâåðäûõ ÷àñòèö è äåãàçèðóþò äëÿ ïðå- äîòâðàùåíèÿ îáðàçîâàíèÿ ïóçûðüêîâ, ìåøàþ- ùèõ ðàáîòå äåòåêòîðà è ñîçäàíèþ ýëåêòðè÷åñêî- ãî êîíòàêòà â êàïèëëÿðå âî âðåìÿ ïðîöåññà ðàç- äåëåíèÿ. Äëÿ îáåñïå÷åíèÿ âîñïðîèçâîäèìûõ çíà÷åíèé âðåìåíè ìèãðàöèè âåùåñòâ äëÿ êàæ- äîé àíàëèòè÷åñêîé ìåòîäèêè äîëæíà áûòü ðàç- ðàáîòàíà ìåòîäèêà òùàòåëüíîé ïðîìûâêè ñèñ- òåìû. ÊÀÏÈËËßÐÍÛÉ ÇÎÍÍÛÉ ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÏÐÈÍÖÈÏ Â êàïèëëÿðíîì çîííîì ýëåêòðîôîðåçå îïðå- äåëÿåìûå âåùåñòâà ðàçäåëÿþòñÿ â êàïèëëÿðå, ñîäåðæàùåì òîëüêî áóôåðíûé ðàñòâîð áåç êàêîé-ëèáî ïðîòèâîòî÷íîé ñðåäû.  äàííîì ìåòîäå ðàçäåëåíèå îáóñëîâëåíî ìèãðàöèåé ðàç- ëè÷íûõ êîìïîíåíòîâ îáðàçöà ñ ðàçëè÷íîé ñêî- ðîñòüþ â âèäå îòäåëüíûõ ïîëîñ. Ñêîðîñòü ïåðå- ìåùåíèÿ êàæäîé ïîëîñû çàâèñèò îò ýëåêòðîôî- ðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòè ÷àñòèö ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà è ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà â êà- ïèëëÿðå (ñì. Îáùèå ïðèíöèïû). Äëÿ óëó÷øåíèÿ ðàçäåëåíèÿ âåùåñòâ, àäñîðáèðóþùèõñÿ íà êâàð- öåâîé ïîâåðõíîñòè, ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êàïèëëÿðû ñ ìîäèôèöèðîâàííîé ïîâåðõíîñòüþ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè äàííîãî âèäà êàïèëëÿð- íîãî ýëåêòðîôîðåçà âîçìîæíî ïðîâåäåíèå àíà- ëèçà êàê ìàëûõ (Mr < 2000), òàê è áîëüøèõ ìî- ëåêóë (2000 < Mr < 100 000). Áëàãîäàðÿ âûñîêîé ýôôåêòèâíîñòè êàïèëëÿðíîãî çîííîãî ýëåêòðî- ôîðåçà ìîæåò áûòü ïðîâåäåíî ðàçäåëåíèå ìîëå- êóë, èìåþùèõ î÷åíü íåçíà÷èòåëüíûå ðàçëè÷èÿ â âåëè÷èíàõ îòíîøåíèé çàðÿäà ê ìàññå. Ïðè äî- áàâëåíèè ê ðàçäåëÿþùåìó áóôåðíîìó ðàñòâîðó õèðàëüíûõ ñåëåêòîðîâ ìîæíî ðàçäåëÿòü õèðàëü- íûå ñîåäèíåíèÿ. ÎÏÒÈÌÈÇÀÖÈß Îïòèìèçàöèÿ ðàçäåëåíèÿ ÿâëÿåòñÿ êîì- ïëåêñíûì ïðîöåññîì, â êîòîðîì îñíîâíóþ ðîëü ìîãóò èãðàòü íåñêîëüêî ïàðàìåòðîâ ðàçäåëåíèÿ. Îñíîâíûìè ôàêòîðàìè, êîòîðûå ñëåäóåò ïðèíè- ìàòü âî âíèìàíèå ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèê ðàç- äåëåíèÿ, ÿâëÿþòñÿ èíñòðóìåíòàëüíûå ïàðàìåò- ðû, à òàêæå ïàðàìåòðû ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà. Èíñòðóìåíòàëüíûå ïàðàìåòðû Íàïðÿæåíèå. Äëÿ îïòèìèçàöèè ïðèëàãàåìî- ãî íàïðÿæåíèÿ è òåìïåðàòóðû êàïèëëÿðà ïîëå- 108 çåí ãðàôèê Äæîóëåâà íàãðåâà. Âðåìÿ ðàçäåëå- íèÿ îáðàòíî ïðîïîðöèîíàëüíî ïðèëîæåííîìó íàïðÿæåíèþ. Îäíàêî óâåëè÷åíèå íàïðÿæåíèÿ ìîæåò âûçâàòü èçáûòî÷íîå âûäåëåíèå òåïëà, ïîâûøåíèå òåìïåðàòóðû è, êàê ðåçóëüòàò, îáðà- çîâàíèå ãðàäèåíòîâ âÿçêîñòè â áóôåðíîì ðàñ- òâîðå, íàõîäÿùåìñÿ â êàïèëëÿðå. Äàííûé ýô- ôåêò ïðèâîäèò ê óøèðåíèþ ïîëîñû è óìåíüøå- íèþ ðàçðåøåíèÿ. Ïîëÿðíîñòü. Ïîëÿðíîñòü ýëåêòðîäîâ ìîæåò áûòü íîðìàëüíîé (àíîä íà âõîäå è êàòîä íà âû- õîäå), ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê ïðè ýòîì ïå- ðåìåùàåòñÿ ïî íàïðàâëåíèþ ê êàòîäó.  ñëó÷àå îáðàùåííîé ïîëÿðíîñòè ýëåêòðîäîâ ýëåêòðîîñ- ìîòè÷åñêèé ïîòîê íàïðàâëåí îò âûõîäà èç êà- ïèëëÿðà, è òîëüêî çàðÿæåííûå îïðåäåëÿåìûå âåùåñòâàñ ýëåêòðîôîðåòè÷åñêèìè ïîäâèæíî- ñòÿìè, ïðåâûøàþùèìè âåëè÷èíó ýëåêòðîôîðå- òè÷åñêîãî ïîòîêà, ïîïàäàþò ê âûõîäó. Òåìïåðàòóðà. Òåìïåðàòóðà âëèÿåò, ãëàâíûì îáðàçîì, íà âÿçêîñòü è ýëåêòðè÷åñêóþ ïðîâîäè- ìîñòü è, êàê ñëåäñòâèå, íà ñêîðîñòü ìèãðàöèè.  íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ óâåëè÷åíèå òåìïåðàòóðû êà- ïèëëÿðà ìîæåò âûçâàòü êîíôîðìàöèîííûå èç- ìåíåíèÿ â ìîëåêóëàõ áåëêîâ, ÷òî èçìåíÿåò èõ âðåìåíà ìèãðàöèè è ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ. Êàïèëëÿð. Ðàçìåðû êàïèëëÿðà (äëèíà è âíóòðåííèé äèàìåòð) âëèÿþò íà âðåìÿ àíàëèçà, ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ è çàãðóçî÷íóþ åì- êîñòü. Óâåëè÷åíèå êàê ýôôåêòèâíîé, òàê è îá- ùåé äëèíû êàïèëëÿðà ìîæåò îñëàáèòü ýëåêòðè- ÷åñêîå ïîëå (â ñëó÷àå ðàáîòû ïðè ïîñòîÿííîì íàïðÿæåíèè), ÷òî ïðèâîäèò ê óâåëè÷åíèþ âðå- ìåíè ìèãðàöèè.
Äëÿ îïðåäåëåííîãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà è ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ òåïëîâàÿ êîí- âåêöèÿ è, ñëåäîâàòåëüíî, óøèðåíèå ïîëîñ îá- ðàçöà çàâèñèò îò âåëè÷èíû âíóòðåííåãî äèàìåò- ðà êàïèëëÿðà. Êðîìå ýòîãî, âåëè÷èíà âíóòðåí- íåãî äèàìåòðà êàïèëëÿðà âëèÿåò íà ïðåäåë îáíàðóæåíèÿ, çàâèñÿùèé îò îáúåìà ââåäåííîé ïðîáû è èñïîëüçóåìîãî äåòåêòîðà. Ïîñêîëüêó àäñîðáöèÿ êîìïîíåíòîâ îáðàçöà íà ñòåíêå êàïèëëÿðà îãðàíè÷èâàåò ýôôåêòèâ- íîñòü, ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèêè ðàçäåëåíèÿ ñëå- äóåò ïðåäóñìîòðåòü ñïîñîáû ïðåäîòâðàùåíèÿ òàêèõ âçàèìîäåéñòâèé.  ñëó÷àå áåëêîâ âî èçáå- æàíèå èõ àäñîðáöèè áûëî ðàçðàáîòàíî íåñêîëü- êî ñïîñîáîâ. Íåêîòîðûå èç òàêèõ ñïîñîáîâ (èñ- ïîëüçîâàíèå ýêñòðåìàëüíûõ çíà÷åíèé ðÍ è àä- ñîðáöèÿ ïîëîæèòåëüíî çàðÿæåííûõ áóôåðíûõ äîáàâîê) äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ àäñîðáöèè áåëêîâ òðåáóþò ëèøü èçìåíåíèÿ ñîñòàâà áóôåðíîé ñìåñè.  äðóãèõ ñïîñîáàõ âíóòðåííÿÿ ñòåíêà êà- ïèëëÿðà ïîêðûâàåòñÿ ïîëèìåðîì, êîâàëåíòíî ñâÿçàííûì ñ ïîâåðõíîñòüþ, ÷òî ïðåäîòâðàùàåò âçàèìîäåéñòâèå ìåæäó áåëêàìè è îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííîé ïîâåðõíîñòüþ êâàðöà. Äëÿ ýòèõ öå- ëåé âûïóñêàþòñÿ ãîòîâûå ê èñïîëüçîâàíèþ êà- ïèëëÿðû ñ ïîêðûòèÿìè, ñîñòîÿùèìè èç íåé- òðàëüíûõ ãèäðîôèëüíûõ, êàòèîííûõ èëè àíè- îííûõ ïîëèìåðîâ. Ïàðàìåòðû ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà Òèï è êîíöåíòðàöèÿ áóôåðíîãî ðàñòâîðà. Áóôåðíûå ðàñòâîðû, ïîäõîäÿùèå äëÿ êàïèëëÿð- íîãî ýëåêòðîôîðåçà, èìåþò ñîîòâåòñòâóþùóþ áóôåðíóþ åìêîñòü â âûáðàííîì äèàïàçîíå ðÍ è íèçêóþ ïîäâèæíîñòü äëÿ ìèíèìèçàöèè îáðàçî- âàíèÿ òîêà. Ïîäáîð âî âñåõ âîçìîæíûõ ñëó÷àÿõ áóôåð- íîãî èîíà ñ ïîäâèæíîñòüþ, ñîîòâåòñòâóþùåé ïîäâèæíîñòè ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà, âàæåí äëÿ ìèíèìèçàöèè èñêàæåíèÿ ïîëîñû. Òèï ðàñ- òâîðèòåëÿ, èñïîëüçîâàííîãî äëÿ ðàñòâîðåíèÿ îïðåäåëÿåìîãî âåùåñòâà, òàêæå âàæåí äëÿ äîñ- òèæåíèÿ ôîêóñèðîâàíèÿ âåùåñòâà íà êîëîíêå, ÷òî óâåëè÷èâàåò ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ è óëó÷øàåò äåòåêòèðîâàíèå. Óâåëè÷åíèå êîíöåíòðàöèè áóôåðíîãî ðàñ- òâîðà (äëÿ äàííîãî çíà÷åíèÿ pH) óìåíüøàåò ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê è ñêîðîñòü ìèãðà- öèè ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà. Çíà÷åíèå ðÍ áóôåðíîãî ðàñòâîðà. Çíà÷åíèå ðÍ áóôåðíîãî ðàñòâîðà ìîæåò âëèÿòü íà ðàçäå- ëåíèå âñëåäñòâèå èçìåíåíèÿ çàðÿäà îïðåäåëÿå- ìîãî âåùåñòâà èëè äîáàâîê, à òàêæå ýëåêòðîîñ- ìîòè÷åñêîãî ïîòîêà. Ïðè ðàçäåëåíèè áåëêîâ è ïåïòèäîâ èçìåíåíèå ðÍ áóôåðíîãî ðàñòâîðà îò çíà÷åíèÿ, ïðåâûøàþùåãî èçîýëåêòðè÷åñêóþ òî÷êó (pI), äî çíà÷åíèÿ, êîòîðîå ìåíüøå åå, èç- ìåíÿåò ñóììàðíûé îòðèöàòåëüíûé çàðÿä âåùå- ñòâà íà ïîëîæèòåëüíûé. Óâåëè÷åíèå ðÍ áóôåð- íîãî ðàñòâîðà îáû÷íî óâåëè÷èâàåò ýëåêòðîîñ- ìîòè÷åñêèé ïîòîê. Îðãàíè÷åñêèå ðàñòâîðèòåëè. Ê âîäíûì áó- ôåðíûì ðàñòâîðàì äëÿ óâåëè÷åíèÿ ðàñòâîðèìî- ñòè âåùåñòâ èëè äðóãèõ äîáàâîê, è/èëè âîçäåé- ñòâèÿ íà ñòåïåíü èîíèçàöèè êîìïîíåíòîâ îáðàç- öà ìîãóò áûòü äîáàâëåíû îðãàíè÷åñêèå ìîäèôèêàòîðû (ìåòàíîë, àöåòîíèòðèë è äð.). Äîáàâëåíèå òàêèõ îðãàíè÷åñêèõ ìîäèôèêàòî- ðîâ ê áóôåðíîìó ðàñòâîðó îáû÷íî âûçûâàåò óìåíüøåíèå ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà. Äîáàâêè äëÿ õèðàëüíûõ ðàçäåëåíèé. Äëÿ ðàç- äåëåíèÿ îïòè÷åñêèõ èçîìåðîâ ê ðàçäåëÿþùåìó 109 áóôåðíîìó ðàñòâîðó äîáàâëÿþò õèðàëüíûé ñå- ëåêòîð. Íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåìûìè õèðàëü- íûìè ñåëåêòîðàìè ÿâëÿþòñÿ öèêëîäåêñòðèíû, íî êðîìå ýòîãî ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êðà- óí-ýôèðû, ïîëèñàõàðèäû è áåëêè. Ïîñêîëüêó õèðàëüíîå ðàñïîçíàâàíèå óïðàâëÿåòñÿ ðàçëè÷- íûìè âçàèìîäåéñòâèÿìè ìåæäó õèðàëüíûì ñå- ëåêòîðîì è êàæäûì èç ýíàíòèîìåðîâ, ðàçðåøå- íèå, äîñòèãàåìîå äëÿ õèðàëüíûõ ñîåäèíåíèé, çàâèñèò, ãëàâíûì îáðàçîì, îò òèïà èñïîëüçîâàí- íîãî õèðàëüíîãî ñåëåêòîðà.
 ñâÿçè ñ ýòèì ïðè ðàçðàáîòêå äàííûõ ìåòîäèê ðàçäåëåíèÿ ìîæåò îêàçàòüñÿ ïîëåçíûì èñïûòàíèå ñ öèêëîäåêñòðè- íàìè ñ ðàçëè÷íûì ðàçìåðîì ïîëîñòåé (á-, â- èëè ã-öèêëîäåêñòðèí) èëè ìîäèôèöèðîâàííû- ìè öèêëîäåêñòðèíàìè ñ íåéòðàëüíûìè (ìåòèë-, ýòèë-, ãèäðîêñèàëêèë- è äðóãèå) èëè ñïîñîáíû- ìè ê èîíèçàöèè (àìèíîìåòèë-, êàðáîêñèìåòèë-, ñóëüôîáóòèëîâûå ýôèðû è äðóãèå) ãðóïïàìè. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ìîäèôèöèðîâàííûõ öèêëî- äåêñòðèíîâ ñëåäóåò ïðèíèìàòü âî âíèìàíèå ðàçëè÷èÿ â ñòåïåíè çàìåùåíèÿ ìåæäó ðàçíûìè ïàðòèÿìè äàííûõ âåùåñòâ, ïîñêîëüêó ýòî ìîæåò îêàçûâàòü âëèÿíèå íà ñåëåêòèâíîñòü. Äðóãèìè ôàêòîðàìè, êîíòðîëèðóþùèìè ðàçðåøåíèå ïðè õèðàëüíûõ ðàçäåëåíèÿõ, ÿâëÿþòñÿ êîíöåíòðà- öèÿ õèðàëüíîãî ñåëåêòîðà, ñîñòàâ è çíà÷åíèå ðÍ áóôåðíîãî ðàñòâîðà, à òàêæå òåìïåðàòóðà. Äîñ- òèãíóòóþ âåëè÷èíó ðàçðåøåíèÿ òàêæå ìîæåò èçìåíÿòü èñïîëüçîâàíèå îðãàíè÷åñêèõ äîáàâîê, òàêèõ êàê ìåòàíîë èëè ìî÷åâèíà. ÊÀÏÈËËßÐÍÛÉ ÃÅËÜ-ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÏÐÈÍÖÈÏ Â êàïèëëÿðíîì ãåëü-ýëåêòðîôîðåçå ðàçäåëå- íèå ïðîèñõîäèò âíóòðè êàïèëëÿðà, çàïîëíåííî- ãî ãåëåì, äåéñòâóþùèì êàê ìîëåêóëÿðíîå ñèòî. Ïîñêîëüêó ìîëåêóëû ìåíüøåãî ðàçìåðà ëåã÷å ïðîíèêàþò â ñòðóêòóðó ãåëÿ è ìèãðèðóþò áûñò- ðåå, ÷åì áîëüøèå, ðàçäåëåíèå ìîëåêóë ñ áëèçêè- ìè âåëè÷èíàìè îòíîøåíèÿ çàðÿäà ê ìàññå ïðî- èñõîäèò â ñîîòâåòñòâèè ñ èõ ðàçìåðàìè. Òàêèì îáðàçîì, ìåòîäîì êàïèëëÿðíîãî ãåëü-ýëåêòðî- ôîðåçà ïî âåëè÷èíàì ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ ìîãóò áûòü ðàçäåëåíû ðàçëè÷íûå áèîëîãè÷åñêèå ìàê- ðîìîëåêóëû (íàïðèìåð, áåëêè è ôðàãìåíòû ÄÍÊ), ÷àñòî èìåþùèå áëèçêèå âåëè÷èíû îòíî- øåíèÿ çàðÿäà ê ìàññå. ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÈ ÃÅËÅÉ Â êàïèëëÿðíîì ýëåêòðîôîðåçå èñïîëüçóþò ãåëè äâóõ òèïîâ: õèìè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàí- íûå è äèíàìè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå. Õèìè- ÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå ãåëè, íàïðèìåð, ïî- ïåðå÷íî-ñøèòûé ïîëèàêðèëàìèä, ïîëó÷àþò ïî- ëèìåðèçàöèåé ìîíîìåðîâ âíóòðè êàïèëëÿðà. Îíè îáû÷íî õèìè÷åñêè ñâÿçàíû ñ ïîâåðõíî- ñòüþ ïëàâëåíîãî êâàðöà è íå ìîãóò áûòü óäàëå- íû áåç ðàçðóøåíèÿ êàïèëëÿðà. Åñëè ãåëè èñ- ïîëüçóþòñÿ äëÿ àíàëèçà áåëêîâ, ðàçäåëÿþùèé áóôåðíûé ðàñòâîð îáû÷íî ñîäåðæèò íàòðèÿ äî- äåöèëñóëüôàò è ïðîáû ïåðåä ââîäîì äåíàòóðè- ðóþò íàãðåâàíèåì â ñìåñè íàòðèÿ äîäåöèëñóëü- ôàòà è 2-ìåðêàïòîýòàíîëà èëè äèòèîòðåèòîëà. Ïðè èñïîëüçîâàíèè íå âîññòàíàâëèâàþùèõ óñ- ëîâèé (íàïðèìåð, àíàëèç èíòàêòíîãî àíòèòåëà) 2-ìåðêàïòîýòàíîë è äèòèîòðåèòîë íå ïðèìåíÿ- þò. Ðàçäåëåíèå íà ïîïåðå÷íî-ñøèòûõ ãåëÿõ ìî- æåò áûòü îïòèìèçèðîâàííî èçìåíåíèåì ðàçäå- ëÿþùåãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà (â ñîîòâåòñòâèè ñ óêàçàíèÿìè â ðàçäåëå, ïîñâÿùåííîì êàïèëëÿð- íîìó çîííîìó ýëåêòðîôîðåçó), è êîíòðîëåì ïî- ðèñòîñòè ãåëÿ âî âðåìÿ åãî ïîëó÷åíèÿ. Ïîðèñ- òîñòü ïîïåðå÷íî-ñøèòûõ ïîëèàêðèëàìèäíûõ ãåëåé ìîæåò áûòü ìîäèôèöèðîâàíà ïóòåì èçìå- íåíèÿ êîíöåíòðàöèè àêðèëàìèäà è/èëè ïðîïîð- öèè ñøèâàþùåãî ðåàãåíòà. Êàê ïðàâèëî, óìåíü- øåíèå ïîðèñòîñòè ãåëÿ ïðèâîäèò ê óìåíüøå- íèþ ïîäâèæíîñòè ðàçäåëÿåìûõ âåùåñòâ. Âñëåäñòâèå æåñòêîñòè ïîäîáíûõ ãåëåé ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí òîëüêî ýëåêòðîêèíåòè÷åñêèé ââîä ïðîáû. Äèíàìè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå ãåëè ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé ãèäðîôèëüíûå ïîëè- ìåðû, òàêèå êàê ëèíåéíûé ïîëèàêðèëàìèä, ïðî- èçâîäíûå öåëëþëîçû, äåêñòðàí è äðóãèå, ñïî- ñîáíûå ðàñòâîðÿòüñÿ â âîäíûõ ðàçäåëÿþùèõ áó- ôåðíûõ ðàñòâîðàõ è îáðàçóþùèå ðàçäåëÿþùóþ ñðåäó, êîòîðàÿ òàêæå äåéñòâóåò êàê ìîëåêóëÿð- íîå ñèòî. Òàêèå ðàçäåëÿþùèå ñðåäû ïîëó÷èòü ëåã÷å, ÷åì ïîïåðå÷íî-ñøèòûå ïîëèìåðû. Îíè ìîãóò áûòü ïðèãîòîâëåíû â ïðîáèðêå è ïîìåùå- íû ïîä äàâëåíèåì â êàïèëëÿð ñ ìîäèôèöèðî- âàííîé ïîâåðõíîñòüþ (áåç ýëåêòðîîñìîòè÷åñêî- ãî ïîòîêà). Çàìåíà ãåëÿ ïåðåä êàæäûì ââîäîì- ïðîáû îáû÷íî óëó÷øàåò âîñïðîèçâîäèìîñòü ðàçäåëåíèÿ.
Ïîðèñòîñòü ãåëåé ìîæåò áûòü óâå- ëè÷åíà ïðè èñïîëüçîâàíèè ïîëèìåðîâ ñ áîëü- øåé ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé (ïðè îïðåäåëåííîé êîíöåíòðàöèè ïîëèìåðà) èëè ïóòåì óìåíüøå- íèÿ êîíöåíòðàöèè ïîëèìåðà (ïðè îïðåäåëåííîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññå ïîëèìåðà). Óìåíüøåíèå 110 ïîðèñòîñòè ãåëÿ ïðèâîäèò ê óìåíüøåíèþ ïîä- âèæíîñòè âåùåñòâà äëÿ òîãî æå ñàìîãî áóôåð- íîãî ðàñòâîðà. Ïîñêîëüêó ïðè ðàñòâîðåíèè òà- êèõ ïîëèìåðîâ â áóôåðíîì ðàñòâîðå îáðàçóþòñÿ ðàñòâîðû ñ íèçêîé âÿçêîñòüþ, ìîæåò áûòü èñ- ïîëüçîâàí êàê ãèäðîäèíàìè÷åñêèé, òàê è ýëåê- òðîêèíåòè÷åñêèé ââîä ïðîáû. ÊÀÏÈËËßÐÍÎÅ ÈÇÎÝËÅÊÒÐÈ×ÅÑÊÎÅ ÔÎÊÓÑÈÐÎÂÀÍÈÅ ÏÐÈÍÖÈÏ Ïðè èçîýëåêòðè÷åñêîì ôîêóñèðîâàíèè ìî- ëåêóëû ìèãðèðóþò ïîä âëèÿíèåì ýëåêòðè÷åñêî- ãî ïîëÿ äî òåõ ïîð, ïîêà îíè îñòàþòñÿ çàðÿæåí- íûìè â ãðàäèåíòå ðÍ, ñîçäàâàåìîì àìôîëèòà- ìè, èìåþùèìè øèðîêèé äèàïàçîí çíà÷åíèé pI (ïîëèàìèíîêàðáîíîâûå êèñëîòû), ðàñòâîðåííû- ìè â áóôåðíîì ðàñòâîðå. Òðåìÿ îñíîâíûìè ñòà- äèÿìè èçîýëåêòðè÷åñêîãî ôîêóñèðîâàíèÿ ÿâëÿ- þòñÿ çàãðóçêà, ôîêóñèðîâàíèå è ìîáèëèçàöèÿ. Ñòàäèÿ çàãðóçêè. Ìîãóò áûòü èñïîëüçîâà- íû äâà ñïîñîáà: – îäíîñòóïåí÷àòàÿ çàãðóçêà: ïðîáà ñìåøè- âàåòñÿ ñ àìôîëèòàìè è ââîäèòñÿ â êàïèëëÿð ïîä äàâëåíèåì èëè ñ ïîìîùüþ âàêóóìà; – ïîñëåäîâàòåëüíàÿ çàãðóçêà: â êàïèëëÿð ââîäÿò ñíà÷àëà âåäóùèé áóôåðíûé ðàñòâîð, çà- òåì àìôîëèòû, çàòåì ïðîáó, ñìåøàííóþ ñ àìôî- ëèòàìè, ïîñëå ÷åãî ñíîâà àìôîëèòû è â êîíöå çàìûêàþùèé áóôåðíûé ðàñòâîð. Îáúåì ïðîáû äîëæåí áûòü íåáîëüøèì, ÷òîáû íå ïîâëèÿòü íà âåëè÷èíó ãðàäèåíòà ðÍ. Ñòàäèÿ ôîêóñèðîâàíèÿ. Ïðè íàëîæåíèè íàïðÿæåíèÿ àìôîëèòû, â çàâèñèìîñòè îò ñâîåãî ñóììàðíîãî çàðÿäà, ìèãðèðóþò ïî íàïðàâëåíèþ ê êàòîäó èëè àíîäó, òåì ñàìûì ñîçäàâàÿ ãðàäè- åíò îò àíîäà (áîëåå íèçêèå çíà÷åíèÿ ðÍ) ê êàòî- äó (áîëåå âûñîêèå çíà÷åíèÿ ðÍ). Íà äàííîé ñòà- äèè ðàçäåëÿåìûå êîìïîíåíòû ìèãðèðóþò äî òåõ ïîð, ïîêà íå äîñòèãíóò çíà÷åíèÿ ðÍ, ñîîòâåòñò- âóþùåãî ñâîåé èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êå (pI) è òîê íå óïàäåò äî î÷åíü íèçêèõ çíà÷åíèé. Ñòàäèÿ ìîáèëèçàöèè. Åñëè äëÿ äåòåêòèðî- âàíèÿ íåîáõîäèìà ìîáèëèçàöèÿ, èñïîëüçóþò îäèí èç ñëåäóþùèõ ñïîñîáîâ: – â ïåðâîì ñïîñîáå ìîáèëèçàöèÿ ïðîâîäèò- ñÿ â òå÷åíèå ñòàäèè ôîêóñèðîâàíèÿ âñëåäñòâèå äåéñòâèÿ ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà; ýëåê- òðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê äîëæåí áûòü äîñòàòî÷- íî ìàëûì, ÷òîáû ïîçâîëèòü ïðîâåñòè ôîêóñèðî- âàíèå êîìïîíåíòîâ; – âî âòîðîì ñïîñîáå ìîáèëèçàöèÿ ïðîâî- äèòñÿ ïîñëå ñòàäèè ôîêóñèðîâàíèÿ ïóòåì èñ- ïîëüçîâàíèÿ ïîëîæèòåëüíîãî äàâëåíèÿ; – â òðåòüåì ñïîñîáå ìîáèëèçàöèÿ ïðîâî- äèòñÿ ïîñëå ñòàäèè ôîêóñèðîâàíèÿ ïóòåì äî- áàâëåíèÿ ñîëåé â êàòîäíûé èëè àíîäíûé ðåçåð- âóàð (â çàâèñèìîñòè îò íàïðàâëåíèÿ, âûáðàííî- ãî äëÿ ìîáèëèçàöèè) äëÿ èçìåíåíèÿ ðÍ â êàïèëëÿðå ïðè íàëîæåíèè íàïðÿæåíèÿ. Ïî- ñêîëüêó ðÍ èçìåíÿåòñÿ, áåëêè è ýëåêòðîëèòû ïåðåìåùàþòñÿ ïî íàïðàâëåíèþ ê ðåçåðâóàðó, êîòîðûé ñîäåðæèò äîáàâëåííûå ñîëè, è ïðîõî- äÿò ÷åðåç äåòåêòîð. Äîñòèãàåìîå ðàçäåëåíèå, âûðàæåííîå êàê DpI, çàâèñèò îò ãðàäèåíòà ðÍ (dpH/dx), êîëè÷å- ñòâà àìôîëèòîâ, èìåþùèõ ðàçëè÷íûå âåëè÷èíû pI, êîýôôèöèåíòà ìîëåêóëÿðíîé äèôôóçèè (D), íàïðÿæåííîñòè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ (E) è èçìåíå- íèÿ ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòè îïðåäå- ëÿåìîãî âåùåñòâà ïðè èçìåíåíèè ðÍ (–dm/dpH): Dpl D d dx E d d = × × × - 3 ( / ) ( / ) pH pHm . ÎÏÒÈÌÈÇÀÖÈß Îñíîâíûìè ïàðàìåòðàìè, êîòîðûå ñëåäóåò ó÷èòûâàòü ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèê ðàçäåëåíèÿ, ÿâëÿþòñÿ ñëåäóþùèå. Íàïðÿæåíèå.  êàïèëëÿðíîì èçîýëåêòðè÷å- ñêîì ôîêóñèðîâàíèè íà ñòàäèè ôîêóñèðîâàíèÿ èñïîëüçóåòñÿ ýëåêòðè÷åñêîå ïîëå ñ î÷åíü âûñî- êîé íàïðÿæåííîñòüþ — îò 300 Â/ñì äî 1000 Â/ñì. Êàïèëëÿð.  çàâèñèìîñòè îò ñïîñîáà ìîáè- ëèçàöèè (ñì. âûøå) ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîê äîëæåí áûòü óìåíüøåí èëè ïîäàâëåí.
Êàïèëëÿ- ðû ñ ìîäèôèöèðîâàííîé ïîâåðõíîñòüþ, êàê ïðàâèëî, óìåíüøàþò ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïî- òîê. Ðàñòâîðû. Ðåçåðâóàð ñ àíîäíûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì çàïîëíÿþò ðàñòâîðîì, çíà÷åíèå ðÍ êîòîðîãî ìåíüøå çíà÷åíèÿ pI áîëüøèíñòâà êè- ñëîòíûõ àìôîëèòîâ, à êàòîäíûé ðåçåðâóàð — ðàñòâîðîì, çíà÷åíèå ðÍ êîòîðîãî áîëüøå çíà÷å- íèÿ pI áîëüøèíñòâà îñíîâíûõ àìôîëèòîâ. Äëÿ àíîäíûõ áóôåðíûõ ðàñòâîðîâ ÷àñòî èñïîëüçóþò ôîñôîðíóþ êèñëîòó, à äëÿ êàòîäíûõ — íàòðèÿ ãèäðîêñèä. Äîáàâëåíèå ïîëèìåðà, òàêîãî êàê ìåòèëöåë- ëþëîçà, â ðàñòâîð àìôîëèòà ïðèâîäèò ê ïîäàâ- 111 ëåíèþ êîíâåêòèâíûõ ñèë (åñëè òàêèå èìåþòñÿ) è ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà, ÷òî îáóñëîâëå- íî óâåëè÷åíèåì âÿçêîñòè. Èìåþùèåñÿ â ïðîäà- æå àìôîëèòû ïîêðûâàþò ìíîæåñòâî äèàïàçî- íîâ ðÍ, à ïðè íåîáõîäèìîñòè äëÿ ïîëó÷åíèÿ áî- ëåå øèðîêîãî äèàïàçîíà ðÍ èõ ìîæíî ñìåøèâàòü. Øèðîêèå äèàïàçîíû ðÍ èñïîëüçó- þòñÿ äëÿ îöåíêè âåëè÷èíû èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êè, â òî âðåìÿ êàê áîëåå óçêèå ïðèìåíÿþòñÿ äëÿ óëó÷øåíèÿ òî÷íîñòè àíàëèçà. Äëÿ êàëèá- ðîâêè ìîæíî èñïîëüçîâàòü çàâèñèìîñòü ìåæäó âðåìåíåì ìèãðàöèè è èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êîé äëÿ ñåðèè áåëêîâûõ ìàðêåðîâ. Ïðè íåîáõîäèìî- ñòè, îñàæäåíèå áåëêîâ â èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷- êå âî âðåìÿ ñòàäèè ôîêóñèðîâàíèÿ ìîæåò áûòü ïðåäîòâðàùåíî äîáàâëåíèåì ê áóôåðíîìó ðàñ- òâîðó ãëèöåðèíà, ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûõ âå- ùåñòâ, ìî÷åâèíû èëè öâèòòåð-èîííûõ áóôåð- íûõ ðàñòâîðîâ. Ñëåäóåò èìåòü â âèäó, ÷òî ìî- ÷åâèíà â çàâèñèìîñòè îò êîíöåíòðàöèè äåíàòóðèðóåò áåëêè. ÌÈÖÅËËßÐÍÀß ÝËÅÊÒÐÎÊÈÍÅÒÈ×ÅÑÊÀß ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈß ÏÐÈÍÖÈÏ Â ìèöåëëÿðíîé ýëåêòðîêèíåòè÷åñêîé õðî- ìàòîãðàôèè (ÌÝÊÕ, MEKC) ðàçäåëåíèå ïðîèñ- õîäèò â ðàñòâîðå ýëåêòðîëèòà, êîòîðûé ñîäåð- æèò ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîå âåùåñòâî â êîíöåí- òðàöèè, ïðåâûøàþùåé êðèòè÷åñêóþ êîíöåí- òðàöèþ ìèöåëëîîáðàçîâàíèÿ (êêì). Ìîëåêóëû ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà ðàñïðåäåëÿþòñÿ ìåæäó âîäíûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì è ïñåâäîíåïî- äâèæíîé ôàçîé, îáðàçîâàííîé ìèöåëëàìè, â ñî- îòâåòñòâèè ñî ñâîèì êîýôôèöèåíòîì ðàñïðåäå- ëåíèÿ. Òàêèì îáðàçîì, äàííûé ìåòîä ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ãèáðèä ýëåêòðîôîðåçà è õðî- ìàòîãðàôèè. Îí ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí äëÿ ðàçäåëåíèÿ êàê çàðÿæåííûõ, òàê è íåéòðàëüíûõ ðàñòâîðåííûõ âåùåñòâ, ñîõðàíÿÿ ïðè ýòîì ýô- ôåêòèâíîñòü, ñêîðîñòü, à òàêæå îáîðóäîâàíèå, ïðèñóùèå êàïèëëÿðíîìó ýëåêòðîôîðåçó. Îäíèì èç ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûõ âåùåñòâ, øèðîêî èñ- ïîëüçóåìûì â ÌÝÊÕ, ÿâëÿåòñÿ àíèîííîå ïî- âåðõíîñòíî-àêòèâíîå âåùåñòâî íàòðèÿ äîäåöèë- ñóëüôàò. Ïðèìåíÿþòñÿ òàêæå è äðóãèå ïîâåðõ- íîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà, íàïðèìåð, êàòèîí- íûå ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà, òàêèå êàê ñîëè öåòèëòðèìåòèëàììîíèÿ. Ìåõàíèçì ðàçäåëåíèÿ çàêëþ÷àåòñÿ â ñëå- äóþùåì.  íåéòðàëüíîé èëè ùåëî÷íîé ñðåäå âîçíèêàåò ñèëüíûé ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïî- òîê, êîòîðûé ïåðåìåùàåò èîíû ðàçäåëÿþùåãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà ïî íàïðàâëåíèþ ê êàòîäó. Åñëè â êà÷åñòâå ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîãî âåùå- ñòâà èñïîëüçóåòñÿ íàòðèÿ äîäåöèëñóëüôàò, ýëåê- òðîôîðåòè÷åñêàÿ ìèãðàöèÿ àíèîííûõ ìèöåëë ïðîèñõîäèò â ïðîòèâîïîëîæíîì íàïðàâëåíèè, ò.å. ê àíîäó.  ðåçóëüòàòå îáùàÿ ñêîðîñòü ìèãðà- öèè ìèöåëë óìåíüøàåòñÿ ïî ñðàâíåíèþ ñî ñêî- ðîñòüþ ïîòîêà ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà.  ñëó÷àå íåéòðàëüíûõ ðàçäåëÿåìûõ âåùåñòâ ñêîðîñòü ìèãðàöèè îïðåäåëÿåìîãî âåùåñòâà áóäåò çàâè- ñåòü òîëüêî îò âåëè÷èíû åãî êîýôôèöèåíòà ðàñïðåäåëåíèÿ ìåæäó ìèöåëëîé è âîäíûì áó- ôåðíûì ðàñòâîðîì, ïîñêîëüêó îïðåäåëÿåìîå âå- ùåñòâî ñïîñîáíî ðàñïðåäåëÿòüñÿ ìåæäó ìèöåë- ëîé è âîäíûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì íå îáëàäàåò ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ïîäâèæíîñòüþ.
Íà ýëåê- òðîôîðåãðàììå ïèêè, ñîîòâåòñòâóþùèå êàæäî- ìó èç ðàçäåëÿåìûõ íåçàðÿæåííûõ ðàñòâîðåí- íûõ âåùåñòâ, âñåãäà íàõîäÿòñÿ ìåæäó ïèêîì ìàðêåðà ýëåêòðîîñìîòè÷åñêîãî ïîòîêà è ïèêîì ìèöåëëû (âðåìÿ ìåæäó ýòèìè äâóìÿ ïèêàìè íà- çûâàåòñÿ îêíîì ðàçäåëåíèÿ). Äëÿ çàðÿæåííûõ ðàñòâîðåííûõ âåùåñòâ ñêîðîñòü ìèãðàöèè çàâè- ñèò êàê îò êîýôôèöèåíòà ðàñïðåäåëåíèÿ âåùå- ñòâà ìåæäó ìèöåëëîé è âîäíûì áóôåðíûì ðàñ- òâîðîì, òàê è îò ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ïîäâèæ- íîñòè âåùåñòâà â îòñóòñòâèè ìèöåëëû. Ïîñêîëüêó ìåõàíèçì ðàçäåëåíèÿ â ÌÝÊÕ íåéòðàëüíûõ è ñëàáîèîíèçèðîâàííûõ ðàñòâî- ðåííûõ âåùåñòâ ãëàâíûì îáðàçîì õðîìàòîãðà- ôè÷åñêèé, ìèãðàöèÿ ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà è ðàçðåøåíèå ìîãóò áûòü îõàðàêòåðèçîâàíû ñ ïî- ìîùüþ êîýôôèöèåíòà óäåðæèâàíèÿ âåùåñòâà (k¢), òàêæå èçâåñòíîãî êàê êîíöåíòðàöèîííûé êîýôôèöèåíò ðàñïðåäåëåíèÿ (Dm), êîòîðûé ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îòíîøåíèå êîëè÷åñòâà ìîëü ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà, íàõîäÿùåãîñÿ â ìè- öåëëå, ê êîëè÷åñòâó ìîëü äàííîãî âåùåñòâà â ïîäâèæíîé ôàçå. Äëÿ íåéòðàëüíûõ ñîåäèíåíèé k¢ îïðåäåëÿåò- ñÿ êàê: k t t t t t K V V R R mc S M ¢ = - × - æ è ç ö ø ÷ = ×0 0 1 , ãäå: tR — âðåìÿ ìèãðàöèè ðàñòâîðåííîãî âåùå- ñòâà; 112 t0 — âðåìÿ àíàëèçà íåóäåðæèâàåìîãî ðàñ- òâîðåííîãî âåùåñòâà (îïðåäåëÿåìîå ñ ïîìîùüþ ìàðêåðà ýëåêòðîîñìîòè- ÷åñêîãî òîêà, íå âõîäÿùåãî â ìèöåëëó, íàïðèìåð, ìåòàíîëà); tmc — âðåìÿ ìèãðàöèè ìèöåëëû (èçìåðÿåò- ñÿ ñ ïîìîùüþ ìàðêåðà ìèöåëëû, òà- êîãî êàê Ñóäàí III, êîòîðûé ìèãðèðó- åò, ïîëíîñòüþ íàõîäÿñü â ìèöåëëàõ); K — êîýôôèöèåíò ðàñïðåäåëåíèÿ ðàñòâî- ðåííîãî âåùåñòâà; VS — îáúåì ìèöåëëÿðíîé ôàçû; VM — îáúåì ïîäâèæíîé ôàçû. Àíàëîãè÷íî, ðàçðåøåíèå ìåæäó ïèêàìè äâóõ áëèçêî ìèãðèðóþùèõ âåùåñòâ (Rs) îïðåäå- ëÿåòñÿ êàê: R N k k t t k t t S b b mc a mc = × - × ¢ ¢ + × - æ è ç ö ø ÷ + ¢ ×æ è ç ö ø ÷ 4 1 1 1 1 0 0 a a , ãäå: N — ÷èñëî òåîðåòè÷åñêèõ òàðåëîê äëÿ îäíîãî èç âåùåñòâ; a — ñåëåêòèâíîñòü; ¢ka è ¢kb — êîýôôèöèåíòû óäåðæèâàíèÿ äëÿ îáîèõ âåùåñòâ ñîîòâåòñòâåííî (k¢b > k¢a). Ïîäîáíûå, íî íå èäåíòè÷íûå óðàâíåíèÿ äëÿ çíà÷åíèé k¢ è Rs èñïîëüçóþòñÿ è â ñëó÷àå ðàçäå- ëåíèÿ çàðÿæåííûõ âåùåñòâ. ÎÏÒÈÌÈÇÀÖÈß Îñíîâíûìè ïàðàìåòðàìè, êîòîðûå ñëåäóåò ïðèíèìàòü âî âíèìàíèå ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèê ðàçäåëåíèÿ â ÌÝÊÕ, ÿâëÿþòñÿ èíñòðóìåíòàëü- íûå, à òàêæå ïàðàìåòðû ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà. Èíñòðóìåíòàëüíûå ïàðàìåòðû Íàïðÿæåíèå. Âðåìÿ ðàçäåëåíèÿ îáðàòíî ïðîïîðöèîíàëüíî ïðèëîæåííîìó íàïðÿæåíèþ. Îäíàêî óâåëè÷åíèå íàïðÿæåíèÿ ìîæåò âûçâàòü èçáûòî÷íîå âûäåëåíèå òåïëà, ïîâûøåíèå òåì- ïåðàòóðû è, êàê ðåçóëüòàò, îáðàçîâàíèå ãðàäèåí- òîâ òåìïåðàòóðû è âÿçêîñòè â áóôåðíîì ðàñòâî- ðå, íàõîäÿùåìñÿ â êàïèëëÿðå. Äàííûé ýôôåêò îñîáåííî õàðàêòåðåí äëÿ áóôåðíûõ ðàñòâîðîâ ñ âûñîêîé ýëåêòðè÷åñêîé ïðîâîäèìîñòüþ è ñî- äåðæàùèõ ìèöåëëû. Íåóäîâëåòâîðèòåëüíàÿ òå- ïëîâàÿ êîíâåêöèÿ ïðèâîäèò ê óøèðåíèþ ïîëî- ñû è óìåíüøàåò ðàçðåøåíèå. Òåìïåðàòóðà. Èçìåíåíèÿ òåìïåðàòóðû êà- ïèëëÿðà âëèÿþò íà êîýôôèöèåíò ðàñïðåäåëåíèÿ âåùåñòâà ìåæäó áóôåðíûì ðàñòâîðîì è ìèöåë- ëîé, êðèòè÷åñêóþ êîíöåíòðàöèþ ìèöåëëîîáðà- çîâàíèÿ è âÿçêîñòü áóôåðíîãî ðàñòâîðà. Äàííûå ïàðàìåòðû âíîñÿò âêëàä â âåëè÷èíó âðåìåíè ìèãðàöèè ðàñòâîðåííîãî âåùåñòâà. Èñïîëüçîâà- íèå íàäëåæàùåé îõëàæäàþùåé ñèñòåìû óëó÷- øàåò âîñïðîèçâîäèìîñòü âðåìåíè ìèãðàöèè ðàñòâîðåííûõ âåùåñòâ. Êàïèëëÿð. Êàê è â ñëó÷àå êàïèëëÿðíîãî çîí- íîãî ýëåêòðîôîðåçà, ðàçìåðû êàïèëëÿðà (äëèíà è âíóòðåííèé äèàìåòð) âëèÿþò íà ïðîäîëæè- òåëüíîñòü àíàëèçà è ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ. Óâåëè÷åíèå êàê ýôôåêòèâíîé, òàê è îáùåé äëè- íû êàïèëëÿðà ìîæåò îñëàáèòü ýëåêòðè÷åñêîå ïîëå (â ñëó÷àå ðàáîòû ïðè ïîñòîÿííîì íàïðÿæå- íèè), óâåëè÷èòü âðåìÿ ìèãðàöèè è óëó÷øèòü ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ.
Âíóòðåííèé äèà- ìåòð êîíòðîëèðóåò òåïëîâóþ êîíâåêöèþ (äëÿ îïðåäåëåííîãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà è ýëåêòðè- ÷åñêîãî ïîëÿ) è, ñîîòâåòñòâåííî, óøèðåíèå ïî- ëîñû âåùåñòâà. Ïàðàìåòðû ðàñòâîðà ýëåêòðîëèòà Òèï è êîíöåíòðàöèÿ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâ- íîãî âåùåñòâà. Òèï ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîãî âåùåñòâà òàêèì æå îáðàçîì, êàê è íåïîäâèæíàÿ ôàçà â õðîìàòîãðàôèè, âëèÿåò íà ðàçðåøåíèå, ïîñêîëüêó èçìåíÿåò ñåëåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ. Âåëè÷èíà lgk¢ íåéòðàëüíîãî ñîåäèíåíèÿ ëèíåé- íî óâåëè÷èâàåòñÿ ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðà- öèè ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîãî âåùåñòâà â ïîä- âèæíîé ôàçå. Ïîñêîëüêó ðàçðåøåíèå â ÌÝÊÕ äîñòèãàåò ìàêñèìóìà ïðè ïðèáëèæåíèè âåëè÷è- íû k¢ ê çíà÷åíèþ t tmc / 0 , èçìåíåíèå êîíöåí- òðàöèè ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîãî âåùåñòâà â ïîäâèæíîé ôàçå èçìåíÿåò âåëè÷èíó ðàçðåøå- íèÿ. Çíà÷åíèå ðÍ áóôåðíîãî ðàñòâîðà. Íåñìîòðÿ íà òî, ÷òî çíà÷åíèå pH íå èçìåíÿåò êîýôôèöè- åíò ðàñïðåäåëåíèÿ íåèîíèçèðîâàííûõ âåùåñòâ, îíî ìîæåò èçìåíÿòü ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïî- òîê â êàïèëëÿðàõ ñ íåìîäèôèöèðîâàííîé ïî- âåðõíîñòüþ. Óìåíüøåíèå çíà÷åíèÿ ðÍ áóôåð- íîãî ðàñòâîðà óìåíüøàåò ýëåêòðîîñìîòè÷åñêèé ïîòîêè è òåì ñàìûì óâåëè÷èâàåò ðàçðåøåíèå íåéòðàëüíûõ âåùåñòâ â ÌÝÊÕ âñëåäñòâèå óâå- ëè÷åíèÿ ïðîäîëæèòåëüíîñòè àíàëèçà. Îðãàíè÷åñêèå ðàñòâîðèòåëè. Äëÿ óëó÷øå- íèÿ ÌÝÊÕ-ðàçäåëåíèÿ ãèäðîôîáíûõ ñîåäèíå- íèé ê ðàñòâîðó ýëåêòðîëèòà ìîãóò áûòü äîáàâ- ëåíû îðãàíè÷åñêèå ìîäèôèêàòîðû (ìåòàíîë, ïðîïàíîë, àöåòîíèòðèë è äð.). Äîáàâëåíèå òà- 113 êèõ ìîäèôèêàòîðîâ îáû÷íî óìåíüøàåò âðåìÿ ìèãðàöèè è ñåëåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ. Ïî- ñêîëüêó äîáàâëåíèå îðãàíè÷åñêèõ ìîäèôèêàòî- ðîâ âëèÿåò íà âåëè÷èíó êðèòè÷åñêîé êîíöåíòðà- öèè ìèöåëëîîáðàçîâàíèÿ, îïðåäåëåííàÿ êîí- öåíòðàöèÿ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíîãî âåùåñòâà ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà òîëüêî â ïðåäåëàõ íå- êîòîðîãî ïðîöåíòíîãî ñîäåðæàíèÿ îðãàíè÷åñêî- ãî ìîäèôèêàòîðà äî ïðåêðàùåíèÿ ìèöåëëîîáðà- çîâàíèÿ èëè îòðèöàòåëüíîãî âëèÿíèÿ íà ýòîò ïðîöåññ, ïðèâîäÿùåãî ê èñ÷åçíîâåíèþ ìèöåëë è ïðåêðàùåíèþ ðàçäåëåíèÿ. Äèññîöèàöèÿ ìè- öåëë â ïðèñóòñòâèè áîëüøîãî êîëè÷åñòâà îðãà- íè÷åñêîãî ðàñòâîðèòåëÿ íå âñåãäà îçíà÷àåò íå- âîçìîæíîñòü äàëüíåéøåãî ðàçäåëåíèÿ; â íåêî- òîðûõ ñëó÷àÿõ ãèäðîôîáíîå âçàèìîäåéñòâèå ìåæäó ìîíîìåðîì èîííîãî ïîâåðõíîñòíî-àê- òèâíîãî âåùåñòâà è íåéòðàëüíûì ðàçäåëÿåìûì âåùåñòâîì ïðèâîäèò ê îáðàçîâàíèþ ñîëüâîôîá- íûõ êîìïëåêñîâ, êîòîðûå ìîãóò áûòü ðàçäåëåíû ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè. Äîáàâêè äëÿ õèðàëüíûõ ðàçäåëåíèé. Äëÿ ðàç- äåëåíèÿ ýíàíòèîìåðîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì ÌÝÊÕ õèðàëüíûé ñåëåêòîð âêëþ÷àåòñÿ â ìè- öåëëÿðíóþ ñèñòåìó, ëèáî êîâàëåíòíî ñâÿçûâà- åòñÿ ñ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûì âåùåñòâîì ëèáî äîáàâëÿåòñÿ ê ðàñòâîðó ýëåêòðîëèòà, â êîòîðîì ïðîèñõîäèò ðàçäåëåíèå ìèöåëë. Ìèöåëëû, ñïî- ñîáíûå ê õèðàëüíûì ðàçäåëåíèÿì, îáû÷íî âêëþ÷àþò â ñåáÿ ñîëè N-äîäåêàíîèë-L-àìèíî- êèñëîò, ñîëè æåë÷íûõ êèñëîò è ò.ä. Õèðàëüíîå ðàçäåëåíèå ìîæåò áûòü òàêæå ïðîâåäåíî ñ ïî- ìîùüþ öèêëîäåêñòðèíîâ, äîáàâëåííûõ ê ðàñ- òâîðàì ýëåêòðîëèòîâ, ñîäåðæàùèõ ìèöåëëû àõèðàëüíûõ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûõ âåùåñòâ. Äðóãèå äîáàâêè. Ñóùåñòâóåò ðÿä ïîäõîäîâ, ïðåäïîëàãàþùèõ äîáàâëåíèå ðàçëè÷íûõ ðåà- ãåíòîâ ê áóôåðíîìó ðàñòâîðó äëÿ èçìåíåíèÿ ñå- ëåêòèâíîñòè. Äîáàâëåíèå íåêîòîðûõ òèïîâ öèê- ëîäåêñòðèíîâ ê áóôåðíîìó ðàñòâîðó òàêæå ìî- æåò áûòü èñïîëüçîâàíî äëÿ óìåíüøåíèÿ âçàèìîäåéñòâèÿ ãèäðîôîáíûõ âåùåñòâ ñ ìèöåë- ëîé, òåì ñàìûì óâåëè÷èâàÿ ñåëåêòèâíîñòü ðàç- äåëåíèÿ äëÿ òàêîãî òèïà ñîåäèíåíèé. Äîáàâëåíèå âåùåñòâ, êîòîðûå ñïîñîáíû èç- ìåíÿòü âçàèìîäåéñòâèå ìåæäó ðàçäåëÿåìûì âå- ùåñòâîì è ìèöåëëîé âñëåäñòâèå àäñîðáöèè íà ïîñëåäíåé, èñïîëüçóåòñÿ äëÿ óëó÷øåíèÿ ñåëåê- òèâíîñòè ðàçäåëåíèÿ â ÌÝÊÕ.
Äàííûå äîáàâêè ìîãóò ïðåäñòàâëÿòü ñîáîé âòîðîå ïîâåðõíîñò- íî-àêòèâíîå âåùåñòâî (èîííîå èëè íåèîííîå), êîòîðîå óâåëè÷èâàåò êîëè÷åñòâî ñìåøàííûõ ìèöåëë èëè êàòèîíîâ ìåòàëëîâ, êîòîðûå ðàñòâî- ðÿþòñÿ â ìèöåëëå è îáðàçóþò êîîðäèíàöèîííûå êîìïëåêñû ñ ðàçäåëÿåìûìè âåùåñòâàìè. ÊÎËÈ×ÅÑÒÂÅÍÍÎÅ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ Ïëîùàäè ïèêîâ äîëæíû áûòü ðàçäåëåíû ñî- îòâåòñòâóþùèìè âðåìåíàìè ìèãðàöèè, ÷òîáû â èòîãå ïîëó÷èòü èñïðàâëåííóþ ïëîùàäü, ïîçâî- ëÿþùóþ êîìïåíñèðîâàòü: – ñìåùåíèå âðåìåí óäåðæèâàíèÿ îò àíàëèçà ê àíàëèçó è òåì ñàìûì óìåíüøèòü ðàçëè÷èÿ â âåëè÷èíå àíàëèòè÷åñêîãî ñèãíàëà; – ðàçëè÷íûå àíàëèòè÷åñêèå ñèãíàëû êîì- ïîíåíòîâ ïðîáû ñ ðàçëè÷íûìè âðåìåíàìè ìè- ãðàöèè. Ïðè èñïîëüçîâàíèè âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà ñëåäóåò óáåäèòüñÿ â òîì, ÷òî ïèê èñïûòóåìîãî âåùåñòâà íå ïåðåêðûâàåòñÿ ïèêîì âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà. ÐÀÑ×ÅÒÛ Ïî ïîëó÷åííûì äàííûì ðàññ÷èòûâàþò ñîäåðæàíèå èñïûòóåìîãî êîìïîíåíòà èëè êîì- ïîíåíòîâ. Åñëè óêàçàíî, ðàññ÷èòûâàþò ïðî- öåíòíîå ñîäåðæàíèå îäíîãî èëè íåñêîëüêèõ êîìïîíåíòîâ îáðàçöà ïóòåì îïðåäåëåíèÿ èñ- ïðàâëåííîé ïëîùàäè ïèêà èëè ïèêîâ êàê ïðî- öåíòíîé ÷àñòè èñïðàâëåííûõ ïëîùàäåé âñåõ ïèêîâ, èñêëþ÷àÿ ïèêè, ñîîòâåòñòâóþùèå ðàñ- òâîðèòåëÿì èëè ëþáûì äîáàâëåííûì ðåàãåíòàì (ìåòîä íîðìàëèçàöèè). Ðåêîìåíäóåòñÿ èñïîëü- çîâàíèå àâòîìàòè÷åñêîé ñèñòåìû èíòåãðèðîâà- íèÿ (èíòåãðàòîðà èëè ñèñòåìû ïîëó÷åíèÿ è îá- ðàáîòêè äàííûõ). ÏÐÈÃÎÄÍÎÑÒÜ ÑÈÑÒÅÌÛ Ïàðàìåòðû ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû èñïîëüçó- þòñÿ äëÿ ïðîâåðêè ïîâåäåíèÿ ñèñòåìû êàïèë- ëÿðíîãî ýëåêòðîôîðåçà. Âûáîð ïàðàìåòðîâ çà- âèñèò îò èñïîëüçóåìîãî âèäà êàïèëëÿðíîãî ýëåêòðîôîðåçà. Ê íèì îòíîñÿòñÿ: êîýôôèöèåíò åìêîñòè (k’) (òîëüêî äëÿ ìèöåëëÿðíîé ýëåêòðî- êèíåòè÷åñêîé õðîìàòîãðàôèè), ÷èñëî òåîðåòè- ÷åñêèõ òàðåëîê (N), êîýôôèöèåíò ñèììåòðèè (As) è ðàçðåøåíèå (Rs).  ïðåäûäóùèõ ðàçäåëàõ áûëè îïèñàíû óðàâíåíèÿ äëÿ ðàñ÷åòîâ N è Rs, íèæå ïðèâåäåíû óðàâíåíèÿ, ïîçâîëÿþùèå ðàñ- ñ÷èòàòü ýòè ïàðàìåòðû èç ýëåêòðîôîðåãðàìì. 114 ×ÈÑËÎ ÒÅÎÐÅÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÒÀÐÅËÎÊ ×èñëî òåîðåòè÷åñêèõ òàðåëîê (N) ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàíî ïî ôîðìóëå: N t w R h = ×æ è ç ö ø ÷5 54 2 , , ãäå: tR — âðåìÿ ìèãðàöèè èëè ðàññòîÿíèå ïî áàçîâîé ëèíèè îò òî÷êè ââîäà ïðîáû äî ïåðïåíäèêóëÿðà, îïóùåííîãî èç ìàêñèìóìà ïèêà, ñîîòâåòñòâóþùåãî êîìïîíåíòó; wh — øèðèíà ïèêà íà ïîëîâèíå âûñîòû. ÐÀÇÐÅØÅÍÈÅ Ðàçðåøåíèå (Rs) áëèçêèõ ïî âûñîòå ïèêîâ äâóõ êîìïîíåíòîâ ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàíî ïî ôîðìóëå: R t t w w s R R h h = × - + 118 2 1 1 2 , ( ), t tR R2 1> , ãäå: tR1 è tR2 — âðåìåíà ìèãðàöèè èëè ðàñ- ñòîÿíèÿ ïî áàçîâîé ëèíèè îò òî÷êè ââîäà ïðîáû äî ïåðïåí- äèêóëÿðîâ, îïóùåííûõ èç ìàê- ñèìóìîâ äâóõ ñîñåäíèõ ïèêîâ; wh1 è wh2 — øèðèíû ïèêîâ íà ïîëîâèíå âûñîòû. Ïðè íåîáõîäèìîñòè ðàçðåøåíèå ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàíî ïóòåì èçìåðåíèÿ âûñîòû âïàäèíû (Hv) ìåæäó äâóìÿ ÷àñòè÷íî ðàçäåëåííûìè ïèêà- ìè â ñòàíäàðòíîì îáðàçöå, âûñîòû ìåíüøåãî ïèêà (Hp) è ðàñ÷åòà îòíîøåíèÿ ïèê/âïàäèíà: p v H H p v / .= ÊÎÝÔÔÈÖÈÅÍÒ ÑÈÌÌÅÒÐÈÈ Êîýôôèöèåíò ñèììåòðèè ïèêà (As) ðàññ÷è- òûâàþò ïî ôîðìóëå: A w d s = 0 05 2 , , ãäå: w0,05 — øèðèíà ïèêà íà îäíîé äâàäöàòîé åãî âûñîòû; d — ðàññòîÿíèå ìåæäó ïåðïåíäèêóëÿ- ðîì, îïóùåííûì èç ìàêñèìóìà ïèêà, è ïåðåäíåé ãðàíèöåé ïèêà íà îäíîé äâàäöàòîé åãî âûñîòû. Èñïûòàíèÿ íà ïîâòîðÿåìîñòü ïëîùàäåé (ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå ïëîùàäåé èëè îòíî- øåíèé ïëîùàäü/âðåìÿ ìèãðàöèè) è âðåìåí ìè- ãðàöèè (ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå âðåìåíè ìè- ãðàöèè) èñïîëüçóþòñÿ â êà÷åñòâå ïàðàìåòðîâ ïðèãîäíîñòè. Ïîâòîðÿåìîñòü âðåìåíè ìèãðà- öèè îáåñïå÷èâàåò èñïûòàíèå ïðèãîäíîñòè ïðî- öåäóðû ïðîìûâêè êàïèëëÿðà. Àëüòåðíàòèâíûì ñïîñîáîì ïðåäóïðåæäåíèÿ óõóäøåíèÿ ïîâòî- ðÿåìîñòè âðåìåíè ìèãðàöèè ÿâëÿåòñÿ èñïîëüçî- âàíèå âðåìåíè ìèãðàöèè îòíîñèòåëüíî âðåìåíè ìèãðàöèÿ âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà.
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ðîäñòâåííûõ ïðèìåñåé ìî- æåò áûòü ïîëåçíî èñïûòàíèå íà ïîäòâåðæäåíèå îòíîøåíèÿ ñèãíàë/øóì äëÿ ñòàíäàðòíîãî îáðàç- öà (èëè îïðåäåëåíèå ïðåäåëà êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ). ÎÒÍÎØÅÍÈÅ ÑÈÃÍÀË/ØÓÌ Ïðåäåëû îáíàðóæåíèÿ è êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ îòâå÷àþò îòíîøåíèþ ñèãíàë/øóì 3 è 10 ñîîòâåòñòâåííî. Îòíîøåíèå ñèãíàë/øóì (S/N) ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: S N H h / ,= 2 ãäå: H — âûñîòà ïèêà ðàññìàòðèâàåìîãî êîìïî- íåíòà íà ýëåêòðîôîðåãðàììå, óêàçàí- íîãî ðàñòâîðà ñðàâíåíèÿ; âûñîòó èç- ìåðÿþò îò ìàêñèìóìà ïèêà äî ýêñòðà- ïîëèðîâàííîé áàçîâîé ëèíèè ñèãíàëà, íàáëþäàåìîãî íà ðàññòîÿíèè, ðàâíîì íå ìåíåå äâàäöàòèêðàòíîé øèðèíå ïèêà íà ïîëîâèíå åãî âûñîòû; h — îáëàñòü ôîíîâîãî øóìà íà ýëåêòðîôî- ðåãðàììå, ïîëó÷åííîé ïðè ââåäåíèè êîíòðîëüíîãî ðàñòâîðà, íàáëþäàåìàÿ íà ðàññòîÿíèè, ðàâíîì íå ìåíåå äâà- äöàòèêðàòíîé øèðèíû ïèêà íà ïîëî- âèíå âûñîòû ïèêà íà ýëåêòðîôîðå- ãðàììå óêàçàííîãî ðàñòâîðà ñðàâíå- íèÿ è, ïî âîçìîæíîñòè, ðàñïîëîæåí- íàÿ ïî îáå ñòîðîíû îò ìåñòà âîçìîæ- íîãî îáíàðóæåíèÿ ïèêà. 201020039-2019 2.1.2.38. Èçîýëåêòðè÷åñêîå ôîêóñèðîâàíèå ÎÁÙÈÅ ÏÐÈÍÖÈÏÛ Èçîýëåêòðè÷åñêîå ôîêóñèðîâàíèå (ÈÝÔ) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ìåòîä ýëåêòðîôîðåçà, îñíî- âàííûé íà ðàçäåëåíèè áåëêîâ â ñîîòâåòñòâèè ñ èõ èçîýëåêòðè÷åñêèìè òî÷êàìè. Ðàçäåëåíèå ïðîâîäèòñÿ íà ïëàñòèíå èç ïîëèàêðèëàìèäíîãî 115 èëè àãàðîçíîãî ãåëÿ, ñîäåðæàùåãî ñìåñü àìôî- òåðíûõ ýëåêòðîëèòîâ (àìôîëèòîâ). Ïðè äåéñò- âèè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ àìôîëèòû ìèãðèðóþò â ãåëå, ñîçäàâàÿ ãðàäèåíò ðÍ.  íåêîòîðûõ ñëó- ÷àÿõ èñïîëüçóþò ãåëè ñ ôèêñèðîâàííûì ãðàäè- åíòîì ðÍ, ïîëó÷åííûå ïóòåì âêëþ÷åíèÿ ñëàáûõ êèñëîò èëè îñíîâàíèé â îïðåäåëåííûå ìåñòà ãåëÿ âî âðåìÿ åãî ïðèãîòîâëåíèÿ. Êîãäà íàíå- ñåííûå áåëêè äîñòèãàþò ôðàêöèè ãåëÿ, êîòîðàÿ èìååò òàêîå æå çíà÷åíèå ðÍ, ÷òî è èõ èçîýëåê- òðè÷åñêàÿ òî÷êà (pI), çàðÿä äàííûõ áåëêîâ íåé- òðàëèçóåòñÿ è ìèãðàöèÿ ïðåêðàùàåòñÿ. Ãðàäè- åíòû ìîãóò áûòü ñîçäàíû â ðàçëè÷íûõ äèàïàçî- íàõ ðÍ â çàâèñèìîñòè îò âûáðàííîé ñìåñè àìôîëèòîâ. ÒÅÎÐÅÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÀÑÏÅÊÒÛ Â èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êå ìîëåêóëà áåëêà íå çàðÿæåíà è íå ìîæåò ïåðåäâèãàòüñÿ â ìàòðèöå ãåëÿ ïîä äåéñòâèåì ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ. Åå ïå- ðåìåùåíèå, îäíàêî, ìîæåò ïðîèñõîäèòü â ðå- çóëüòàòå äèôôóçèè. Ãðàäèåíò ðÍ âûíóæäàåò áå- ëîê îñòàâàòüñÿ â èçîýëåêòðè÷åñêîì ñîñòîÿíèè, êîíöåíòðèðóÿ äàííîå âåùåñòâî. Òàêîå êîíöåí- òðèðîâàíèå íàçûâàåòñÿ «ôîêóñèðîâàíèåì». Óâåëè÷åíèå ïðèëîæåííîãî íàïðÿæåíèÿ èëè óìåíüøåíèå êîëè÷åñòâà íàíåñåííîãî âåùåñòâà óëó÷øàåò ðàçäåëåíèå ïîëîñ. Âåëè÷èíà ïðèëî- æåííîãî íàïðÿæåíèÿ îãðàíè÷åíà âûäåëÿþùåé- ñÿ òåïëîòîé, êîòîðàÿ äîëæíà áûòü ðàññåÿíà. Èñ- ïîëüçîâàíèå òîíêèõ ñëîåâ ãåëÿ, à òàêæå ïëàñòèí ñ ýôôåêòèâíûì îõëàæäåíèåì, êîíòðîëèðóåìûõ òåðìîñòàòèðóþùèì óñòðîéñòâîì, ïðåäîòâðàùà- åò âîçãîðàíèå ãåëÿ è â òîæå âðåìÿ îáåñïå÷èâàåò òî÷íîå ôîêóñèðîâàíèå. Ðàçäåëåíèå îöåíèâàþò ïî ìèíèìàëüíîé ðàçíîñòè pI (DpI), êîòîðàÿ íå- îáõîäèìà äëÿ ðàçäåëåíèÿ äâóõ ñîñåäíèõ ïîëîñ: Dpl D d dx E d d = × - 3 ( / ) ( / ) , pH pHm ãäå: D — êîýôôèöèåíò äèôôóçèè áåëêà; d dx pH — ãðàäèåíò ðÍ; E — íàïðÿæåííîñòü ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ, â âîëüòàõ íà ñàíòèìåòð; - d d m pH — èçìåíåíèå ïîäâèæíîñòè âåùåñò- âà ïðè èçìåíåíèè ðÍ â äèàïàçîíå, áëèçêîì ê pI. Ïîñêîëüêó D è - d d m pH äëÿ îïðåäåëåííîãî áåëêà íå ìîãóò áûòü èçìåíåíû, óëó÷øèòü ðàçäå- ëåíèå ìîæíî ïðè èñïîëüçîâàíèè áîëåå óçêîãî äèàïàçîíà ðÍ ëèáî ïðè óâåëè÷åíèè íàïðÿæåí- íîñòè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ. Ðàçðåøåíèå ìåæäó ïîëîñàìè áåëêîâ â ñëó- ÷àå èñïîëüçîâàíèÿ ÈÝÔ-ãåëÿ, ñîäåðæàùåãî âå- äóùèå àìôîëèòû, äîñòàòî÷íî õîðîøåå.
Óëó÷- øèòü ðàçðåøåíèå ìîæíî ïðè èñïîëüçîâàíèè ôèêñèðîâàííûõ ãðàäèåíòîâ ðÍ, äëÿ ñîçäàíèÿ êîòîðûõ ïðèìåíÿþòñÿ áóôåðíûå âåùåñòâà, àíà- ëîãè÷íûå âåäóùèì ýëåêòðîëèòàì, ñîïîëèìåðè- çîâàííûå ñ ìàòðèöåé ãåëÿ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ãåëÿ, ñîäåðæàùåãî âåäóùèå ýëåêòðîëèòû, ìîãóò áûòü ðàçäåëåíû áåëêè, çíà÷åíèÿ pI êîòîðûõ îò- ëè÷àþòñÿ â ïðåäåëàõ 0,02 åäèíèö pH, â òî âðåìÿ êàê ôèêñèðîâàííûå ãðàäèåíòû ðÍ ïîçâîëÿþò ðàçäåëèòü áåëêè, èçîýëåêòðè÷åñêèå òî÷êè êîòî- ðûõ ðàçëè÷àþòñÿ ïðèáëèçèòåëüíî íà 0,001 pH. ÏÐÀÊÒÈ×ÅÑÊÈÅ ÀÑÏÅÊÒÛ Ñëåäóåò óäåëÿòü îñîáîå âíèìàíèå õàðàêòå- ðèñòèêàì è/èëè ïîäãîòîâêå îáðàçöà. Íàëè÷èå ñîëåé â îáðàçöå ìîæåò âûçâàòü ðÿä ïðîáëåì, ïî- ýòîìó ëó÷øå âñåãî ïðè åãî ïðèãîòîâëåíèè èñ- ïîëüçîâàòü äåèîíèçèðîâàííóþ âîäó èëè 2 % ðàñòâîð àìôîëèòîâ, èñïîëüçóÿ ïðè íåîáõîäèìî- ñòè äèàëèç èëè ãåëü-ôèëüòðàöèþ. Âðåìÿ, íåîáõîäèìîå äëÿ çàâåðøåíèÿ ôîêó- ñèðîâàíèÿ â òîíêîì ñëîå ïîëèàêðèëàìèäíûõ ãå- ëåé, îïðåäåëÿþò ïóòåì íàíåñåíèÿ îêðàøåííîãî áåëêà (íàïðèìåð, ãåìîãëîáèíà) â ðàçëè÷íûå îá- ëàñòè ïîâåðõíîñòè ãåëÿ è ïðèìåíåíèÿ ýëåêòðè- ÷åñêîãî ïîëÿ: ñòàáèëüíîå ñîñòîÿíèå äîñòèãàåò- ñÿ òîãäà, êîãäà âñå íàíåñåíèÿ äàþò èäåíòè÷íûé îáðàçåö ïîëîñ.  ðÿäå ñëó÷àåâ î çàâåðøåíèè ôî- êóñèðîâàíèÿ ñóäÿò ïî âðåìåíè, ïðîøåäøåìó ïîñëå íàíåñåíèÿ îáðàçöà. ÈÝÔ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî â êà÷åñòâå èñïûòàíèÿ íà ïîäëèííîñòü.  ýòîì ñëó÷àå èñ- ïûòóåìûé îáðàçåö, ìèãðèðóþùèé íà ãåëå, ñðàâ- íèâàåòñÿ ñ ïîäõîäÿùèì ñòàíäàðòíûì îáðàçöîì è ÈÝÔ-êàëèáðîâî÷íûìè áåëêàìè. ÈÝÔ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî â êà÷åñòâå èñïûòàíèÿ íà ïðåäåëüíîå ñîäåðæàíèå. Ïðè ýòîì ïëîòíîñòü ïîëîñû íà ÈÝÔ ñðàâíèâàåòñÿ, ñîîòâåòñòâåííî, ñ ïîëîñîé íà ÈÝÔ, ïîÿâëÿþùåéñÿ ïðè èñïîëü- çîâàíèè ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà, åñëè èçìåðåíèå ïðîèçâîäèòñÿ ñ ïîìîùüþ äåíñèòîìåòðà èëè àíàëîãè÷íîãî óñòðîéñòâà, ïîçâîëÿþùåãî îïðå- äåëèòü îòíîñèòåëüíóþ êîíöåíòðàöèþ áåëêà â ïîëîñå. ÈÝÔ ìîæåò áûòü òàêæå èñïîëüçîâàíî ïðè èñïûòàíèè íà êîëè÷åñòâåííîå ñîäåðæàíèå áåëêîâ. 116 ÏÐÈÁÎÐ Ïðèáîð äëÿ ÈÝÔ ñîñòîèò èç: – óïðàâëÿåìîãî ãåíåðàòîðà äëÿ ñîçäàíèÿ ïîñòîÿííîãî ïîòåíöèàëà, òîêà è ìîùíîñòè; èñ- ïîëüçóþòñÿ ïîòåíöèàëû âåëè÷èíîé 2500 Â: îíè ñ÷èòàþòñÿ îïòèìàëüíûìè äëÿ èñïîëüçóåìûõ óñëîâèé ðàáîòû; ðåêîìåíäóåòñÿ èñòî÷íèê òîêà, èìåþùèé ïîñòîÿííóþ ìîùíîñòü äî 30 Âò; – æåñòêîé ïëàñòèêîâîé ÈÝÔ êàìåðû, â êî- òîðîé íàõîäèòñÿ îõëàæäàåìàÿ ïëàñòèíêà èëè ïîäõîäÿùèé ìàòåðèàë, ñëóæàùèé îñíîâîé äëÿ íàíåñåíèÿ ãåëÿ; – ïîëèìåðíîé êðûøêè ñ ïëàòèíîâûìè ýëåê- òðîäàìè, êîòîðûå ñîåäèíåíû ñ ãåëåì ñ ïîìî- ùüþ áóìàæíûõ ôèòèëåé ïîäõîäÿùåé øèðèíû, äëèíû è òîëùèíû, ïðîïèòàííûõ ðàñòâîðàìè àíîäíûõ è êàòîäíûõ ýëåêòðîëèòîâ. ÈÇÎÝËÅÊÒÐÈ×ÅÑÊÎÅ ÔÎÊÓÑÈÐÎÂÀÍÈÅ Â ÏÎËÈÀÊÐÈËÀÌÈÄÍÛÕ ÃÅËßÕ: ÏÎÄÐÎÁÍÀß ÌÅÒÎÄÈÊÀ Ïðèâåäåííàÿ íèæå ìåòîäèêà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ïîäðîáíîå îïèñàíèå ïðîöåäóðû ÈÝÔ â ïëàñòèíàõ ïîëèàêðèëàìèäíîãî ãåëÿ, èñïîëüçóå- ìîé ïðè îòñóòñòâèè äðóãèõ óêàçàíèé â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. ÏÐÈÃÎÒÎÂËÅÍÈÅ ÃÅËÅÉ Ìàòðèöà ôîðìîâàíèÿ. Ìàòðèöà ôîðìîâà- íèÿ (ñì. ðèñóíîê 2.1.2.38.-1) ñîñòîèò èç ñòåêëÿí- íîé ïëàñòèíêè (A), íà êîòîðóþ äëÿ îáëåã÷åíèÿ ðàáîòû ñ ãåëåì ïîìåùåíà ïîëèýôèðíàÿ ïëåíêà (B), îäíîé èëè íåñêîëüêèõ ðàñïîðíûõ äåòàëåé (C), âòîðîé ñòåêëÿííîé ïëàñòèíêè (D) è çàæè- ìîâ, ñêðåïëÿþùèõ âñþ êîíñòðóêöèþ. 7,5 %-íûé ïîëèàêðèëàìèäíûé ãåëü. 29,1 ã àêðèëàìèäà Ð è 0,9 ã ìåòèëåíáèñàêðèëà- ìèäà Ð ðàñòâîðÿþò â 100 ìë âîäû Ð. Ê 2,5 îáúå- ìàì ïîëó÷åííîãî ðàñòâîðà ïðèáàâëÿþò ñìåñü àìôîëèòîâ, óêàçàííûõ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåé- íîé ñòàòüå, è äîâîäÿò âîäîé Ð äî îáúåìà 10 ìë. Ðàñòâîð òùàòåëüíî ïåðåìåøèâàþò è äåãàçèðó- þò. Ïðèãîòîâëåíèå ôîðìû. Ïîëèýôèðíóþ ïëåíêó ïîìåùàþò íà íèæíþþ ñòåêëÿííóþïëà- ñòèíêó, âñòàâëÿþò ðàñïîðíóþ äåòàëü, ïîìåùà- þò âòîðóþ ñòåêëÿííóþ ïëàñòèíêó è ñêðåïëÿþò êîíñòðóêöèþ çàæèìàìè.
Ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì ðàñòâîð ïîìåùàþò íà ìàãíèòíóþ ìåøàëêó è ïðèáàâëÿþò ê íåìó 0,25 îáúåìà ðàñòâîðà 100 ã/ë àììîíèÿ ïåðñóëüôàòà Ð è 0,25 îáúåìà òåòðà- ìåòèëýòèëåíäèàìèíà Ð. Íåìåäëåííî çàïîëíÿ- þò ðàñòâîðîì ïðîñòðàíñòâî ìåæäó ñòåêëÿííû- ìè ïëàñòèíêàìè ôîðìû. ÌÅÒÎÄÈÊÀ Ôîðìó ðàçáèðàþò íà ñîñòàâíûå ÷àñòè è, èñ- ïîëüçóÿ ïîëèýôèðíóþ ïëåíêó, ïåðåíîñÿò ãåëü íà îõëàæäåííóþ ïîäëîæêó, óâëàæíåííóþ íå- ñêîëüêèìè ìèëëèëèòðàìè ïîäõîäÿùåé æèäêî- ñòè, èçáåãàÿ îáðàçîâàíèÿ âîçäóøíûõ ïóçûðü- êîâ. Ãîòîâÿò èñïûòóåìûå ðàñòâîðû è ðàñòâîðû ñðàâíåíèÿ, â ñîîòâåòñòâèè ñ óêàçàíèÿìè â ÷àñò- íîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. Äëÿ íàíåñåíèÿ îá- ðàçöà íà ïîâåðõíîñòü ãåëÿ ïîìåùàþò ïîëîñêè áóìàãè ðàçìåðîì ïðèáëèçèòåëüíî 10 ìì ´ 5 ìì è ïðîïèòûâàþò êàæäóþ èç íèõ óêàçàííûì êîëè- ÷åñòâîì èñïûòóåìîãî ðàñòâîðà è ðàñòâîðà ñðàâ- íåíèÿ. Òàêæå íàíîñÿò óêàçàííîå â ÷àñòíîé ôàð- ìàêîïåéíîé ñòàòüå êîëè÷åñòâî ðàñòâîðà áåëêîâ ñ èçâåñòíûìè âåëè÷èíàìè èçîýëåêòðè÷åñêèõ òî÷åê, ñëóæàùèõ â êà÷åñòâå ìàðêåðîâ ðÍ äëÿ êà- ëèáðîâêè ãåëÿ.  íåêîòîðûõ ïðîòîêîëàõ âìåñòî èìïðåãíèðîâàííûõ áóìàæíûõ ïîëîñîê èñïîëü- çóþò ãåëü, êîòîðûé èìååò ëóíêè, ïðåäíàçíà÷åí- íûå äëÿ ïîìåùåíèÿ ðàñòâîðà îáðàçöà. Îòðåçàþò 2 ïîëîñêè áóìàãè äëèíîé, ñîîòâåòñòâóþùåé äëèíå ãåëÿ, è ïðîïèòûâàþò èõ ðàñòâîðàìè ýëåê- 117 Ðèñóíîê 2.1.2.38.-1. — Ìàòðèöà ôîðìîâàíèÿ òðîëèòîâ: êèñëîòîé äëÿ àíîäà è ùåëî÷üþ äëÿ êàòîäà (ñîñòàâû àíîäíîãî è êàòîäíîãî ðàñòâîðîâ ïðèâîäÿòñÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå). Ýòè áóìàæíûå ôèòèëüêè ïîìåùàþò íà êàæäóþ ñòîðîíó ãåëÿ íà ðàññòîÿíèè íåñêîëüêèõ ìèëëè- ìåòðîâ îò åãî ãðàíèöû. Óñòàíàâëèâàþò êðûøêó òàê, ÷òîáû ýëåêòðîäû êîíòàêòèðîâàëè ñ ïîëîñ- êàìè áóìàãè (ñîîòâåòñòâåííî, àíîäíûì è êàòîä- íûì ïîëÿìè). Âûïîëíÿþò èçîýëåêòðè÷åñêîå ôîêóñèðîâàíèå, èñïîëüçóÿ ïàðàìåòðû, ýëåêòðè- ÷åñêîãî ïîëÿ, óêàçàííûå â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåé- íîé ñòàòüå. Êîãäà ìèãðàöèÿ ñìåñè ñòàíäàðòíûõ áåëêîâ ñòàáèëèçèðóåòñÿ, îòêëþ÷àþò èñòî÷íèê ïèòàíèÿ. Ñ ïîìîùüþ ïèíöåòà óäàëÿþò ïîëîñêè, ïðåäíàçíà÷åííûå äëÿ íàíåñåíèÿ îáðàçöà, è 2 ýëåêòðîäíûõ ôèòèëüêà. Ïîãðóæàþò ãåëü â ôèê- ñèðóþùèé ðàñòâîð äëÿ èçîýëåêòðè÷åñêîãî ôî- êóñèðîâàíèÿ â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå Ð. Âûäåð- æèâàþò, îñòîðîæíî âñòðÿõèâàÿ, ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 30 ìèí. Ñëèâàþò ðàñòâîð è ïðèáàâëÿþò 200 ìë îáåñöâå÷èâàþùåãî ðàñ- òâîðà Ð. Âûäåðæèâàþò ïðè ïåðåìåøèâàíèè â òå÷åíèå 1 ÷. Âûñóøèâàþò ãåëü, ïðèáàâëÿþò Êó- ìàññè êðàñÿùèé ðàñòâîð Ð. Âûäåðæèâàþò â òå- ÷åíèå 30 ìèí è îáåñöâå÷èâàþò ãåëü ïóòåì ïàñ- ñèâíîé äèôôóçèè îáåñöâå÷èâàþùåãî ðàñòâîðà Ð äî òåõ ïîð, ïîêà íà ÷èñòîì ôîíå íå áóäóò õî- ðîøî âèäíû ïîëîñû. Ïîëîæåíèå è èíòåíñèâ- íîñòü ïîëîñ íà ýëåêòðîôîðåãðàììå, îòìå÷àþò â ñîîòâåòñòâèè ñ óêàçàíèÿìè â ÷àñòíîé ôàðìàêî- ïåéíîé ñòàòüå. ÈÇÌÅÍÅÍÈß ÏÎÄÐÎÁÍÎÉ ÌÅÒÎÄÈÊÈ (ÏÐÅÄÌÅÒ ÂÀËÈÄÀÖÈÈ) Òàì, ãäå äåëàåòñÿ ññûëêà íà îáùóþ ìåòîäè- êó èçîýëåêòðè÷åñêîãî ôîêóñèðîâàíèÿ, èçìåíå- íèÿ â ìåòîäîëîãèè èëè ìåòîäèêå èçîýëåêòðè÷å- ñêîãî ôîêóñèðîâàíèÿ ìîãóò áûòü ïðåäìåòîì âà- ëèäàöèè.
Îíè âêëþ÷àþò â ñåáÿ: – èñïîëüçîâàíèå èìåþùèõñÿ â ïðîäàæå ãå- ëåé çàâîäñêîãî ïðîèçâîäñòâà, à òàêæå îêðàøè- âàþùèõ è îáåñöâå÷èâàþùèõ íàáîðîâ; – èñïîëüçîâàíèå ôèêñèðîâàííûõ ãðàäèåí- òîâ ðÍ; – èñïîëüçîâàíèå ñòåðæíåâûõ ãåëåé; – èñïîëüçîâàíèå êàññåò ãåëÿ ðàçëè÷íûõ ðàç- ìåðîâ, âêëþ÷àÿ óëüòðàòîíêèå (0,2 ìì) ãåëè; – èçìåíåíèÿ â ìåòîäèêå íàíåñåíèÿ îáðàçöà, âêëþ÷àþùèå ðàçëè÷íûå îáúåìû îáðàçöà èëè èñïîëüçîâàíèå øàáëîíîâ èëè ôèòèëüêîâ, èçãî- òîâëåííûõ íå èç áóìàãè; – èñïîëüçîâàíèå àëüòåðíàòèâíûõ óñëîâèé ïåðåìåùåíèÿ, âêëþ÷àþùèõ èçìåíåíèÿ ýëåêòðè- ÷åñêîãî ïîëÿ â çàâèñèìîñòè îò ðàçìåðîâ ãåëÿ è îáîðóäîâàíèÿ, à òàêæå èñïîëüçîâàíèå ôèêñèðî- âàííûõ âðåìåí ìèãðàöèè âìåñòî ñóáúåêòèâíîé èíòåðïðåòàöèè ñòàáèëüíîñòè ïîëîñû; – âêëþ÷åíèå ñòàäèè ïðåäâàðèòåëüíîãî ôî- êóñèðîâàíèÿ; – èñïîëüçîâàíèå àâòîìàòèçèðîâàííîãî îáî- ðóäîâàíèÿ; – èñïîëüçîâàíèå ãåëåé àãàðîçû. ÂÀËÈÄÀÖÈß ÌÅÒÎÄÈÊÈ ÈÇÎÝËÅÊÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÔÎÊÓÑÈÐÎÂÀÍÈß Ïðè èñïîëüçîâàíèè àëüòåðíàòèâíûõ ìåòî- äèê ïî îòíîøåíèþ ê îïèñàííîé ìåòîäèêå, îíè äîëæíû áûòü âàëèäèðîâàíû. Äëÿ âàëèäàöèè ðàçäåëåíèÿ ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû ñëåäóþ- ùèå êðèòåðèè: – îáðàçîâàíèå óñòîé÷èâîãî ãðàäèåíòà ðÍ ñ æåëàåìûìè õàðàêòåðèñòèêàìè, îöåíèâàåìîãî, íàïðèìåð, ñ ïîìîùüþ îêðàøåííûõ ìàðêåðîâ ðÍ ñ èçâåñòíûìè âåëè÷èíàìè èçîýëåêòðè÷åñêèõ òî÷åê; – ñðàâíåíèå ýëåêòðîôîðåãðàììû, ïðèëàãàå- ìîé ê ñòàíäàðòíîìó îáðàçöó, ñ ýëåêòðîôîðå- ãðàììîé, ïîëó÷åííîé ïðè ïðîâåäåíèè èñïûòà- íèÿ; – ëþáûå äðóãèå êðèòåðèè âàëèäàöèè, óêà- çàííûå â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. ÑÏÅÖÈÔÈÖÈÐÎÂÀÍÍÛÅ ÈÇÌÅÍÅÍÈß ÎÁÙÅÉ ÌÅÒÎÄÈÊÈ Èçìåíåíèÿ îáùåé ìåòîäèêè, íåîáõîäèìûå ïðè àíàëèçå êîíêðåòíûõ ñóáñòàíöèé, ìîãóò áûòü ïîäðîáíî îïèñàíû â ÷àñòíûõ ôàðìàêîïåé- íûõ ñòàòüÿõ. Îíè âêëþ÷àþò: – äîáàâëåíèå â ãåëü ìî÷åâèíû (îáû÷íî 3 M êîíöåíòðàöèÿ äîñòàòî÷íà äëÿ ïîääåðæèâàíèÿ áåëêà â ðàñòâîðåííîì ñîñòîÿíèè, íî ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà êîíöåíòðàöèÿ äî 8 M): íåêîòîðûå áåëêè â èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êå âûïàäàþò â îñàäîê, â ýòîì ñëó÷àå äëÿ òîãî, ÷òîáû áåëîê îñ- òàâàëñÿ â ðàñòâîðå, â ãåëü ââîäèòñÿ ìî÷åâèíà; ïðè èñïîëüçîâàíèè ìî÷åâèíû ñëåäóåò ïðèìå- íÿòü òîëüêî åå ñâåæèå ðàñòâîðû, ÷òîáû íå äî- ïóñòèòü êàðáàìîèëèðîâàíèÿ áåëêà; 118 – èñïîëüçîâàíèå àëüòåðíàòèâíûõ ñïîñîáîâ îêðàøèâàíèÿ; – èñïîëüçîâàíèå äîáàâîê äëÿ ãåëÿ, òàêèõ êàê íåèîííûå äåòåðãåíòû (íàïðèìåð, îêòèëãëþ- êîçèä) èëè öâèòòåð-èîííûå äåòåðãåíòû (íàïðè- ìåð, CHAPS èëè CHAPSO), è äîáàâëåíèå àìôî- ëèòà ê îáðàçöó äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ ïðîöåññîâ àãðåãàöèè è ïðåöèïèòàöèè áåëêîâ. ÏÎËÎÆÅÍÈß, ÊÎÒÎÐÛÅ ÑËÅÄÓÅÒ ÏÐÈÍÈÌÀÒÜ ÂÎ ÂÍÈÌÀÍÈÅ Îáðàçöû ìîãóò íàíîñèòüñÿ íà ëþáîé ó÷à- ñòîê ïîâåðõíîñòè ãåëÿ, íî äëÿ òîãî, ÷òîáû çàùè- òèòü áåëêè îò ýêñòðåìàëüíûõ çíà÷åíèé ðÍ, îá- ðàçöû íå äîëæíû íàíîñèòüñÿ â íåïîñðåäñòâåí- íîé áëèçîñòè îò ýëåêòðîäîâ. Ïðè ðàçðàáîòêå ìåòîäèêè àíàëèòèê ìîæåò íàíåñòè áåëîê íà ãåëü â òðåõ ìåñòàõ (ïîñåðåäèíå è íà îáîèõ êîíöàõ). Îáðàçöû áåëêà, íàíîñèìûå íà ïðîòèâîïîëîæ- íûå êîíöû ãåëÿ, ìîãóò áûòü ðàçëè÷íûìè. Ïðè ñëèøêîì ïðîäîëæèòåëüíîì ôîêóñèðî- âàíèè â ãåëå ìîæåò âîçíèêíóòü ïðîöåññ, íàçû- âàåìûé êàòîäíûì äðåéôîì, ïðè êîòîðîì ãðàäè- åíò ðÍ ñ òå÷åíèåì âðåìåíè ðàçðóøàåòñÿ. Ïðè- ÷èíû äàííîãî ÿâëåíèÿ íå ñîâñåì ÿñíû, íî ôàêòîðàìè, âûçûâàþùèìè êàòîäíûé äðåéô, ìî- ãóò áûòü ýëåêòðîýíäîîñìîñ è àáñîðáöèÿ óãëåðî- äà äèîêñèäà. Äëÿ èññëåäîâàíèÿ ýòîé ïðîáëåìû ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû ôèêñèðîâàííûå ãðà- äèåíòû ðÍ. Âî âðåìÿ ïðîâåäåíèÿ ôîêóñèðîâàíèÿ âàæíî îáåñïå÷èòü ýôôåêòèâíîå îõëàæäåíèå (ïðèáëè- çèòåëüíî 4 °C) ïîäëîæêè, íà êîòîðóþ ïîìåùåí ãåëü. Âûñîêèå íàïðÿæåííîñòè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ, èñïîëüçóåìûå âî âðåìÿ èçîýëåêòðè÷åñêî- ãî ôîêóñèðîâàíèÿ, ìîãóò ïðèâîäèòü ê ïåðåãðå- âàíèþ è âëèÿòü íà êà÷åñòâî ôîêóñèðóåìîãî ãåëÿ. 201020039-2019 2.1.2.39.
Ïåïòèäíîå êàðòèðîâàíèå Ïåïòèäíîå êàðòèðîâàíèå ïðåäñòàâëÿåò ñî- áîé ìåòîä èäåíòèôèêàöèè áåëêîâ, îñîáåííî ïî- ëó÷àåìûõ ìåòîäîì ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ. Ìå- òîä âêëþ÷àåò õèìè÷åñêîå èëè ôåðìåíòàòèâíîå ðàñùåïëåíèå áåëêîâ äî îáðàçîâàíèÿ ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ ñ ïîñëåäóþùèì èõ ðàçäåëåíèåì è èäåíòèôèêàöèåé âîñïðîèçâîäèìûì ñïîñîáîì. Ýòî íàäåæíûé ìåòîä èñïûòàíèÿ, ïîçâîëÿþùèé èäåíòèôèöèðîâàòü çàìåíó ïðàêòè÷åñêè ëþáîé- îòäåëüíîé àìèíîêèñëîòû, ïðîèçîøåäøåé âñëåäñòâèå îøèáîê ïðè òðàíñêðèïöèè êîìïëå- ìåíòàðíîé ÄÍÊ (êÄÍÊ), èëè òî÷å÷íûõ ìóòà- öèé. Ïåïòèäíîå êàðòèðîâàíèå ïðåäñòàâëÿåò ñî- áîé ïðîöåäóðó ñðàâíåíèÿ, ïîñêîëüêó ñðàâíåíèå ïîëó÷åííîé èíôîðìàöèè ñ îáðàáîòàííûì òà- êèì æå îáðàçîì ñòàíäàðòíûì îáðàçöîì ïîçâî- ëÿåò ïîäòâåðäèòü ïåðâè÷íóþ ñòðóêòóðó áåëêà, îïðåäåëèòü âîçìîæíûå èçìåíåíèÿ ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû â ñëó÷àå íàëè÷èÿ òàêîâûõ, ïîäòâåð- äèòü ñîîòâåòñòâèå ïðîöåññà è ãåíåòè÷åñêóþ ñòàáèëüíîñòü. Êàæäûé áåëîê îáëàäàåò óíèêàëü- íûìè õàðàêòåðèñòèêàìè, êîòîðûå äîëæíû áûòü õîðîøî èçó÷åíû, ÷òîáû íàó÷íûå è àíàëèòè÷å- ñêèå ïîäõîäû ïîçâîëÿëè âàëèäèðîâàòü ðàçðà- áîòêó ïåïòèäíîé êàðòû, îáåñïå÷èâàþùåé äîñ- òàòî÷íóþ ñïåöèôè÷íîñòü. Äàííûéðàçäåë ñîäåðæèò äåòàëüíîå îïèñà- íèå àñïåêòîâ èñïîëüçîâàíèÿ è âàëèäàöèè ìåòî- äà ïåïòèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ õàðàêòåðèñòèêè àíàëèçèðóåìîãî áåëêà, îöåíêè ñòàáèëüíîñòè êëåòî÷íûõ ñèñòåì ýêñïðåññèè, èñïîëüçóåìûõ äëÿ ïîëó÷åíèÿ ïðîäóêòîâ ðåêîì- áèíàíòíûõ ÄÍÊ è îöåíêè ñîãëàñîâàííîñòè ïðî- öåññà â öåëîì — â îòíîøåíèè êàê îöåíêè ñòà- áèëüíîñòè ïðîäóêòà, òàê è îáåñïå÷åíèÿ èäåí- òè÷íîñòè áåëêà, ëèáî îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ïðîòåèíîâ ñ èçìåíåíèÿìè â ñòðóêòóðå. Ïåïòèäíîå êàðòèðîâàíèå íå ÿâëÿåòñÿ îáùèì ìåòîäîì, à çàêëþ÷àåòñÿ â ñîñòàâëåíèè èíäèâè- äóàëüíûõ êàðò äëÿ êàæäîãî îòäåëüíîãî áåëêà. Õîòÿ òåõíîëîãèè ïðîäîëæàþò ñòðåìèòåëüíî ðàçâèâàòüñÿ, ñóùåñòâóåò ðÿä ìåòîäîâ, êîòîðûå ÿâëÿþòñÿ îáùåïðèçíàííûìè. Ïðè íàëè÷èè îï- ðåäåëåííûõ ðàñõîæäåíèé ñ äàííûìè ìåòîäàìè îíè áóäóò îïèñûâàòüñÿ â ñîîòâåòñòâóþùèõ ÷à- ñòíûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòüÿõ. Ñîñòàâëåíèå ïåïòèäíûõ êàðò ìîæåò ðàñ- ñìàòðèâàòüñÿ êàê ìåòîä ïîëó÷åíèÿ «îòïå÷àòêîâ ïàëüöåâ» áåëêà è ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ïîëó÷àå- ìóþ â ðåçóëüòàòå ðÿäà õèìè÷åñêèõ ïðîöåññîâ ïîëíóþ ðàñøèôðîâêó àíàëèçèðóåìîãî áåëêà. Ìåòîä âêëþ÷àåò ÷åòûðå ïðèíöèïèàëüíûå ñòà- äèè: âûäåëåíèå è î÷èñòêà áåëêà — â ñëó÷àå, åñëè áåëîê âõîäèò â ñîñòàâ êàêîé-ëèáî ñìåñè; èçáèðàòåëüíîå ðàñùåïëåíèå ïåïòèäíûõ ñâÿçåé; õðîìàòîãðàôè÷åñêîå ðàçäåëåíèå îáðàçóþùèõñÿ ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ; àíàëèç è èäåíòèôèêà- öèÿ ïåïòèäîâ. Àíàëèçèðóåìûé îáðàçåö ïîäâåð- ãàåòñÿ ðàñùåïëåíèþ è àíàëèçó ïàðàëëåëüíî ñî 119 ñòàíäàðòíûì îáðàçöîì. Ïîëíîå ðàñùåïëåíèå ïåïòèäíûõ ñâÿçåé áîëåå âåðîÿòíî, êîãäà âìåñòî õèìè÷åñêèõ ãèäðîëèçóþùèõ ðåàãåíòîâ èñïîëü- çóþòñÿ òàêèå ôåðìåíòû, êàê ýíäîïåïòèäàçû (íà- ïðèìåð, òðèïñèí). Äëÿ òîãî, ÷òîáû êàðòà áûëà èíôîðìàòèâíîé, îíà äîëæíà ñîäåðæàòü äîñòà- òî÷íîå êîëè÷åñòâî ïåïòèäîâ. Ñ äðóãîé ñòîðîíû, â ñëó÷àå, åñëè ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ áóäåò ñëèøêîì ìíîãî, êàðòà ìîæåò óòðàòèòü ñâîþ ñïå- öèôè÷íîñòü, ïîñêîëüêó ó ìíîãèõ áåëêîâ ìîæåò îêàçàòüñÿ àíàëîãè÷íûé ïðîôèëü. ÂÛÄÅËÅÍÈÅ È Î×ÈÑÒÊÀ Âûäåëåíèå è î÷èñòêà íåîáõîäèìû ïðè àíà- ëèçå íåðàñôàñîâàííûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ èëè ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ, ñîäåðæàùèõ âñïîìîãàòåëüíûå âåùåñòâà ìåøàþùèå àíàëèçó èëè íîñèòåëè áåëêîâ î ÷åì, ïðè íåîáõîäèìîñòè, áóäóò óêàçûâàòü â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòà- òüå. Êîëè÷åñòâåííîå èçâëå÷åíèå áåëêà èç ëåêàð- ñòâåííîãî ïðåïàðàòà äîëæíî áûòü âàëèäèðî- âàíî. ÈÇÁÈÐÀÒÅËÜÍÎÅ ÐÀÑÙÅÏËÅÍÈÅÏÅÏÒÈÄÍÛÕ ÑÂßÇÅÉ Âûáîð ïîäõîäà, èñïîëüçóåìîãî äëÿðàñùåï- ëåíèÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåéáóäåò çàâèñåòüîò àíàëè- çèðóåìîãî áåëêà.
Ïðîöåäóðà âûáîðà âêëþ÷àåò îïðåäåëåíèå òèïà ðàñùåïëåíèÿ (õèìè÷åñêîãî èëè ôåðìåíòàòèâíîãî), à òàêæå òèïà ïðîòåîëè- òè÷åñêîãî ðåàãåíòà â ðàìêàõ âûáðàííîé êàòåãî- ðèè.  òàáëèöå 2.1.2.39.-1 ïðèâåäåí ðÿä ïðîòåî- ëèòè÷åñêèõ ðåàãåíòîâ è ïàðàìåòðû èõ ñïåöè- ôè÷íîñòè. Äàííûé ñïèñîê íå ÿâëÿåòñÿ èñ÷åðïûâàþùèì è áóäåò äîïîëíÿòüñÿ ïî ìåðå îïðåäåëåíèÿ äðóãèõ ðåàãåíòîâ, ñïîñîáíûõ ðàñ- ùåïëÿòü ïåïòèäíûå ñâÿçè. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ îáðàáîòêà îáðàçöà.  çàâèñèìîñòè îò ðàçìåðà èëè êîíôèãóðàöèè áåë- êà èñïîëüçóþò ðàçëè÷íûå ïîäõîäû ê ïðåäâàðè- òåëüíîé îáðàáîòêåîáðàçöà. Åñëè äëÿ ðàñùåïëå- íèÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåé áåëêà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé áîëåå 100 000 Äà èñïîëüçóþò òðèïñèí, îñòàòêè ëèçèíà äîëæíû áûòü çàùèùåíû ïóòåì ïîëó÷åíèÿ ïðîèçâîäíûõ ñ öèòðàêîíîâûì èëè ìàëåèíîâûì àíãèäðèäàìè, òàê êàê â ïðîòèâíîì ñëó÷àå ìîæåò îáðàçîâàòüñÿ ñëèøêîì ìíîãî ïåï- òèäíûõ ôðàãìåíòîâ. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ îáðàáîòêà ðàñùåïëÿþ- ùåãî àãåíòà. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ îáðàáîòêà ðàñ- ùåïëÿþùåãî àãåíòà, îñîáåííî ôåðìåíòîâ, ìî- æåò áûòü íåîáõîäèìà äëÿ îáåñïå÷åíèÿ òðåáóå- ìîé ÷èñòîòû è âîñïðîèçâîäèìîñòè êàðòû. Íàïðèìåð, òðèïñèí, èñïîëüçóåìûé â êà÷åñòâå ðåàãåíòà äëÿ ðàñùåïëåíèÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåé, ñëåäóåò îáðàáîòàòü òîçèë-L-ôåíèëàëàíèíõëîð- 120 Òàáëèöà 2.1.2.39.-1. — Ïðèìåðû ðåàãåíòîâ äëÿ ðàñùåïëåíèÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåé Òèï Ðåàãåíò Ñïåöèôè÷íîñòü Ôåðìåíòàòèâíûå Òðèïñèí (ÅÑ 3.4.21.4) Ñ-êîíöåâûå àðãèíèí è ëèçèí Õèìîòðèïñèí (ÅÑ 3.4.21.1) Ñ-êîíöåâûå ãèäðîôèëüíûå îñòàòêè (íàïðèìåð, ëåéöèí, ìåòèîíèí, àëàíèí, àðîìàòè÷åñêèå àìèíîêèñëîòû) Ïåïñèí (ÅÑ 3.4.23.1 è 2) Íåñïåöèôè÷åñêèé ðåàãåíò Ëèçèëýíäîïåïòèäàçà (Lys-C ýíäîïåïòèäàçà) (ÅÑ 3.4.21.50) Ñ-êîíöåâîé ëèçèí Ãëóòàìèëýíäîïåïòèäàçà (èç S. aureus øòàìì V8) (ÅÑ 3.4.21.19) Ñ-êîíöåâûå ãëóòàìèí è àñïàðàãèí Ïåïòèäèë-Asp ìåòàëî-ýíäîïåïòèäàçà (ýíäîïðîòåàçàAsp-N) N-êîíöåâîé àñïàðàãèí Êëîñòðèïàèí(ÅÑ 3.4.22.8) C-êîíöåâîé àðãèíèí Õèìè÷åñêèå Öèàíîáðîìèä C-êîíöåâîé ìåòèîíèí 2-Íèòðî-5-òèî-öèàíîáåíçîéíàÿ êèñëîòà N-êîíöåâîéöèñòåèí Î-Éîäîçîáåíçîéíàÿ êèñëîòà Ñ-êîíöåâûå òðèïòîôàí è òèðîçèí Ðàçáàâëåííàÿ êèñëîòà Àñïàðàãèí è ïðîëèí BNPS-ñêàòîë Òðèïòîôàí ìåòèëêåòîíîì ñ öåëüþ èíàêòèâàöèè õèìîòðèï- ñèíà. Äðóãèå ìåòîäû, íàïðèìåð, î÷èñòêà òðèï- ñèíàìåòîäîì âûñîêîýôôåêòèâíîé æèäêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè (ÂÝÆÕ) èëè èììîáèëèçàöèÿ ôåðìåíòà íà ãåëåâîì íîñèòåëå, óñïåøíî èñ- ïîëüçóþòñÿ, îñîáåííî ïðè îãðàíè÷åííîì êîëè- ÷åñòâå èìåþùåãîñÿ áåëêà. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ îáðàáîòêà áåëêà. Ïðè îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ ìîæåò ïîòðåáîâàòüñÿ êîíöåíòðèðîâàíèå îáðàçöà èëè îòäåëåíèå áåëêà îò èñïîëüçóåìûõ â ãîòîâîì ïðîäóêòå âñïîìîãà- òåëüíûõ âåùåñòâ è ñòàáèëèçàòîðîâ, åñëè îíè ìåøàþò ïðîöåäóðå êàðòèðîâàíèÿ. Èñïîëüçóå- ìûå äëÿ ïðåäâàðèòåëüíîé ïîäãîòîâêè áåëêà ôè- çè÷åñêèå ïðîöåäóðû ìîãóò âêëþ÷àòü óëüòðà- ôèëüòðàöèþ, êîëîíî÷íóþ õðîìàòîãðàôèþ è ëèîôèëèçàöèþ. Ñ öåëüþ ïðîâåäåíèÿ äåíàòóðà- öèè áåëêà äî ïðîöåäóðû ïåïòèäíîãî êàðòèðîâà- íèÿ âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå äðóãèõ ìåòîäîâ ïîäãîòîâêè, òàêèõ êàê äîáàâëåíèå õàîòðîïíûõ àãåíòîâ(íàïðèìåð, ìî÷åâèíû). Äëÿ îáåñïå÷åíèÿ ïîëíîãî äîñòóïà ôåðìåíòà ê ìåñòàì ðàçðûâà ñâÿçåé è ÷àñòè÷íîé äåíàòóðàöèè áåëêà ÷àñòî äî ïðîâåäåíèÿïðîòåîëèòè÷åñêîãî ðàñùåïëåíèÿ íå- îáõîäèìî âîññòàíîâëåíèå è àëêèëèðîâàíèå äè- ñóëüôèäíûõ ñâÿçåé. Ðàñùåïëåíèå ïåïòèäíûõ ñâÿçåé ñ èñïîëüçîâàíèåì òðèïñèíà ìîæåò ñî- ïðîâîæäàòüñÿ ïîÿâëåíèåì â ïåïòèäíîé êàðòå ðÿäà íåòî÷íîñòåé ââèäó ïðîòåêàþùèõ ïàðàë- ëåëüíî ñ ðåàêöèåé ïðîòåîëèòè÷åñêîãî ðàñùåï- ëåíèÿ ïîáî÷íûõ ðåàêöèé, òàêèõ êàê íåñïåöèôè- ÷åñêîå ðàñùåïëåíèå, äåçàìèíèðîâàíèå, äèñóëü- ôèäíàÿ èçîìåðèçàöèÿ, îêèñëåíèå îñòàòêîâ ìåòèîíèíà, îáðàçîâàíèå ïèðîãëóòàìèíîâûõ ãðóïï ïðè äåçàìèíèðîâàíèè ãëóòàìèíà íà N-êîíöåâîé ñòîðîíå ïåïòèäà.
Áîëåå òîãî, ïðè àâòîãèäðîëèçå òðèïñèíà òàêæå ìîãóò ïîÿâëÿòü- ñÿ äîïîëíèòåëüíûå ïèêè. Èíòåíñèâíîñòü èõ îá- ðàçîâàíèÿ çàâèñèò îò ñîîòíîøåíèÿ ñîäåðæàíèÿ òðèïñèíà ê áåëêó. Äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ àâòîãèä- ðîëèçà ðàñòâîðû ïðîòåàç ìîãóò áûòü ïðèãîòîâ- ëåíû ïðè ðÍ, îòëè÷íîì îò îïòèìàëüíîãî çíà÷å- íèÿ (íàïðèìåð, ïðè ðÍ 5 äëÿ òðèïñèíà), áëàãî- äàðÿ ÷åìó ôåðìåíò íå ïåðåéäåò â àêòèâíîå ñîñòîÿíèå äî ìîìåíòà ðàçâåäåíèÿ ñ áóôåðíûì ðàñòâîðîì ïðè ïðîâåäåíèè ðàñùåïëåíèÿ. Óñòàíîâëåíèå îïòèìàëüíûõ óñëîâèé äëÿ ðàñùåïëåíèÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåé. Ôàêòîðû, êî- òîðûå âëèÿþò íà ïîëíîòó è ýôôåêòèâíîñòü ðàñ- ùåïëåíèÿ ïðîòåèíîâ, ÿâëÿþòñÿ ôàêòîðàìè, îêà- çûâàþùèìè âëèÿíèå íà õèìè÷åñêèå è ôåðìåí- òàòèâíûå ðåàêöèè. ðÍ ðåàêöèîííîé ñðåäû. Çíà÷åíèå ðÍ ñìåñè, â êîòîðîé îñóùåñòâëÿåòñÿ ðàñùåïëåíèå ïåïòè- äà, îïðåäåëÿåòñÿ ýìïèðè÷åñêè÷òî îáåñïå÷èâàåò îïòèìèçàöèþ ñîñòîÿíèÿ ðàñùåïëÿþùåãî ðåà- ãåíòà. Íàïðèìåð, ïðè èñïîëüçîâàíèè áðîìöèàíà â êà÷åñòâå ðàñùåïëÿþùåãî ðåàãåíòà íåîáõîäè- ìûì ÿâëÿåòñÿ ñîçäàíèå ñèëüíîêèñëîé ñðåäû (íàïðèìåð, ðÍ 2, ìóðàâüèíàÿ êèñëîòà); îäíàêî ïðè èñïîëüçîâàíèè òðèïñèíà â êà÷åñòâå ðàñùå- ïëÿþùåãî àãåíòà îïòèìàëüíîé ÿâëÿåòñÿ ñëàáî- ùåëî÷íàÿ ñðåäà (ðÍ 8).  öåëîì çíà÷åíèå ðÍ ðåàêöèîííîé ñðåäû íå äîëæíî èçìåíÿòü õèìè- ÷åñêóþ ñòðóêòóðó áåëêà â õîäå ðåàêöèè ðàñùåï- ëåíèÿ è íå äîëæíî èçìåíÿòüñÿ â õîäå ïðîâåäå- íèÿ ðåàêöèè ôðàãìåíòàöèè. Òåìïåðàòóðà. Äëÿ áîëüøèíñòâà ðåàêöèé ðàñùåïëåíèÿ íàèáîëåå ïîäõîäÿùåé ÿâëÿåòñÿ òåìïåðàòóðà â èíòåðâàëå îò 25 °Ñ äî 37 °Ñ. Ñîç- äàâàåìàÿ òåìïåðàòóðà äîëæíà ñïîñîáñòâîâàòü ìèíèìèçàöèè ïîáî÷íûõ õèìè÷åñêèõ ðåàêöèé. Òèï èñïûòóåìîãî áåëêà îïðåäåëÿåò âûáîð òåì- ïåðàòóðû ðåàêöèîííîé ñðåäû, ïîñêîëüêó íåêî- òîðûå áåëêè ñ ïîâûøåíèåì òåìïåðàòóðû ñêëîí- íû ê äåíàòóðàöèè. Íàïðèìåð, ðàñùåïëåíèå ðåêîìáèíàíòíîãî áû÷üåãî ñîìàòðîïèíà ïðîâî- äèòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 4 °Ñ, ïîñêîëüêó ïðè áî- ëåå âûñîêîé òåìïåðàòóðå îí îñàæäàåòñÿ â õîäå ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèè ðàñùåïëåíèÿ. Âðåìÿ.  ñëó÷àå åñëè èìååòñÿ äîñòàòî÷íîå êîëè÷åñòâî èñïûòóåìîãîîáðàçöà, ñëåäóåò ïðî- âåñòè èñïûòàíèå ïî îïðåäåëåíèþ âðåìåíè, ÿâëÿþùåãîñÿ îïòèìàëüíûì äëÿ ïîëó÷åíèÿ âîñ- ïðîèçâîäèìîé êàðòû è äîñòàòî÷íûì äëÿ ïðîâå- äåíèÿ ïîëíîãî ðàñùåïëåíèÿ. Ïðîäîëæèòåëü- íîñòü ðàñùåïëåíèÿ âàðüèðóåòñÿ îò 2 ÷ äî 30 ÷. Ðåàêöèÿ ïðåêðàùàåòñÿ ëèáî ïðèáàâëåíèåì êè- ñëîòû, êîòîðàÿ íå îêàçûâàåò âëèÿíèÿ íà ïîëó- ÷åííóþ ïåïòèäíóþ êàðòó, ëèáî çàìîðàæèâà- íèåì. Êîëè÷åñòâî èñïîëüçóåìîãî ðàñùåïëÿþùåãî ðåàãåíòà. Äëÿ îáåñïå÷åíèÿ äîñòàòî÷íîãî áûñò- ðîãî ðàñùåïëåíèÿ (îò 6 ÷ äî 20 ÷) èñïîëüçóåòñÿ èçáûòî÷íîå êîëè÷åñòâî ðàñùåïëÿþùåãî ðåàãåí- òà; òåì íå ìåíåå, åãî êîëè÷åñòâî äîëæíî áûòü ìèíèìèçèðîâàíî, ÷òîáû ïðåäîòâðàòèòü âêëàä ðåàãåíòà â ñòðóêòóðó ïåïòèäíîé êàðòû. Îáû÷íî àíàëèçèðóåìûé ïðîòåèí è ðåàãåíò áåðóò â ñîîò- íîøåíèè 20:1 èëè 200:1. Äëÿ îïòèìèçàöèè ïðî- öåäóðû ðàñùåïëåíèÿ ðåêîìåíäóåòñÿ äîáàâëÿòü ðàñùåïëÿþùèé àãåíò â äâà èëè áîëåå ýòàïîâ. Ïðè ýòîì êîíå÷íûé îáúåì ðåàãèðóþùåé ñìåñè äîëæåí îñòàâàòüñÿ äîñòàòî÷íî íåáîëüøèì äëÿ 121 îáåñïå÷åíèÿ ñëåäóþùåãî ýòàïà ïåïòèäíîãî êàð- òèðîâàíèÿ — ðàçäåëåíèÿ. Äëÿ òîãî, ÷òîáû èñ- êëþ÷èòü âîçìîæíîå âëèÿíèå èñêàæàþùèõ ïðî- äóêòîâ ðàñùåïëåíèÿ (àðòåôàêòîâ) íà ðåçóëüòàòû ïîñëåäóþùåãî àíàëèçà, ïðîâîäèòñÿ êîíòðîëü- íîå îïðåäåëåíèå ñî âñåìè ðåàãåíòàìè çà èñêëþ- ÷åíèåì àíàëèçèðóåìîãî áåëêà. ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈ×ÅÑÊÎÅ ÐÀÇÄÅËÅÍÈÅ Äëÿ êàðòèðîâàíèÿ èñïîëüçóþò ðàçëè÷íûå ìåòîäû ðàçäåëåíèÿ áåëêîâ. Âûáîð ìåòîäà çàâè- ñèò îò áåëêà, äëÿ êîòîðîãî ñîñòàâëÿåòñÿ ïåïòèä- íàÿ êàðòà.  òàáëèöå 2.1.2.39.-2 ïåðå÷èñëåíû ìåòîäû, óñïåøíî èñïîëüçóåìûåäëÿ ðàçäåëåíèÿ ïåïòèäîâ.
 äàííîì ðàçäåëå ïðèâåäåíî îïèñà- íèå ìåòîäà îáðàùåííî-ôàçîâîé âûñîêîýôôåê- òèâíîé æèäêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè (ÂÝÆÕ), îäíîãî èç íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåìûõ ìåòî- äîâ õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ. Êðèòè÷åñêèìè ôàêòîðàìè ïðè ÂÝÆÕ ðàçäå- ëåíèè ÿâëÿþòñÿ ÷èñòîòà ðàñòâîðèòåëåé è ïîä- âèæíîé ôàçû. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ îáðàùåííî-ôàçî- âîé ÂÝÆÕ ðåêîìåíäóåòñÿ èñïîëüçîâàíèå ðàñ- òâîðèòåëåé è âîäû ñòåïåíè ÷èñòîòû «äëÿ ÂÝÆÕ». Ðàñòâîðåííûå ãàçû ÿâëÿþòñÿ ïðîáëå- ìîé äëÿ ãðàäèåíòíûõ ñèñòåì â òåõ ñëó÷àÿõ, êî- ãäà ðàñòâîðèìîñòü ãàçà â ðàñòâîðèòåëå ìîæåò áûòü ìåíüøå â ñìåñè, ÷åì â ñàìîì ðàñòâîðèòå- ëå.  êà÷åñòâå ýôôåêòèâíîãî ñïîñîáà äåãàçàöèè ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà âàêóóìíàÿ äåãàçàöèÿ è âîçäåéñòâèå óëüòðàçâóêîì.  ñëó÷àå åñëè òâåð- äûå ÷àñòèöû â ðàñòâîðèòåëå ïîïàäóò â õðîìàòî- ãðàôè÷åñêóþ ñèñòåìó, îíè ìîãóò íàðóøèòü ãåð- ìåòè÷íîñòü êëàïàíîâ íàñîñà èëè çàñîðèòü âåðõ- íþþ ÷àñòü õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêè.  ñâÿçè ñ ýòèì ðåêîìåíäóåòñÿ ïðîâåäåíèå ôèëüò- ðàöèè äî è ïîñëå íàñîñà. Õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ êîëîíêà. Äëÿ êàæ- äîãî áåëêà âûáîð êîëîíêè îñóùåñòâëÿåòñÿ ýì- ïèðè÷åñêè. Êîëîíêè ñ ðàçìåðîì ïîð îò 10 íì äî 30 íì, çàïîëíåííûå ñîðáåíòîì íà îñíîâå ñèëè- êàãåëÿ, ìîãóò îáåñïå÷èòü îïòèìàëüíîå ðàçäåëå- íèå. Äëÿ íåáîëüøèõ ïåïòèäîâ íåïîäâèæíûå ôàçûñèëèêàãåëü îêòèëñèëèëüíûé äëÿ õðîìàòî- ãðàôèè Ð (3 – 10 ìêì) è ñèëèêàãåëü îêòàäåöèë- ñèëèëüíûé äëÿ õðîìàòîãðàôèè Ð (3 – 10 ìêì) â êà÷åñòâå íàïîëíèòåëåé êîëîíêè ÿâëÿþòñÿ áî- ëåå ýôôåêòèâíûìè, ÷åì ñèëèêàãåëü áóòèëñè- ëèëüíûé äëÿ õðîìàòîãðàôèè Ð (5 – 10 ìêì). Ðàñòâîðèòåëü. Íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóå- ìûì ðàñòâîðèòåëåì ÿâëÿåòñÿ âîäà ñ àöåòîíèò- ðèëîì â êà÷åñòâå îðãàíè÷åñêîãî ìîäèôèêàòîðà ñ äîáàâëåíèåì íå áîëåå 0,1 % òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû. Ïðè íåîáõîäèìîñòè, äëÿ ñîëþáèëèçà- öèè êîìïîíåíòîâ ãèäðîëèçàòà, äîáàâëÿþò ïðî- ïàíîë èëè 2-ïðîïàíîë, ïðè óñëîâèè, ÷òî èõ äî- áàâëåíèå íå ïðèâåäåò ê ÷ðåçìåðíîìó ïîâûøå- íèþ âÿçêîñòè êîìïîíåíòîâ. Ïîäâèæíàÿ ôàçà. Ïîäâèæíàÿ ôàçà, ñîäåð- æàùàÿ ôîñôàòíûé áóôåð, èñïîëüçóåòñÿ äëÿ îáåñïå÷åíèÿ âîçìîæíîñòè âûáîðà ðÍ, ïîñêîëü- êó èçìåíåíèå ðÍ â èíòåðâàëå îò 3,0 äî 5,0 óëó÷- øàåò ðàçäåëåíèå ïåïòèäîâ, ñîäåðæàùèõ êèñëîò- íûå îñòàòêè (íàïðèìåð, ãëóòàìèíîâàÿ è àñïàðà- ãèíîâàÿ êèñëîòû). Íàòðèÿ èëè êàëèÿ ôîñôàòû, àöåòàò àììîíèÿ, ôîñôîðíàÿ êèñëîòà ïðè çíà÷å- íèè ðÍ ìåæäó 2 è 7 (èëè âûøå ïðè èñïîëüçîâà- íèè ïîëèìåðíîãî íàïîëíèòåëÿ) èñïîëüçóþòñÿ ñ àöåòîíèòðèëüíûì ãðàäèåíòîì. Äîñòàòî÷íî ÷àñ- òî èñïîëüçóåòñÿ àöåòîíèòðèë ñ òðèôòîðóêñóñ- íîé êèñëîòîé. Ãðàäèåíò. Ãðàäèåíò ìîæåò áûòü ëèíåéíûì, íåëèíåéíûì èëè âêëþ÷àòü ñòóïåí÷àòîå èçìåíå- íèå ñîñòàâà. Äëÿ ðàçäåëåíèÿ ñëîæíûõ ñìåñåé ðåêîìåíäóåòñÿ ïîëîãèé ãðàäèåíò. Ãðàäèåíò îï- òèìèçèðóþò, äîáèâàÿñü ÷åòêîãî ðàçðåøåíèÿ ñ 1 èëè 2 ïèêîâ, êîòîðûå ñòàíîâÿòñÿ «ìàðêåðíû- ìè» ïèêàìè äëÿ èñïûòàíèÿ. Èçîêðàòè÷åñêîå ýëþèðîâàíèå. Èçîêðàòè- ÷åñêàÿ ÂÝÆÕ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïîäâèæíîé ôà- çîé ïîñòîÿííîãî ñîñòàâà èñïîëüçóåòñÿ ââèäó åå óäîáñòâà è óëó÷øåííîãî àíàëèòè÷åñêîãî ñèãíà- ëàäåòåêòîðà.  ðÿäå ñëó÷àåâ ñëîæíî ïîäîáðàòü îïòèìàëüíûé ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû, ïîçâî- ëÿþùèé äîáèòüñÿ õîðîøåãî ðàçðåøåíèÿ äëÿ êà- æäîãî ïèêà. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ èçîêðàòè÷åñêîé ÂÝÆÕ íå äîëæíû èñïîëüçîâàòüñÿ ïîäâèæíûå 122 Òàáëèöà 2.1.2.39. -2.
— Ìåòîäû, èñïîëüçóåìûå äëÿ ðàçäåëåíèÿïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ Îáðàùåííî-ôàçîâàÿ âûñîêîýôôåêòèâíàÿ æèäêîñòíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ Èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ Õðîìàòîãðàôèÿ ãèäðîôîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ Ýëåêòðîôîðåç â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå, íåäåíàòóðèðóþùèé Ýëåêòðîôîðåç â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå ñ íàòðèÿ äîäåöèëñóëüôàòîì Êàïèëëÿðíûé ýëåêòðîôîðåç Áóìàæíàÿ ýëåêòðî-õðîìàòîãðàôèÿ Âûñîêîâîëüòíûé ýëåêòðîôîðåç íà áóìàãå ôàçû, äëÿ êîòîðûõ íåçíà÷èòåëüíîå èçìåíåíèå â ñîîòíîøåíèè êîìïîíåíòîâ èëè âçíà÷åíèè ðÍ ñóùåñòâåííî âëèÿåò íà âðåìÿ óäåðæèâàíèÿ ïè- êîâ íà ïåïòèäíîé êàðòå. Äðóãèå ïàðàìåòðû. Äëÿ äîñòèæåíèÿ õîðî- øåé âîñïðîèçâîäèìîñòè, êàê ïðàâèëî, òðåáóåò- ñÿ êîíòðîëü òåìïåðàòóðû êîëîíêè. Ñêîðîñòü ïîäâèæíîé ôàçû âàðüèðóåòñÿ îò 0,1 ìë/ìèí äî 2,0 ìë/ìèí, äåòåêòèðîâàíèå ïåïòèäîâ îñóùåñò- âëÿåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì äåòåêòîðîì ïðè äëèíå âîëíû îò 200 íì äî 230 íì. Èñïîëü- çóþòñÿ è äðóãèå ìåòîäû äåòåêòèðîâàíèÿ (íà- ïðèìåð, ïîñòêîëîíî÷íàÿ äåðèâàòèçàöèÿ), íî îíè íå ñòîëü íàäåæíû è óíèâåðñàëüíû, êàê äåòåêòè- ðîâàíèå â óëüòðàôèîëåòîâîé îáëàñòè. Âàëèäàöèÿ.  äàííîì ðàçäåëå ïðèâîäÿòñÿ ýêñïåðèìåíòàëüíûå ñðåäñòâà äëÿ îöåíêè îáùèõ õàðàêòåðèñòèê èñïîëüçóåìîãî ìåòîäà. Êðèòåðèè îöåíêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû çàâèñÿò îò îïðåäå- ëåíèÿ êðèòè÷åñêèõ ïàðàìåòðîâ èñïûòàíèÿ, âëèÿþùèõ íà èíòåðïðåòàöèþ äàííûõ è èõ ïðè- åìëåìîñòü. Êðèòè÷åñêèå ïàðàìåòðû ÿâëÿþòñÿ òàêæå êðèòåðèÿìè, ïî êîòîðûì ïðîèçâîäèòñÿ êîíòðîëü ðàñùåïëåíèÿ è àíàëèçà ïåïòèäîâ. Äëÿ êîíòðîëÿ ïîëíîòû òðåáóåìîãî ðàñùåïëåíèÿ èñ- ïîëüçóåòñÿ ñðàâíåíèå ñî ñòàíäàðòíûì îáðàç- öîì, êîòîðûé áûë ïîäâåðãíóò òàêîìó æå âîçäåé- ñòâèþ, êàê è èñïûòóåìûé áåëîê. Èñïîëüçîâàíèå ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà ïàðàëëåëüíî ñ èñïûòóå- ìûì áåëêîì ÿâëÿåòñÿ êðèòè÷åñêèì ïðèðàçðà- áîòêåè óñòàíîâëåíèèçíà÷åíèé êðèòåðèåâ îöåí- êè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû. Êðîìå ýòîãî, ñ öåëüþ äîïîëíèòåëüíîãî ñðàâíåíèÿ âêëþ÷àåòñÿ îáðà- çåö õðîìàòîãðàììû ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà. Äðó- ãèå ïîêàçàòåëè ìîãóò âêëþ÷àòü âèçóàëüíûé êîí- òðîëü ðàñòâîðèìîñòè áåëêà èëè ïåïòèäîâ, îò- ñóòñòâèå èíòàêòíîãî áåëêà, èçìåðåíèå îòêëèêîâ òðóäíî ðàñùåïëÿåìûõ ïåïòèäîâ. Êðèòè÷åñêèå ïàðàìåòðû îöåíêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû äëÿ ïåïòèäíîãî àíàëèçà áóäóò çàâèñåòü îò êîíêðåò- íîãî èñïîëüçóåìîãî ìåòîäà ðàçäåëåíèÿ è äåòåê- òèðîâàíèÿ, à òàêæå òðåáîâàíèé ê ïîëó÷àåìûì â ðåçóëüòàòå àíàëèçà äàííûì.  ñëó÷àå, êîãäà ïåïòèäíîå êàðòèðîâàíèå èñ- ïîëüçóåòñÿ â êà÷åñòâå èñïûòàíèÿ ïî èäåíòèôè- êàöèè, òðåáîâàíèÿ ê ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû äëÿ èäåíòèôèöèðóåìûõ ïåïòèäîâ âêëþ÷àþò èçáè- ðàòåëüíîñòü è âîñïðîèçâîäèìîñòü.  ýòîì ñëó- ÷àå, êàê è â ñëó÷àå èäåíòèôèêàöèè îòëè÷àþ- ùèõñÿ ïî ñîñòàâó áåëêîâ, îïðåäåëåíèå ïåðâè÷- íîé ñòðóêòóðû ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ ïðè êàðòèðîâàíèè îáåñïå÷èâàåò êàê âåðèôèêàöèþ èçâåñòíîé ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû, òàê è èäåíòè- ôèêàöèþ ñòðóêòóðû îòëè÷àþùèõñÿ áåëêîâ ïó- òåì ñðàâíåíèÿ ñ ïåïòèäíîé êàðòîé ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà äëÿ áåëêà óñòàíîâëåííîé ñòðóêòóðû. Èñïîëüçîâàíèå ïîäâåðãíóòîãî ðàñùåïëåíèþ ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà ïðè îïðåäåëåíèè ðàçäåëå- íèÿ ïåïòèäîâ è àìèíîêèñëîò ÿâëÿåòñÿ ðåôå- ðåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ àíàëèçà îòëè÷àþùèõñÿ ïî ñîñòàâó áåëêîâ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà îõàðàêòåðèçîâàííàÿ ïî ñîñòàâó ñìåñü îòëè÷àþ- ùåãîñÿ áåëêà è ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà, â îñîáåí- íîñòè åñëè îòëè÷íûå ïî ñîñòàâó áåëêè íàõîäÿò- ñÿ â çîíå õóäøåãî ðàçðåøåíèÿ íà ïåïòèäíîé êàðòå. Êðèòåðèåì âûáîðà ñèñòåìû îïðåäåëåíèÿ ñòðóêòóðû áåëêà ìîæåò ÿâëÿòüñÿ ÷èñëî îñíîâ- íûõ îïðåäåëÿåìûõ ïåïòèäîâ. Êðèòåðèè âûáîðà ñèñòåìû äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñòðóêòóðû áåëêà ëó÷- øèì îáðàçîì îïðåäåëÿþòñÿ ðàçðåøåíèåì ïèêîâ ïåïòèäîâ.
Õðîìàòîãðàôè÷åñêèå ïàðàìåòðû, òà- êèå êàê ðàçðåøåíèå ìåæäó ïèêàìè, øèðèíà ïèêà ó îñíîâàíèÿ, ïëîùàäü ïèêà, ñòåïåíü ðàç- ìûâàíèÿ çàäíåãî ôðîíòà ïèêà è ýôôåêòèâíîñòü êîëîíêè, ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äëÿ îïðåäå- ëåíèÿ ðàçðåøåíèÿ ïåïòèäîâ.  çàâèñèìîñòè îò èñïûòóåìîãî áåëêà è èñïîëüçóåìîãî ìåòîäà ðàç- äåëåíèÿ ìîãóò óñòàíàâëèâàòüñÿ òðåáîâàíèÿ ê ðàçðåøåíèþ îäíîãî èëè íåñêîëüêèõ ïåïòèäîâ. Ïîâòîðíûé àíàëèç ïðîäóêòîâ ðàñùåïëåíèÿ ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà äëÿ èñïûòóåìîãî áåëêà ïîçâîëÿåò óñòàíîâèòü êîëè÷åñòâåííûå õàðàêòå- ðèñòèêè ïðåöèçèîííîñòè è îòêðûâàåìîñòè. Îò- êðûâàåìîñòü îïðåäåëÿåìûõ ïåïòèäîâ â öåëîì óñòàíàâëèâàåòñÿ ïðè ïîìîùè âíóòðåííèõ è âíåøíèõ ïåïòèäíûõ ñòàíäàðòîâ. Ïðåöèçèîí- íîñòü âûðàæàåòñÿ êàê îòíîñèòåëüíîå ñòàíäàðò- íîå îòêëîíåíèå. Ñëåäóåò îæèäàòü ðàçëè÷èé â èçâëå÷åíèè è âîñïðîèçâîäèìîñòè èäåíòèôèöè- ðóåìîãî ïðîòåèíà; ñëåäîâàòåëüíî, êðèòåðèè äî- ïóñêà äëÿ îöåíêè ïðèãîäíîñòè ñèñòåìû äîëæíû áûòü óñòàíîâëåíû êàê äëÿ èçâëå÷åíèÿ, òàê è äëÿ âîñïðîèçâîäèìîñòè èäåíòèôèöèðóåìûõ ïåïòè- äîâ. Óñòàíîâëåííûå êðèòåðèè äîïóñêà ÿâëÿþòñÿ ñïåöèôè÷åñêèìè äëÿ äàííîãî ïðîòåèíà è óêàçû- âàþòñÿ â ÷àñòíîé ôàðìàêîïåéíîé ñòàòüå. Âèçóàëüíîå ñðàâíåíèå îòíîñèòåëüíûõ âðå- ìåí óäåðæèâàíèÿ, ïàðàìåòðîâ ïèêîâ (ïëîùàäè ïèêà èëè âûñîòû ïèêà), ÷èñëà ïèêîâ è â öåëîì ìåòîäà ýëþèðîâàíèÿ ïðîèçâîäèòñÿ èçíà÷àëüíî. Îíî äîïîëíÿåòñÿ è ïîäòâåðæäàåòñÿ ìàòåìàòè- ÷åñêèì àíàëèçîì ñîîòíîøåíèé àíàëèçèðóåìûõ ïàðàìåòðîâ ïèêîâ è õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ïðî- ôèëÿ ñìåñè 1:1 (îá/îá) ïðîäóêòîâ ðàñùåïëåíèÿ 123 èñïûòóåìîãî îáðàçöà è îáðàçöà ñðàâíåíèÿ. Èäåíòè÷íîñòü àíàëèçèðóåìîãî îáðàçöà ïîä- òâåðæäàåòñÿ, åñëè âñå ïèêè ïðîäóêòîâ ðàñùåï- ëåíèÿ àíàëèçèðóåìîãî áåëêà è ñòàíäàðòíîãî îá- ðàçöà èìåþò àíàëîãè÷íûå âðåìåíà óäåðæèâà- íèÿ è ñîîòíîøåíèÿ îöåíèâàåìûõ ïàðàìåòðîâ ïèêîâ. Åñëè ïèêè, êîòîðûå èçíà÷àëüíî õàðàêòåðè- çîâàëèñü çíà÷èòåëüíî ðàçëè÷àþùèìèñÿ îòíîñè- òåëüíûìè âðåìåíàìè óäåðæèâàíèÿ, çàòåì â ñìå- ñè 1:1 îáíàðóæèâàëèñü åäèíûì ïèêîì, èçíà- ÷àëüíî âûÿâëåííîå ðàçëè÷èå ÿâëÿåòñÿ ïîêàçàòåëåì íåñòàáèëüíîñòè ñèñòåìû. Îäíàêî åñëè â ñìåñè 1:1 íàáëþäàþòñÿ ðàçäåëåííûå ïèêè, ýòî ÿâëÿåòñÿ äîêàçàòåëüñòâîì íàëè÷èÿ ðàçëè÷íûõ ïåïòèäîâ â êàæäîì èç ïèêîâ. Åñëè ïèê â ñìåñè 1:1 ñóùåñòâåííî øèðå, ÷åì ñîîò- âåòñòâóþùèé ïèê â àíàëèçèðóåìîì áåëêå è ñòàíäàðòíîì îáðàçöå, ýòî ìîæåò îçíà÷àòü íàëè- ÷èå ðàçëè÷íûõ ïåïòèäîâ. Áûëî ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàíèå êîìïüþòåðíîé ïðîãðàììû ðàñ- ïîçíàâàíèÿ äëÿ àíàëèçà äàííûõ ïåïòèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ, îäíàêî àñïåêòû âàëèäàöèè êîì- ïüþòåðíîé ïðîãðàììû èñêëþ÷àþò åå èñïîëüçî- âàíèå â êà÷åñòâå ñïðàâî÷íîãî òåñòà â áëèæàé- øåì áóäóùåì. Èñïîëüçîâàëèñü òàêæå èíûå àâ- òîìàòèçèðîâàííûå ïîäõîäû ñ èñïîëüçîâàíèåì ìàòåìàòè÷åñêèõ ôîðìóë, ìîäåëåé è ñèñòåì ðàñ- ïîçíàâàíèÿ. Îäíèì èç òàêèõ ïîäõîäîâ, íàïðè- ìåð, ÿâëÿåòñÿ àâòîìàòè÷åñêîå îïðåäåëåíèå ñî- åäèíåíèé ìåòîäîì ÈÊ-ñïåêòðîñêîïèè è ïðèìå- íåíèå äèîäíî-ìàòðè÷íîãî ÓÔ-ñïåêòðàëüíîãî àíàëèçà äëÿ èäåíòèôèêàöèè ïåïòèäîâ. Äàííûå ìåòîäû èìåþò îãðàíè÷åíèÿ, îáóñëîâëåííûå íå- äîñòàòî÷íûì ðàçðåøåíèåì, îäíîâðåìåííûì ýëþèðîâàíèåì ôðàãìåíòîâ, ðàçëè÷èÿìè â àáñî- ëþòíûõ çíà÷åíèÿõ ïàðàìåòðîâ ïèêîâ ìåæäó ïðîäóêòàìè ðàñùåïëåíèÿ àíàëèçèðóåìîãî è ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ. Ìîæíî ïðîèçâåñòè ìíîæåñòâåííîå ñðàâíå- íèå âðåìåí óäåðæèâàíèÿ è ïëîùàäåé èëè âûñî- òû ïèêîâ äëÿ âûáðàííîé ãðóïïû ñîîòâåòñòâóþ- ùèõ ïèêîâ, êîòîðûå ïðàâèëüíî èäåíòèôèöèðó- þòñÿ íà ïåïòèäíîé êàðòå. Ïëîùàäè ïèêîâ ìîãóò áûòü ðàññ÷èòàíû ñ èñïîëüçîâàíèåì îäíîãî ïèêà, äåìîíñòðèðóþùåãî îòíîñèòåëüíî íåáîëü- øóþ âàðèàáåëüíîñòü â êà÷åñòâå âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà, ñ ó÷åòîì òîãî, ÷òî èíòåãðèðîâàíèå ïëîùàäè ïèêà ÿâëÿåòñÿ ÷óâñòâèòåëüíûì ê áàçî- âîé âàðèàáåëüíîñòè è ìîæåò ñëóæèòü ïðè÷èíîé îøèáêè àíàëèçà.
Êàê àëüòåðíàòèâíûé âàðèàíò äëÿ èñïûòóåìîãî îáðàçöà ìîæåò áûòü ðàññ÷èòàí ïðîöåíò âûñîòû ïèêà êàæäîãî ïåïòèäà îòíîñè- òåëüíî ñóììû âûñîòû âñåõ ïèêîâ. Çàòåì ïîëó- ÷åííûé ïðîöåíò ñðàâíèâàåòñÿ ñî çíà÷åíèåì àíàëîãè÷íîãî ïàðàìåòðà ñîîòâåòñòâóþùåãî ïèêà ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà. Âîçìîæíîñòü àâòî- ãèäðîëèçà òðèïñèíà êîíòðîëèðóåòñÿ ïðè ïîìî- ùè ñîçäàíèÿ ïåïòèäíîé êàðòû-ïëàöåáî, ïîëó- ÷àåìîé ïðè îáðàáîòêå òðèïñèíîì ðàñòâîðà áåç îïðåäåëÿåìîãî áåëêà. Ìèíèìàëüíûì òðåáîâàíèåì äëÿ îöåíêè êà- ÷åñòâà ïåïòèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ ÿâëÿåòñÿ ïðè- íÿòàÿ ïðîöåäóðà òåñòèðîâàíèÿ, êîòîðàÿ âêëþ÷à- åò ïðèãîäíîñòü ñèñòåìû â êà÷åñòâå êîíòðîëÿ.  öåëîì íà íà÷àëüíîì ýòàïå ðåãóëÿòîðíîãî ïðî- öåññà êà÷åñòâåííûé àíàëèç ïåïòèäíîé êàðòû àíàëèçèðóåìîãî áåëêà ÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íûì. Ñ óñîâåðøåíñòâîâàíèåì ïðîöåññà ðåãóëÿòîðíîãî îäîáðåíèÿ áåëêîâ äîïîëíèòåëüíûå èñïûòàíèÿ ïî îöåíêå êà÷åñòâà ìîãóò âêëþ÷àòü ÷àñòè÷íóþ âàëèäàöèþ àíàëèòè÷åñêîé ïðîöåäóðû äëÿ îáåñ- ïå÷åíèÿ ãàðàíòèè òîãî, ÷òî ìåòîä áóäåò ïðîèçâå- äåí â ñîîòâåòñòâèè ñ çàïëàíèðîâàííûì ïðè ðàç- ðàáîòêå ïåïòèäíîé êàðòû îïðåäåëÿåìîãî áåëêà. ÀÍÀËÈÇ È ÈÄÅÍÒÈÔÈÊÀÖÈß ÏÅÏÒÈÄΠ äàííîì ðàçäåëå ïðèâåäåíî ðóêîâîäñòâî ïî èñïîëüçîâàíèþ ïåïòèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ ïðè ðàçðàáîòêå ÷àñòíûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòåé è íîðìàòèâíûõ äîêóìåíòîâ ïî êà÷åñòâó ïðè ðå- ãèñòðàöèè ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ. Èñïîëüçîâàíèå ïåïòèäíîé êàðòû êàê èíñò- ðóìåíòà êà÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ íå òðåáóåò ïîëíîé õàðàêòåðèñòèêè èíäèâèäóàëüíûõ ïåï- òèäíûõ ïèêîâ. Îäíàêî âàëèäàöèÿ ìåòîäèêè ïåï- òèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ ïðè ðàçðàáîòêå ÷àñòíûõ ôàðìàêîïåéíûõ ñòàòåé è íîðìàòèâíûõ äîêó- ìåíòîâ ïî êà÷åñòâó òðåáóåò òî÷íîé õàðàêòåðè- ñòèêè êàæäîãî èç èíäèâèäóàëüíûõ ïèêîâ ïåï- òèäíîé êàðòû. Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè èíäèâèäó- àëüíûõ ïèêîâ ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êàê ìåòîä N-êîíöåâîãî ñåêâåíèðîâàíèÿ ñ ïîñëåäóþ- ùèì àíàëèçîì àìèíîêèñëîò, òàê è ìåòîä ñ èñ- ïîëüçîâàíèåì ìàññ-ñïåêòðîñêîïèè. Äëÿ ñîñòàâëåíèÿ õàðàêòåðèñòèêè ïèêîâ ñ èñ- ïîëüçîâàíèåì N-êîíöåâîãî ñåêâåíèðîâàíèÿè àìèíîêèñëîòíîãî àíàëèçà ïðîâîäÿò ìàñøòàáè- ðîâàíèå ñòàäèè àíàëèòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ. Íå- îáõîäèìî óáåäèòüñÿ íà îñíîâàíèè ýìïèðè÷å- ñêèõ äàííûõ, ÷òî óõóäøåíèÿ ðàçðåøåíèÿ ìåæäó ïèêàìè âñëåäñòâèå ïðîâåäåíèÿ ìàñøòàáèðîâà- íèÿ íå ïðîèñõîäèò. Ýëþàòû, ñîîòâåòñòâóþùèå 124 ñïåöèôè÷åñêèì ïåïòèäíûì ïèêàì, ñîáèðàþò, êîíöåíòðèðóþò â âàêóóìå è, ïðè íåîáõîäèìî- ñòè, ïîâòîðíî õðîìàòîãðàôèðóþò. Àìèíîêèñ- ëîòíûé àíàëèç ôðàãìåíòîâ ìîæåò áûòü îãðàíè- ÷åí ðàçìåðîì ïåïòèäîâ.  ñëó÷àå åñëè N-êîíöå- âàÿ àìèíîêèñëîòà çàáëîêèðîâàíà, ìîæåò ïîòðåáîâàòüñÿ åå âûñâîáîæäåíèå äî ñåêâåíèðî- âàíèÿ. Ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ õàðàêòåðèñòèêè ìî- æåò òàêæå èñïîëüçîâàòüñÿ Ñ-êîíöåâîå ñåêâåíè- ðîâàíèå áåëêîâ â êîìáèíàöèè ñ êàðáîêñèïåïòè- äàçîé è ìåòîäîì ìàòðè÷íî-àêòèâèðîâàííîé ëàçåðíîé äåñîðáöèè/èîíèçàöèè ñ âðåìÿïðîëåò- íûì ìàññ-àíàëèçàòîðîì. Èñïîëüçîâàíèå ìàññ-ñïåêòðîñêîïèè äëÿ õà- ðàêòåðèñòèêè ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ ïðîèçâî- äèòñÿ ëèáî ïóòåì íåïîñðåäñòâåííîãî ââåäåíèÿ âûäåëåííûõ ïåïòèäîâ, ëèáî ñ èñïîëüçîâàíèåì on-line ñèñòåìû ÂÝÆÕ ñ ìàññ-ñïåêòðîìåòðîì äëÿ ñòðóêòóðíîãî àíàëèçà.  öåëîì îí âêëþ÷àåò ýëåêòðîðàñïûëåíèå è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèþ ìåòîäîì ìàòðè÷íî-àêòèâèðîâàííîé ëàçåðíîé äåñîðáöèè/èîíèçàöèè ñ âðåìÿ ïðîëåòíûì ìàññ-àíàëèçàòîðîì, à òàêæå áîìáàðäèðîâêó áû- ñòðûìè àòîìàìè. Òàíäåìíàÿ ìàññ-ñïåêòðîñêî- ïèÿ òàêæå èñïîëüçóåòñÿ äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîñëå- äîâàòåëüíîñòè ìîäèôèöèðîâàííûõ áåëêîâ è òèïà ïðîèçîøåäøåé àìèíîêèñëîòíîé ìîäèôè- êàöèè. Ñðàâíåíèå ìàññ-ñïåêòðîâ ïðîäóêòîâ ãèäðîëèçà äî è ïîñëå âîññòàíîâëåíèÿ îáåñïå÷è- âàåòîïðåäåëåíèå ðàñïîëîæåíèÿ äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé â ðàçëè÷íûõ ñóëüôãèäðèëñîäåðæàùèõ ïåïòèäàõ.
Åñëè íåêîòîðûå ÷àñòè ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû íå ìîãóò áûòü äîñòàòî÷íî ÷åòêî îòðàæåíû ïåïòèäíîé êàðòîé, ìîæåò ïîòðåáîâàòüñÿ ñîñòàâ- ëåíèå âòîðè÷íîé ïåïòèäíîé êàðòû. Öåëüþ âàëè- äèðîâàííîé ìåòîäèêè äëÿõàðàêòåðèñòèêè áåë- êàïîñðåäñòâîìïåïòèäíîãî êàðòèðîâàíèÿ ÿâëÿ- åòñÿ îïðåäåëåíèå êàê ìèíèìóì 95 % òåîðåòè÷å- ñêîãî ñîñòàâà ñòðóêòóðû áåëêà. 201020040-2019 2.1.2.40. Àìèíîêèñëîòíûé àíàëèç Àìèíîêèñëîòíûé àíàëèçîòíîñèòñÿ ê ìåòî- äîëîãèè, èñïîëüçóåìîé äëÿ îïðåäåëåíèÿ àìèíî- êèñëîòíîãî ñîñòàâà èëè êîëè÷åñòâåííîãî ñîäåð- æàíèÿ àìèíîêèñëîò â áåëêàõ, ïåïòèäàõ è ëåêàð- ñòâåííûõ ïðåïàðàòàõ. Áåëêè è ïåïòèäû ïðåä- ñòàâëÿþò ñîáîé ìàêðîìîëåêóëû, ñîñòîÿùèå èç êîâàëåíòíî ñâÿçàííûõ îñòàòêîâ àìèíîêèñëîò, êîòîðûå îáðàçóþò ëèíåéíûå ïîëèìåðû. Ïîñëå- äîâàòåëüíîñòü àìèíîêèñëîò â áåëêàõ èëè ïåïòè- äàõ îïðåäåëÿåò ñâîéñòâà ìîëåêóëû. Áåëêè ïðåä- ñòàâëÿþò ñîáîé êðóïíûå ìîëåêóëû, êîòîðûå îáû÷íî ñóùåñòâóþò â âèäå ñëîæíûõ ñòðóêòóð ñî ñïåöèôè÷åñêîé êîíôîðìàöèåé, â òî âðåìÿ êàê ïåïòèäû èìåþò ìåíüøèé ðàçìåð è ìîãóò ñî- ñòîÿòü òîëüêî èç íåñêîëüêèõ àìèíîêèñëîò. Àìè- íîêèñëîòíûé àíàëèç ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ áåëêîâ è ïåï- òèäîâ, èäåíòèôèêàöèè áåëêîâ èëè ïåïòèäîâ íà îñíîâå èõ àìèíîêèñëîòíîãî ñîñòàâà, ñòðóêòóð- íîãî àíàëèçà áåëêîâ è ïåïòèäîâ, îöåíêè ñòðàòå- ãèé ôðàãìåíòàöèè äëÿ êàðòèðîâàíèÿ ïåïòèäíûõ îñòàòêîâ è îáíàðóæåíèÿ àòèïè÷íûõ àìèíîêèñ- ëîò, êîòîðûå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü â áåëêàõ èëè ïåïòèäàõ. Ïåðåä àìèíîêèñëîòíûì àíàëèçîì íå- îáõîäèìî ãèäðîëèçîâàòü áåëêè/ïåïòèäû äî ïî- ëó÷åíèÿ îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîòíûõ ñîñòàâ- ëÿþùèõ. Ïîñëå ãèäðîëèçà áåëêîâ/ïåïòèäîâ ïðîöåññ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà ìîæåò áûòü òàêèì æå, êàê è äëÿ ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò â äðóãèõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâàõ. Àìèíîêèñ- ëîòíûå ñîñòàâëÿþùèå èñïûòóåìîãî îáðàçöà ïå- ðåä àíàëèçîì îáû÷íî ïîäâåðãàþòñÿ õèìè÷åñêîé ìîäèôèêàöèè (èëè äåðèâàòèçàöèè). ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈÅ Ìåòîäû, èñïîëüçóåìûå äëÿ àìèíîêèñëîòíî- ãîàíàëèçà, îáû÷íî îñíîâàíû íà õðîìàòîãðàôè- ÷åñêîì ðàçäåëåíèè àìèíîêèñëîò, ïðèñóòñòâóþ- ùèõ â èñïûòóåìîì îáðàçöå. Ñîâðåìåííûå ìåòî- äèêè àíàëèçà îñíîâàíû íà èñïîëüçîâàíèè àâòî- ìàòèçèðîâàííûõ õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ïðèáî- ðîâ äëÿ ðåøåíèÿ àíàëèòè÷åñêèõ çàäà÷.  êà÷å- ñòâå ïðèáîðà äëÿ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà îáû÷íî èñïîëüçóþò æèäêîñòíûé õðîìàòîãðàô íèçêîãî èëè âûñîêîãî äàâëåíèÿ, ñïîñîáíûé ñîç- äàâàòü ãðàäèåíòíîå ýëþèðîâàíèå ïîäâèæíîé ôàçîé, ÷òî îáåñïå÷èâàåò ðàçäåëåíèå àíàëèçè- ðóåìûõ àìèíîêèñëîò íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêå. Åñëè àíàëèç îáðàçöà íå îñóùåñòâëÿåò- ñÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðåäêîëîíî÷íîé äåðèâàòè- çàöèè, ïðèáîð äîëæåí èìåòü óñòðîéñòâî äëÿ ïîñòêîëîíî÷íîéäåðèâàòèçàöèè.  êà÷åñòâå äå- òåêòîðà îáû÷íî èñïîëüçóåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåò- ðè÷åñêèé äåòåêòîð â óëüòðàôèîëåòîâîé/âèäè- ìîé îáëàñòè èëè ôëóîðåñöåíòíûé äåòåêòîð â çàâèñèìîñòè îò èñïîëüçóåìîãî ìåòîäà äåðèâà- òèçàöèè. Ðåãèñòðèðóþùåå óñòðîéñòâî (íàïðè- ìåð, èíòåãðàòîð) èñïîëüçóåòñÿ äëÿ ïðåîáðàçîâà- 125 íèÿ àíàëîãîâîãî ñèãíàëà èç äåòåêòîðà è äëÿ ïðî- âåäåíèÿ êîëè÷åñòâåííûõ âû÷èñëåíèé. Ïðåäïî÷- òèòåëüíî, ÷òîáû ïðèáîð èñïîëüçîâàëñÿ èñêëþ- ÷èòåëüíî äëÿ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà. ÎÁÙÈÅ ÌÅÐÛ ÏÐÅÄÎÑÒÎÐÎÆÍÎÑÒÈ Ïðè âûïîëíåíèè àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà àíàëèòèê âñåãäà äîëæåí ó÷èòûâàòü âîçìîæ- íîñòü ôîíîâîãî çàãðÿçíåíèÿ. Íåîáõîäèìà âûñî- êàÿ ñòåïåíü ÷èñòîòû ðåàêòèâîâ (íàïðèìåð, íèç- êàÿ ÷èñòîòà õëîðîâîäîðîäíîéêèñëîòû ìîæåò ñïîñîáñòâîâàòü çàãðÿçíåíèþ ãëèöèíà). Àíàëè- òè÷åñêèå ðåàêòèâû äîëæíû ìåíÿòüñÿ ðåãóëÿðíî êàæäûå íåñêîëüêî íåäåëü, ïðè ýòîì äîëæíû èñ- ïîëüçîâàòüñÿ òîëüêî ðàñòâîðèòåëè êëàññà «äëÿ âûñîêîýôôåêòèâíîé æèäêîñòíîé õðîìàòîãðà- ôèè (ÂÝÆÕ)».
Âîçìîæíîå çàãðÿçíåíèå ìèêðî- îðãàíèçìàìè è ïîñòîðîííèìè ÷àñòèöàìè, êîòî- ðûå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü â ðàñòâîðèòåëÿõ, óñò- ðàíÿåòñÿ ïóòåì ôèëüòðîâàíèÿ ýòèõ ðàñòâîðèòå- ëåé ïåðåä ïðèìåíåíèåì, õðàíåíèåì ðàñòâîðèòå- ëåé â çàêðûòûõ åìêîñòÿõ è ðàçìåùåíèåì ïðèáî- ðà äëÿ àìèíîêèñëîòíîãî àíàëèçà â çàùèùåííîì îò ïðÿìîãî ñîëíå÷íîãî ñâåòà ìåñòå. Êà÷åñòâî àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà îïðåäå- ëÿåòñÿ ëàáîðàòîðíîé ïðàêòèêîé. Ïðèáîðû ðàç- ìåùàþò â ìåñòàõ íàèìåíüøåãî ïåðåäâèæåíèÿ ïåðñîíàëà. Ëàáîðàòîðèþ ñîäåðæàò â ÷èñòîòå. Î÷èùàþò è êàëèáðóþò ïèïåòêè ñîãëàñíî ãðàôè- êó. Íàêîíå÷íèêè ïèïåòîê õðàíÿò â çàêðûòîé êî- ðîáêå; àíàëèòèêàì íå ïîçâîëÿåòñÿ òðîãàòü èõ íåçàùèùåííûìè ðóêàìè. Àíàëèòèê äîëæåí èñ- ïîëüçîâàòü íåîïóäðåííûå ëàòåêñíûå èëè àíàëî- ãè÷íûå ïåð÷àòêè. Îãðàíè÷èâàþò ÷èñëî îòêðû- âàíèéè çàêðûâàíèéôëàêîíàñ èñïûòóåìûì îá- ðàçöîì, òàê êàê ïûëü ìîæåò ïðèâîäèòü ê çàâûøåíèþ ðåçóëüòàòîâ ïî ñîäåðæàíèþ ãëèöè- íà, ñåðèíà è àëàíèíà. Äëÿ ïîëó÷åíèÿ óäîâëåòâîðèòåëüíûõ ðåçóëü- òàòîâ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà ïðèáîð íåîáõî- äèìî îáñëóæèâàòü íàäëåæàùèì îáðàçîì. Åñëè ïðèáîð èñïîëüçóåòñÿ ïî ñòàíäàðòíîé ïðîãðàì- ìå, îí äîëæåí åæåäíåâíî ïðîâåðÿòüñÿ íà îòñóò- ñòâèå ïðîòå÷êè, ñòàáèëüíóþ ðàáîòó äåòåêòîðà è ëàìï è ñïîñîáíîñòü êîëîíêè ïîääåðæèâàòü íå- îáõîäèìóþ ñòåïåíü ðàçäåëåíèÿ èíäèâèäóàëü- íûõ àìèíîêèñëîò. Ñîãëàñíî ãðàôèêó ïðîâîäÿò î÷èñòêó èëè çàìåíó âñåõ ôèëüòðîâ ïðèáîðà è äðóãîå òåõíè÷åñêîå îáñëóæèâàíèå. ÑÒÀÍÄÀÐÒÍÛÅ ÎÁÐÀÇÖÛ Íåîáõîäèìûå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû àìèíî- êèñëîò äëÿ ïðîâåäåíèÿ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëè- çà êîììåð÷åñêè äîñòóïíû è îáû÷íî ïðåäñòàâëÿ- þò ñîáîé âîäíûé ðàñòâîð ñìåñè àìèíîêèñëîò. Ïðè îïðåäåëåíèè àìèíîêèñëîòíîãî ñîñòàâà íà- ðÿäó ñ èñïûòóåìûì îáðàçöîì àíàëèçèðóþòñÿ ñòàíäàðòíûå îáðàçöû áåëêîâ èëè ïåïòèäîâ, êî- òîðûå èñïîëüçóþòñÿ â êà÷åñòâå êîíòðîëÿ äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ ïîëíîòû âñåãî ïðîöåññà. Äëÿ ýòîé öåëè â êà÷åñòâå ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà áåë- êà èñïîëüçóþò âûñîêîî÷èùåííûé áû÷èé ñûâî- ðîòî÷íûé àëüáóìèí. ÊÀËÈÁÐÎÂÊÀ ÏÐÈÁÎÐÀ Êàëèáðîâêà ïðèáîðà äëÿ àìèíîêèñëîòíîãî àíàëèçà îáû÷íî ñîñòîèò â îïðåäåëåíèè âåëè÷è- íû ñèãíàëà è ðàáî÷åãî äèàïàçîíà êîíöåíòðàöèé äëÿ êàæäîé àìèíîêèñëîòû ñ èñïîëüçîâàíèåì ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà, ñîäåðæàùåãî ñìåñü ðàç- íûõ êîíöåíòðàöèé àìèíîêèñëîò. Êîíöåíòðàöèÿ êàæäîé àìèíîêèñëîòû â ñòàíäàðòíîì îáðàçöå èçâåñòíà.  ïðîöåññå êàëèáðîâêèïðè âûïîëíå- íèè àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà ñòàíäàðòíûé îá- ðàçåö ðàçâîäÿò äî ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèé àíà- ëèçèðóåìîãî âåùåñòâà â ïðåäåëàõ ïðåäïîëàãàå- ìîéîáëàñòè ëèíåéíîñòè ñîãëàñíî èñïîëüçóåìîé àíàëèòè÷åñêîé ìåòîäèêå. Çàòåì àíàëèçèðóþò ðàñòâîðû ñ ðàçëè÷íûìè êîíöåíòðàöèÿìè àíàëè- çèðóåìîãî âåùåñòâà. Ïî îñè îðäèíàò íàíîñÿò ïëîùàäè ïèêîâ êàæäîé àìèíîêèñëîòû, à ïî îñè àáñöèññ — ñîîòâåòñòâóþùèå èçâåñòíûå êîíöåí- òðàöèè êàæäîé àìèíîêèñëîòû ñ ó÷åòîì ðàçâåäå- íèé. Ýòè ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò îïðåäåëèòü îá- ëàñòü êîíöåíòðàöèé àìèíîêèñëîò, â êîòîðîé çà- âèñèìîñòü ïëîùàäè ïèêà äàííîé àìèíîêèñëîòû îò åå êîíöåíòðàöèè ÿâëÿåòñÿ ëèíåéíîé ôóíêöè- åé. Âàæíî, ÷òîáû îáðàçöû äëÿ àìèíîêèñëîòíîãî àíàëèçà áûëè ïðèãîòîâëåíû òàêèì îáðàçîì, ÷òîáû êîíöåíòðàöèè àìèíîêèñëîò â ýòèõ îáðàç- öàõ íàõîäèëèñü â ïðåäåëàõ àíàëèòè÷åñêîé îá- ëàñòè (ò.å. â ðàáî÷åé ëèíåéíîé îáëàñòè) èñïîëü- çóåìîé ìåòîäèêè ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ òî÷íûõ è âîñïðîèçâîäèìûõ ðåçóëüòàòîâ. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîýôôèöèåíòà ñèãíàëàêà- æäîé àìèíîêèñëîòû àíàëèçèðóþò îò 4 äî 6 êîí- öåíòðàöèé ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà. Êîýôôèöèåíò ñèãíàëàðàññ÷èòûâàåòñÿ êàê ñðåäíåå çíà÷åíèå ïëîùàäè èëè âûñîòû ïèêà íà 1 íìîëü (10–9 ìîëü) àìèíîêèñëîòû, ïðèñóòñòâóþùåéâ ñòàíäàðòíîì îáðàçöå. Êîýôôèöèåíòû ñèãíàëà- 126 êàæäîé àìèíîêèñëîòû èñïîëüçóþò äëÿ ðàñ÷åòà êîíöåíòðàöèè êàæäîé àìèíîêèñëîòû, ïðåäñòàâ- ëåííîé â èñïûòóåìîì îáðàçöå.
Êîëè÷åñòâî âå- ùåñòâà (íìîëü) àíàëèçèðóåìîé àìèíîêèñëîòû ðàññ÷èòûâàþò ïóòåì äåëåíèÿ ïëîùàäè ïèêà, ñî- îòâåòñòâóþùåãî äàííîé àìèíîêèñëîòå, íà êîýô- ôèöèåíò ñèãíàëàýòîé àìèíîêèñëîòû. Äëÿ ðó- òèííîãî àíàëèçà ìîæåò áûòü äîñòàòî÷íî êàëèá- ðîâêè ïî îäíîé òî÷êå; ïðè ýòîì êàëèáðîâêà ïî êîýôôèöèåíòàì ñèãíàëà êàæäîé àìèíîêèñëîòû äîëæíà ÷àñòî îáíîâëÿòüñÿ è ïðîâåðÿòüñÿ äëÿ êîíòðîëÿ äîñòîâåðíîñòè. ÏÎÂÒÎÐßÅÌÎÑÒÜ Ïîëíûé àìèíîêèñëîòíûéàíàëèç òðåáóåò îò àíàëèòè÷åñêîé ëàáîðàòîðèè êîíòðîëÿ ïîâòîðÿå- ìîñòè ðåçóëüòàòîâ êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëå- íèÿ. Âî âðåìÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ àìèíîêèñëîò èëè èõ ïðîèçâîäíûõ íà õðîìàòî- ãðàììå íàáëþäàåòñÿ ìíîæåñòâî ïèêîâ, îòíîñÿ- ùèõñÿ ê àìèíîêèñëîòàì. Áîëüøîå êîëè÷åñòâî ïèêîâ äåëàåò íåîáõîäèìûì íàëè÷èå ïðîãðàìì- íîãî îáåñïå÷åíèÿ, ñïîñîáíîãî íåîäíîêðàòíî èäåíòèôèöèðîâàòü ïèêè, îñíîâûâàÿñü íà âðåìå- íè óäåðæèâàíèÿ, è èíòåãðèðîâàòü ïëîùàäè ïè- êîâ äëÿ êîëè÷åñòâåííûõ ðàñ÷åòîâ. Òèïè÷íàÿ îöåíêà ïîâòîðÿåìîñòè âêëþ÷àåò ïðèãîòîâëåíèå ñòàíäàðòíîãî ðàñòâîðà àìèíîêèñëîò è àíàëèç ìíîãîêðàòíûõ ïîâòîðíûõ ââîäîâ ïðîáû (íàïðè- ìåð, 6 èëè áîëåå ïîâòîðíûõ ââîäîâ) îäíîãî è òîãî æå ñòàíäàðòíîãî ðàñòâîðà. Îïðåäåëÿþò îò- íîñèòåëüíîå ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå çíà÷åíèé âðåìåíè óäåðæèâàíèÿ è èíòåãðèðîâàííîé ïëî- ùàäè ïèêà êàæäîé àìèíîêèñëîòû. Îöåíêó ïî- âòîðÿåìîñòè äîïîëíÿþò âêëþ÷åíèåì ìíîãî- êðàòíûõ êîëè÷åñòâåííûõ îïðåäåëåíèé, ïðîâî- äèìûõ â òå÷åíèå íåñêîëüêèõ äíåé ðàçíûìè àíàëèòèêàìè. Ìíîãîêðàòíûå êîëè÷åñòâåííûå îïðåäåëåíèÿ âêëþ÷àþò ïðèãîòîâëåíèå ñòàí- äàðòíûõ ðàçâåäåíèé èç èñõîäíûõ ìàòåðèàëîâ äëÿ îïðåäåëåíèÿ ðàçëè÷èé ðåçóëüòàòîâ, âîçíè- êàþùèõ èç-çà ìàíèïóëÿöèé ñ îáðàçöîì. Ïðè îöåíêå ïîâòîðÿåìîñòè ÷àñòî ïðîâîäÿò àìèíî- êèñëîòíûéàíàëèç ñîñòàâà ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà áåëêà (íàïðèìåð, áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáó- ìèí). Íà îñíîâå îöåíêè îòíîñèòåëüíûõ ñòàí- äàðòíûõ îòêëîíåíèé ëàáîðàòîðèÿ ðàññ÷èòûâàåò àíàëèòè÷åñêèå ïðåäåëû äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ òîãî, ÷òî àíàëèçû â äàííîé ëàáîðàòîðèè ïðîâå- äåíû íàäëåæàùèì îáðàçîì. Äëÿ ãàðàíòèðîâà- íèÿ íàèëó÷øèõ ðåçóëüòàòîâ æåëàòåëüíî óñòàíî- âèòü íàèìåíüøèå ïðàêòè÷åñêèå ïðåäåëû îòêëî- íåíèé. Ôàêòîðû, íà êîòîðûå ñëåäóåò îáðàòèòü âíèìàíèå äëÿ óìåíüøåíèÿ îòêëîíåíèé â ðåçóëü- òàòàõ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà, âêëþ÷àþò ïðè- ãîòîâëåíèå îáðàçöà, âûñîêèå ôîíîâûå ñïåê- òðàëüíûå ïîìåõè èç-çà êà÷åñòâà ðåàêòèâîâ è/èëè ëàáîðàòîðíûõ ìàíèïóëÿöèé, ðàáîòó è îá- ñëóæèâàíèå ïðèáîðîâ, àíàëèç è èíòåðïðåòàöèþ äàííûõ, ïðîôåññèîíàëüíûå êà÷åñòâà àíàëèòèêà è åãî ñîñòîÿíèå. Âñå ïàðàìåòðû, î êîòîðûõ èäåò ðå÷ü, äîëæíû âñåñòîðîííå èññëåäîâàòüñÿ â ðàì- êàõ ïðîâåäåíèå âàëèäàöèè. ÏÐÈÃÎÒÎÂËÅÍÈÅ ÎÁÐÀÇÖÀ òî÷íîñòü ðåçóëüòàòîâ àìèíîêèñëîòíîãî àíà- ëèçà òðåáóåò èñïîëüçîâàíèÿ î÷èùåííûõ îáðàç- öîâ áåëêîâ è ïåïòèäîâ. Êîìïîíåíòû áóôåðà (íà- ïðèìåð, ñîëè, ìî÷åâèíà, äåòåðãåíòû) ìîãóò ïî- âëèÿòü íà àìèíîêèñëîòíûé àíàëèç è äîëæíû óäàëÿòüñÿ èç îáðàçöà ïåðåä àíàëèçîì.  ìåòîäè- êàõ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïîñòêîëîíî÷íîé äåðèâà- òèçàöèåé àìèíîêèñëîò, êîìïîíåíòû áóôåðà îáû÷íî íå îêàçûâàþò çíà÷èìîãî âëèÿíèÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìåòîäèêàìè ñ ïðåäêîëîíî÷íîé äå- ðèâàòèçàöèåé. Æåëàòåëüíî îãðàíè÷èòü ÷èñëî îïåðàöèé ñ îáðàçöîì äëÿ óìåíüøåíèÿ ïîòåíöè- àëüíî âîçìîæíîãî ôîíîâîãî çàãðÿçíåíèÿ, óëó÷- øåíèÿ îòêðûâàåìîñòè àíàëèçèðóåìîãî âåùåñò- âà è óìåíüøåíèÿ òðóäîçàòðàò.
Îáùèå òåõíè÷å- ñêèå ïðèåìû, êîòîðûå èñïîëüçóþòñÿ äëÿ óäàëåíèÿ êîìïîíåíòîâ áóôåðà èç îáðàçöîâ áåë- êà, âêëþ÷àþò ñëåäóþùèå ìåòîäû: (1) ââåäåíèå îáðàçöà áåëêà â îáðàùåííî-ôàçîâóþ ñèñòåìó ÂÝÆÕ, óäàëåíèå áåëêà ñ ïîìîùüþ ëåòó÷åãî ðàñòâîðèòåëÿ, ñîäåðæàùåãî äîñòàòî÷íîå êîëè- ÷åñòâî îðãàíè÷åñêîãî êîìïîíåíòà, è âûñóøèâà- íèå îáðàçöà â âàêóóìíîé öåíòðèôóãå; (2) äèàëèç ñ ëåòó÷èì áóôåðíûì ðàñòâîðîì èëè âîäîé; (3) óëüòðàôèëüòðàöèîííîå öåíòðèôóãèðîâàíèå äëÿ çàìåíû áóôåðà ëåòó÷èì áóôåðíûì ðàñòâîðîì èëè âîäîé; (4) îñàæäåíèå áåëêà èç áóôåðíîãî ðàñòâîðà ñ èñïîëüçîâàíèåì îðãàíè÷åñêîãî ðàñ- òâîðèòåëÿ (íàïðèìåð, àöåòîíà); (5) ãåëü-ôèëüò- ðàöèþ. ÂÍÓÒÐÅÍÍÈÅ ÑÒÀÍÄÀÐÒÛ Âíóòðåííèé ñòàíäàðò ðåêîìåíäóåòñÿ èñ- ïîëüçîâàòü äëÿ êîíòðîëÿ ôèçè÷åñêèõ è õèìè÷å- ñêèõ ïîòåðü è èçìåíåíèé â õîäå àìèíîêèñëîòíî- ãî àíàëèçà. Ïåðåä ãèäðîëèçîì ê ðàñòâîðó áåëêà ìîæåò áûòü ïðèáàâëåíî òî÷íî èçâåñòíîå êîëè- ÷åñòâî âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà. Îòêðûâàåìîñòü 127 âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà óêàçûâàåò íà îáùóþ îò- êðûâàåìîñòü àìèíîêèñëîò áåëêîâîãî ðàñòâîðà. Îäíàêî ñâîáîäíûå àìèíîêèñëîòû âåäóò ñåáÿ èíà÷å, ÷åì àìèíîêèñëîòû áåëêà âî âðåìÿ ãèäðî- ëèçà, ñêîðîñòü âûñâîáîæäåíèÿ êîòîðûõ âñåãäà ðàçíàÿ. Ïîýòîìó èñïîëüçîâàíèå âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà äëÿ ââåäåíèÿ ïîïðàâêè íà ïîòåðè â õîäå ãèäðîëèçà ìîæåò äàâàòü íåäîñòîâåðíûåðå- çóëüòàòû, ÷òî íåîáõîäèìî ó÷èòûâàòü ïðè èõ èí- òåðïðåòàöèè. Âíóòðåííèå ñòàíäàðòû òàêæå ìî- ãóò äîáàâëÿòüñÿ ê ñìåñè àìèíîêèñëîò ïîñëå ãèäðîëèçà äëÿ ââåäåíèÿ ïîïðàâêè íà ðàçëè÷èÿ âî ââåäåíèÿõ ïðîáû îáðàçöà, íà èçìåíÿþùóþñÿ ñòàáèëüíîñòü ðåàêòèâîâ è íà îòêëîíåíèÿ ñêîðî- ñòè ïîäâèæíîé ôàçû.  èäåàëüíîì ñëó÷àå â êà- ÷åñòâå âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà èñïîëüçóþò êîì- ìåð÷åñêè äîñòóïíóþ àìèíîêèñëîòó, êîòîðàÿ îò- ëè÷àåòñÿ îò ïðèðîäíûõ àìèíîêèñëîò. Êðîìå òîãî, âíóòðåííèé ñòàíäàðò äîëæåí áûòü ñòà- áèëüíûì â õîäå ãèäðîëèçà, åãî êîýôôèöèåíò ñèãíàëàäîëæåí èìåòü ëèíåéíóþ çàâèñèìîñòü îò êîíöåíòðàöèè è âûõîäèòü èç õðîìàòîãðàôè÷å- ñêîé êîëîíêè ñî ñâîéñòâåííûì òîëüêî ýòîìó ñòàíäàðòó âðåìåíåì óäåðæèâàíèÿ áåç ïåðåêðû- âàíèÿ ïèêîâ äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Íàèáîëåå ÷àñ- òî èñïîëüçóåìûå ñòàíäàðòíûå îáðàçöû àìèíî- êèñëîò âêëþ÷àþò íîðëåéöèí, íèòðîòèðîçèí è á-àìèíîìàñëÿíóþ êèñëîòó. ÃÈÄÐÎËÈÇ ÁÅËÊΠÄëÿ àìèíîêèñëîòíîãîàíàëèçà áåëêîâ è ïåï- òèäîâ íåîáõîäèìî ïðîâîäèòü ãèäðîëèç. Ëàáîðà- òîðíàÿ ïîñóäà, èñïîëüçóåìàÿ äëÿ ïðîâåäåíèÿ ãèäðîëèçà, äîëæíà áûòü î÷åíü ÷èñòîé. Îïóäðè- âàþùèé ïîðîøîê äëÿ ïåð÷àòîê, à òàêæå îòïå- ÷àòêè ïàëüöåâ íà ïîñóäå, â êîòîðîé ïðîâîäèòñÿ ãèäðîëèç, ìîãóò ïðèâåñòè ê çàãðÿçíåíèþ. Äëÿ î÷èñòêè ñòåêëÿííûõ ïðîáèðîê äëÿ ïðîâåäåíèÿ ãèäðîëèçà èñïîëüçóþò êèïÿ÷åíèå â òå÷åíèå 1 ÷ â 1 Ì ðàñòâîðå õëîðîâîäîðîäíîé êèñëîòû èëè çàìà÷èâàíèå â êîíöåíòðèðîâàííîé àçîòíîé êè- ñëîòå èëè â ñìåñè èç ðàâíûõ îáúåìîâ êîíöåí- òðèðîâàííûõ õëîðîâîäîðîäíîé è àçîòíîé êè- ñëîò. ×èñòûå ïðîáèðêè, èñïîëüçóåìûå äëÿ ãèä- ðîëèçà, ïðîìûâàþò âîäîé âûñîêîî÷èùåííîé, çàòåì îïîëàñêèâàþò ìåòàíîëîì äëÿ õðîìàòîãðà- ôèè, ñóøàòâ ñóøèëüíîì øêàôó â òå÷åíèå íî÷è è õðàíÿò çàêðûòûìè âïëîòü äî èñïîëüçîâàíèÿ. Äëÿ óäàëåíèÿ çàãðÿçíåíèÿ èç ïðîáèðîê, êîòîðûå èñïîëüçóþòñÿ äëÿ ãèäðîëèçà, òàêæå ìîæíî èñ- ïîëüçîâàòü ïðîêàëèâàíèå ÷èñòîé ñòåêëÿííîé ïîñóäû ïðè òåìïåðàòóðå 500 °Ñ â òå÷åíèå 4 ÷. Äîïóñêàåòñÿ èñïîëüçîâàíèå ñîîòâåòñòâóþùèõ îäíîðàçîâûõ ëàáîðàòîðíûõ ïðèíàäëåæíîñòåé. Êèñëîòíûé ãèäðîëèç ÿâëÿåòñÿ íàèáîëåå ÷àñ- òî èñïîëüçóåìûì ìåòîäîì äëÿ ðàñùåïëåíèÿ áåëêà ïåðåä ïðîâåäåíèåì àìèíîêèñëîòíîãî àíà- ëèçà.
Ìåòîä êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà ìîæåò ïî- âëèÿòü íà îòêëîíåíèå ðåçóëüòàòîâ àíàëèçà èç-çà ïîëíîãî èëè ÷àñòè÷íîãî ðàçðóøåíèÿ íåêîòîðûõ àìèíîêèñëîò: òðèïòîôàí ðàçðóøàåòñÿ, ñåðèí è òðåîíèí ÷àñòè÷íî ðàçðóøàþòñÿ, ìåòèîíèí ìî- æåò ïîäâåðãàòüñÿ îêèñëåíèþ, à öèñòåèí îáû÷íî îïðåäåëÿåòñÿ êàê öèñòèí (íî îòêðûâàåìîñòüöè- ñòèíà îáû÷íî íèçêàÿ âñëåäñòâèå ÷àñòè÷íîãî ðàçðóøåíèÿ èëè âîññòàíîâëåíèÿ äî öèñòåèíà). Ïðèìåíåíèå ñîîòâåòñòâóþùåãî âàêóóìà (ìåíåå 200 ìêì ðòóòíîãî ñòîëáà, èëè 26,7 Ïà) èëè ââå- äåíèå èíåðòíîãî ãàçà (àðãîíà) â ïðîñòðàíñòâî ðåàêöèîííîãî ñîñóäà ìîæåò óìåíüøèòü ñòåïåíü îêèñëèòåëüíîé äåñòðóêöèè.  ïåïòèäíûõ ñâÿ- çÿõ, îáðàçîâàííûõ èçîëåéöèíîì è âàëèíîì, àìèäíûå ãðóïïû Èëå-Èëå, Âàë-Âàë, Èëå-Âàë è Âàë-Èëå ãèäðîëèçóþòñÿ÷àñòè÷íî; àñïàðàãèí è ãëóòàìèíäåçàìèäèðóþòñÿ ñ îáðàçîâàíèåì ñîîò- âåòñòâåííî àñïàðàãèíîâîé è ãëóòàìèíîâîé êè- ñëîò. Ïîòåðÿ òðèïòîôàíà, àñïàðàãèíà è ãëóòàìè- íà â õîäå êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà îãðàíè÷èâàåò êîëè÷åñòâåííîå îïðåäåëåíèå äî 17 àìèíîêèñ- ëîò. Íåêîòîðûå èç îïèñàííûõ íèæå ìåòîäîâ êè- ñëîòíîãî ãèäðîëèçà èñïîëüçóþòñÿ äëÿ ðåøåíèÿ ýòèõ çàäà÷. Íåêîòîðûå ìåòîäû ãèäðîëèçà (íà- ïðèìåð, ìåòîäû 4 – 11) ìîãóò ïðèâîäèòü ê ïðå- âðàùåíèÿì â äðóãèå àìèíîêèñëîòû. Ïîýòîìó ïðåèìóùåñòâà èñïîëüçîâàíèÿ êîíêðåòíîé ìåòî- äèêè îöåíèâàþòñÿ îòíîñèòåëüíî çàäà÷, ðåøàå- ìûõ ñ åå ïîìîùüþ, è âñåñòîðîííå èçó÷àþòñÿ ïåðåä âûáîðîì ìåòîäèêè, îòëè÷àþùåéñÿ îò îáû÷íîãî êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ èñõîäíîé êîíöåíòðàöèè àìèíîêèñëîò, êîòîðûå ÷àñòè÷íî ðàçðóøàþòñÿ èëè ìåäëåííî îòùåïëÿþòñÿ, ÷àñòî èñïîëüçóþò èññëåäîâàíèå ãèäðîëèçà âî âðåìåíè (àìèíîêèñ- ëîòíûé àíàëèç ïðè êèñëîòíîì ãèäðîëèçå â òå÷å- íèå 24 ÷, 48 ÷ è 72 ÷). Ïóòåì ïîñòðîåíèÿ ãðàôè- êà çàâèñèìîñòè íàéäåííîé êîíöåíòðàöèè ëà- áèëüíûõ àìèíîêèñëîò (íàïðèìåð, ñåðèíà è òðåîíèíà) îò âðåìåíè ãèäðîëèçà è ýêñòðàïîëÿ- öèè ïîëó÷åííîé êðèâîé ê íà÷àëó êîîðäèíàò îï- ðåäåëÿþò èñõîäíóþ êîíöåíòðàöèþ ýòèõ àìèíî- êèñëîò. Êîíöåíòðàöèþ îñòàòêîâ àìèíîêèñëîò, êîòîðûå ìåäëåííî îòùåïëÿþòñÿ (íàïðèìåð, èçîëåéöèí è âàëèí), ïðèíèìàþò ðàâíîé âûñîòå ïëàòî íà ïîëó÷åííîì ãðàôèêå çàâèñèìîñòè êîí- 128 öåíòðàöèè îñòàòêîâ îò âðåìåíè ãèäðîëèçà. Åñëè ãèäðîëèç áóäåò ïðîòåêàòü ñëèøêîì äîëãî, êîí- öåíòðàöèÿ îñòàòêîâ àìèíîêèñëîò â îáðàçöå íà÷- íåò óìåíüøàòüñÿ, ÷òî óêàçûâàåòíà èõ ðàçðóøå- íèå ïðè äàííûõ óñëîâèÿõ ãèäðîëèçà. Ïðèåìëåìîé àëüòåðíàòèâîé èññëåäîâàíèþ ãèäðîëèçà âî âðåìåíè ÿâëÿåòñÿ ïðîâåäåíèå ãèä- ðîëèçà ñòàíäàðòà àìèíîêèñëîò ñ èçâåñòíûìè êîíöåíòðàöèÿìè â òàêèõæå óñëîâèÿõ, ÷òî è äëÿ èñïûòóåìîãî îáðàçöà. Àìèíîêèñëîòû â ñâîáîä- íîì ñîñòîÿíèè íå ìîãóò â ïîëíîé ìåðå îòðàæàòü ñêîðîñòü äåñòðóêöèè ïðè ãèäðîëèçîëàáèëüíûõ àìèíîêèñëîò, âõîäÿùèõ â ñîñòàâ ïåïòèäîâ èëè áåëêîâ. Ýòî îñîáåííî ñïðàâåäëèâî äëÿ ìåäëåí- íî ðàñùåïëÿþùèõñÿ ïåïòèäíûõ ñâÿçåé (íàïðè- ìåð, ñâÿçè Èëå-Âàë). Îäíàêî äàííàÿìåòîäèêà ïîçâîëÿåò àíàëèòèêó ó÷åñòü ëèøü íåêîòîðóþ ÷àñòü ðàçðóøàþùèõñÿ àìèíîêèñëîò. Âîçìîæíî ïðèìåíåíèå êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà ñ èñïîëüçî- âàíèåì ìèêðîâîëíîâîãî èçëó÷åíèÿ, êîòîðûé îò- ëè÷àåòñÿ áûñòðîòîé, íî òðåáóåò ñïåöèàëüíîãî îáîðóäîâàíèÿ, à òàêæå ñïåöèàëüíûõ ìåð ïðå- äîñòîðîæíîñòè. Îïòèìàëüíûå óñëîâèÿ ãèäðî- ëèçà ñ èñïîëüçîâàíèåì ìèêðîâîëíîâîãî èçëó÷å- íèÿ äîëæíû áûòü óñòàíîâëåíû äëÿ êàæäîãî îò- äåëüíîãî áåëêîâîãî/ïðîòåèíîâîãî îáðàçöà. Ìèêðîâîëíîâûé ãèäðîëèç îáû÷íî ïðîòåêàåò â òå÷åíèå íåñêîëüêèõ ìèíóò, íî îòêëîíåíèå äàæå â îäíó ìèíóòó ìîæåò ïðèâåñòè ê íåóäîâëåòâî- ðèòåëüíûì ðåçóëüòàòàì (íàïðèìåð, íåïîëíûé ãèäðîëèç èëè ðàçðóøåíèå ëàáèëüíûõ àìèíîêèñ- ëîò). Ïîëíûé ïðîòåîëèç ñ ïðèìåíåíèåì ñìåñè ïðîòåàç ìîæåò áûòü ñëèøêîì ñëîæíûì, îí òðå- áóåò íàäëåæàùåãî êîíòðîëÿ è îáû÷íî áîëåå ïîäõîäèò äëÿ ïåïòèäîâ, ÷åì äëÿ áåëêîâ.
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ îïòèìàëüíûõ óñëîâèé â õîäå ïåðâîíà÷àëüíîãî àíàëèçà áåëêà íåèçâåñò- íîãî ñîñòàâà ïðîâîäÿòñÿ ýêñïåðèìåíòû ñ ðàç- ëè÷íûìè âðåìåíàìè ãèäðîëèçà è ïðè ðàçíûõ òåìïåðàòóðíûõ ðåæèìàõ. ÌÅÒÎÄ 1 Êèñëîòíûé ãèäðîëèç ñ èñïîëüçîâàíèåì õëî- ðîâîäîðîäíîé êèñëîòû, ñîäåðæàùåé ôåíîë, ÿâëÿåòñÿ íàèáîëåå îáùåé ïðîöåäóðîé, èñïîëü- çóåìîé äëÿ ãèäðîëèçà áåëêà/ïåïòèäà ïðè àìèíî- êèñëîòíîìàíàëèçå. Äîáàâëåíèå ôåíîëà ïðåäó- ïðåæäàåò ðåàêöèþ ãàëîãåíèðîâàíèÿ òèðîçèíà. Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð. 6 Ì ðàñòâîð õëî- ðîâîäîðîäíîé êèñëîòû, ñîäåðæàùèé, îò 0,1 % äî 1,0 % ôåíîëà. Ìåòîäèêà Æèäêîôàçíûé ãèäðîëèç. Îáðàçåö áåëêà èëè ïåïòèäà ïîìåùàþò â àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà è âûñóøèâàþò (îáðàçåö ñóøàòäëÿ òîãî, ÷òîáû âîäà â îáðàçöå íå ðàçáàâëÿëàêèñëîòó, èñïîëü- çóåìóþ äëÿ ãèäðîëèçà). Ïðèáàâëÿþò ãèäðîëè- çóþùèé ðàñòâîð èç ðàñ÷åòà 200 ìêë íà 500 ìêã ëèîôèëèçèðîâàííîãî áåëêà. Îáðàçåö â àìïóëå çàìîðàæèâàþò â áàíå ñ ñóõèì ëüäîì è àöåòîíîì è çàïàèâàþò â âàêóóìå ïðè ïîìîùè ïëàìåíè. Îáðàçöû îáû÷íî ãèäðîëèçóþò ïðè òåìïåðàòóðå 110 °Ñ â òå÷åíèå 24 ÷ â âàêóóìå èëè â àòìîñôåðå èíåðòíîãî ãàçà äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ îêèñëåíèÿ. Åñëè åñòü ïîäîçðåíèå, ÷òî èñïûòóåìûé áåëîê ïîëíîñòüþ íå ãèäðîëèçóåòñÿ, ðàññìàòðèâàþò âîçìîæíîñòü ïðîâåäåíèÿ ãèäðîëèçà â òå÷åíèå áîëåå ïðîäîëæèòåëüíîãîâðåìåíè (íàïðèìåð, 48 ÷ è 72 ÷). Ïàðîôàçíûé ãèäðîëèç. Ýòî îäèí èç íàèáî- ëåå îáùèõ ìåòîäîâ êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà. Îí ïðåäïî÷òèòåëåí äëÿ ìèêðîàíàëèçà, êîãäà äîñ- òóïíû ëèøü íåáîëüøèå êîëè÷åñòâà îáðàçöà. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ïàðîôàçíîãî ãèäðîëèçà êîí- òàìèíàöèÿ îáðàçöà êèñëîòíûìè ðåàêòèâàìè ìè- íèìèçèðîâàíà. Ôëàêîíû ñ âûñóøåííûìè îáðàç- öàìè ïîìåùàþò â ñîñóä, ñîäåðæàùèé ïîäõîäÿ- ùåå êîëè÷åñòâî ãèäðîëèçóþùåãî ðàñòâîðà. Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð íå äîëæåí êîíòàêòèðî- âàòü ñ èñïûòóåìûì îáðàçöîì.  ñâîáîäíîì ïðî- ñòðàíñòâå ñîñóäà ñîçäàþò èíåðòíóþàòìîñôåðó èëè âàêóóì (ìåíåå 200 ìêì ðòóòíîãî ñòîëáà, èëè 26,7 Ïà) è äëÿ ïðîâåäåíèÿ ãèäðîëèçà íàãðå- âàþò ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 110 °Ñ â òå÷åíèå 24 ÷. Ïàðû êèñëîòû ãèäðîëèçóþò ñóõîé îáðàçåö. Âîçìîæíîñòü êîíäåíñàöèè êèñëîòû âî ôëàêî- íàõ ñ îáðàçöîì äîëæíà áûòü ñâåäåíà ê ìèíèìó- ìó. Ïîñëå ãèäðîëèçà èñïûòóåìûé îáðàçåö ñó- øàò â âàêóóìå äî óäàëåíèÿ îñòàòêîâ êèñëîòû. ÌÅÒÎÄ 2 Èñïîëüçîâàíèå ìåðêàïòîýòàíñóëüôîíîâîé êèñëîòû â êà÷åñòâå âîññòàíàâëèâàþùåé êèñëî- òû óìåíüøàåò îêèñëåíèå òðèïòîôàíà â ïðîöåñ- ñå ãèäðîëèçà. Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð. 2,5 Ì ðàñòâîð ìåðêàïòîýòàíñóëüôîíîâîé êèñëîòû. Ïàðîôàçíûé ãèäðîëèç. Îò 1 ìêã äî 100 ìêã èñïûòóåìîãî áåëêà/ïåïòèäà ñóøàòâ àì- ïóëå äëÿ ãèäðîëèçà. Àìïóëó ïîìåùàþò â áîëü- øóþ àìïóëó, ñîäåðæàùóþ îêîëî 200 ìêëãèäðî- ëèçóþùåãîðàñòâîðà. Ãåðìåòè÷íî çàïàèâàþò áîëüøóþ àìïóëó â âàêóóìå (îêîëî 50 ìêì ðòóò- 129 íîãî ñòîëáà, èëè 6,7 Ïà). Íàãðåâàþò àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà äî òåìïåðàòóðû îò 170 °Ñ äî 185 °Ñ â òå÷åíèå 12,5 ìèí. Ïîñëå ãèäðîëèçà àìïóëó ñ îá- ðàçöîìñóøàòâ âàêóóìå â òå÷åíèå 15 ìèí äî óäà- ëåíèÿ îñòàòêîâ êèñëîòû. ÌÅÒÎÄ 3 Èñïîëüçîâàíèå òèîãëèêîëåâîé êèñëîòû (ÒÃÊ) â êà÷åñòâå âîññòàíàâëèâàþùåé êèñëîòû ïðåäîòâðàùàåò îêèñëåíèå òðèïòîôàíà ïðè ãèä- ðîëèçå. Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð. 7 Ì ðàñòâîð õëî- ðîâîäîðîäíîé êèñëîòû, ñîäåðæàùèé 1 % ôåíî- ëà, 10 % òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû è 20 % òèîã- ëèêîëåâîéêèñëîòû. Ïàðîôàçíûé ãèäðîëèç. Îò 10 ìêã äî 50 ìêã èñïûòóåìîãî áåëêà/ïåïòèäà âûñóøèâà- þò â àìïóëå äëÿ ãèäðîëèçà. Àìïóëó äëÿ ãèäðî- ëèçà ïîìåùàþò â áîëüøóþ àìïóëó, ñîäåðæà- ùóþ îêîëî 200 ìêëãèäðîëèçóþùåãîðàñòâîðà. Áîëüøóþ àìïóëó ãåðìåòè÷íî çàïàèâàþò â âà- êóóìå (îêîëî 50 ìêì ðòóòíîãî ñòîëáà, èëè 6,7 Ïà). Íàãðåâàþò àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà äî òåìïåðàòóðû 166 °Ñ â òå÷åíèå 15 – 30 ìèí. Ïî- ñëå ãèäðîëèçà äëÿ óäàëåíèÿ îñòàòêîâ êèñëîòû- àìïóëó ñ îáðàçöîì ñóøàò â âàêóóìå â òå÷åíèå 5 ìèí.
Îêðûâàåìîñòü òðèïòîôàíà â ýòîì ìåòîäå çàâèñèò îò êîëè÷åñòâà èñïûòóåìîãî îáðàçöà. ÌÅÒÎÄ 4 Ïåðåä ãèäðîëèçîì áåëêà ïðîâîäÿò îêèñëå- íèå öèñòåèíà/öèñòèíà è ìåòèîíèíà íàäìóðàâü- èíîéêèñëîòîé. Îêèñëÿþùèé ðàñòâîð. Ñìåøèâàþò 1 îáú- åì 30% ðàñòâîðà âîäîðîäà ïåðîêñèäà è 9 îáúå- ìîâ ìóðàâüèíîé êèñëîòû áåçâîäíîé è âûäåðæè- âàþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 1 ÷. Ïîëó÷åííóþ íàäìóðàâüèíóþ êèñëîòó èñïîëüçó- þò ñâåæåïðèãîòîâëåííîé. Ìåòîäèêà. Îáðàçåö áåëêà/ïåïòèäà ðàñòâî- ðÿþò â 20 ìêë ìóðàâüèíîé êèñëîòû áåçâîäíîé, íàãðåâàþò ïðè òåìïåðàòóðå 50 °Ñ â òå÷åíèå 5 ìèí è ïðèáàâëÿþò 100 ìêë îêèñëÿþùåãî ðàñ- òâîðà. Ïðîöåññ îêèñëåíèÿ ïðîâîäÿò â òå÷åíèå 10 – 30 ìèí.  äàííîéðåàêöèè öèñòåèí ïðåâðà- ùàåòñÿ â öèñòåèíîâóþ êèñëîòó, à ìåòèîíèí — â ìåòèîíèíñóëüôîí. Èçáûòîê ðåàêòèâà óäàëÿþò èç îáðàçöà ïðè ïîìîùè âàêóóìíîãî öåíòðèôó- ãèðîâàíèÿ. Îêèñëåííûé áåëîê ìîæåò áûòü çà- òåì ãèäðîëèçîâàí ïî ìåòîäó 1 èëè ìåòîäó 2. Ïðè íàëè÷èè ãàëîãåíèäîâ ýòà ìåòîäèêà ìîæåò ïðèâîäèòü ê ìîäèôèêàöèè îñòàòêîâ òèðîçèíà. ÌÅÒÎÄ 5 Îêèñëåíèå öèñòåèíà/öèñòèíà ïðîèñõîäèò âî âðåìÿ æèäêîôàçíîãî ãèäðîëèçà ñ íàòðèÿ àçè- äîì. Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð. Ê 6 Ì ðàñòâîðó õëîðîâîäîðîäíîé êèñëîòû, ñîäåðæàùåìó 0,2 % ôåíîëà, ïðèáàâëÿþò íàòðèÿ àçèä äî ïîëó÷åíèÿ êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 2 ã/ë. Ïðèáàâëåíèå ôå- íîëà ïðåäîòâðàùàåò ãàëîãåíèðîâàíèå òèðîçèíà. Æèäêîôàçíûé ãèäðîëèç. Ãèäðîëèç áåë- êà/ïåïòèäà ïðîâîäÿò ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 110 °Ñ â òå÷åíèå 24 ÷. Âî âðåìÿ ãèäðîëèçà ïðè- ñóòñòâóþùèé â îáðàçöå öèñòåèí/öèñòèí ïðåâðà- ùàåòñÿ â öèñòåèíîâóþêèñëîòó ïîä âîçäåéñòâè- åì íàòðèÿ àçèäà, ñîäåðæàùåãîñÿ â ãèäðîëèçíîì ðàñòâîðå. Ýòà ìåòîäèêà ïðèâîäèò ê ëó÷øåé îò- êðûâàåìîñòè òèðîçèíà, ÷åì ìåòîä 4, íî îíà íå ïîäõîäèò äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ ìå- òèîíèíà. Ìåòèîíèí ïðåâðàùàåòñÿ â ñìåñü èç ìåòèîíèíà è äâóõ ïðîäóêòîâ åãî îêèñëåíèÿ — ìåòèîíèíñóëüôîêñèäà è ìåòèîíèíñóëüôîíà. ÌÅÒÎÄ 6 Îêèñëåíèå öèñòåèíà/öèñòèíà ïðîèñõîäèò ïîä âîçäåéñòâèåì äèìåòèëñóëüôîêñèäà (ÄÌÑÎ). Ãèäðîëèçóþùèé ðàñòâîð. Ê 6 Ì ðàñòâîðó õëîðîâîäîðîäíîé êèñëîòû, ñîäåðæàùåìó îò 0,1 % äî 1,0 % ôåíîëà, ïðèáàâëÿþò ÄÌÑÎ äî ïîëó÷åíèÿ ðàñòâîðà ñ êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèåé 2 % (îá/îá). Ïàðîôàçíûé ãèäðîëèç. Ãèäðîëèç áåë- êà/ïåïòèäà ïðîâîäÿò ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 110 °Ñ â òå÷åíèå 24 ÷. Âî âðåìÿ ãèäðîëèçà ïðè- ñóòñòâóþùèé â îáðàçöå öèñòåèí/öèñòèí ïðåâðà- ùàåòñÿ â öèñòåèíîâóþêèñëîòó ïîä âîçäåéñòâè- åì ÄÌÑÎ, ñîäåðæàùåãîñÿ â ãèäðîëèçíîì ðàñ- òâîðå. Ñ öåëüþ îãðàíè÷åíèÿ ðàçáðîñà äàííûõ è êîìïåíñàöèè ÷àñòè÷íîãî ðàçðóøåíèÿ ðåêîìåí- äóåòñÿ îöåíèâàòü îòêðûâàåìîñòü öèñòåèíîâîé êèñëîòû ïðè îêèñëèòåëüíîì ãèäðîëèçå ñòàí- äàðòíîãî îáðàçöà áåëêà, ñîäåðæàùåãî 1—8 îñ- òàòêîâ öèñòåèíà. Êîýôôèöèåíò ñèãíàëà ãèäðî- ëèçàòà áåëêà/ïåïòèäà îáû÷íî íà 30 % íèæå, ÷åì äëÿ íåãèäðîëèçîâàííîãî ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà öèñòåèíîâîé êèñëîòû. Òàê êàê ãèñòèäèí, ìåòèî- íèí, òèðîçèí è òðèïòîôàí òàêæå ìîäèôèöèðó- þòñÿ, ïîëíûé àíàëèç ñîñòàâà ïðè èñïîëüçîâà- íèè ýòîé ìåòîäèêè íåâîçìîæåí. 130 ÌÅÒÎÄ 7 Âîññòàíîâëåíèå è àëêèëèðîâàíèå öèñòåè- íà/öèñòèíà ïðîèñõîäèò ïðè ïèðèäèëýòèëèðîâà- íèè â ïàðîâîé ôàçå. Âîññòàíàâëèâàþùèé ðàñòâîð. 83,3 ìêë ïèðèäèíà, 16,7 ìêë 4-âèíèëïèðèäèíà, 16,7 ìêë òðèáóòèëôîñôèíà è 83,3 ìêë âîäû ïîìåùàþò â ïîäõîäÿùèé êîíòåéíåð è ïåðåìåøèâàþò. Ìåòîäèêà. Àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà ñ îáðàç- öîì áåëêà/ïåïòèäà (îò 1 ìêã äî 100 ìêã) ïîìå- ùàþò â áîëüøóþ àìïóëó. Ïåðåíîñÿò âîññòàíàâ- ëèâàþùèé ðàñòâîð â áîëüøóþ àìïóëó, ãåðìå- òè÷íî çàïàèâàþò â âàêóóìå (îêîëî 50 ìêì ðòóòíîãî ñòîëáà, èëè 6,7 Ïà) è íàãðåâàþò ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 100 °Ñ â òå÷åíèå 5 ìèí. Çà- òåì âíóòðåííþþ àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà ïîìå- ùàþò â âàêóóìíûé ýêñèêàòîð è ñóøàòâ òå÷åíèå 15 ìèí äëÿ óäàëåíèÿ îñòàòêîâ ðåàêòèâîâ.
Ïèðè- äèëýòèëèðîâàííûé îáðàçåö çàòåì ãèäðîëèçóþò ñîãëàñíî îïèñàííîé ðàíåå ìåòîäèêå. Äëÿ îöåí- êè îòêðûâàåìîñòèïèðèäèëýòèëöèñòåèíà ïàðàë- ëåëüíî ïðîâîäÿò ðåàêöèþ ïèðèäèëýòèëèðîâà- íèÿ ñòàíäàðòíîãî îáðàçöà áåëêà, ñîäåðæàùåãî 1 – 8 îñòàòêîâ öèñòåèíà. Äëèòåëüíîå âðåìÿ èí- êóáàöèè ïðè ðåàêöèè ïèðèäèëýòèëèðîâàíèÿ ìî- æåò áûòü ïðè÷èíîé ìîäèôèêàöèè êîíöå- âûõá-àìèíîãðóïï è e-àìèíîãðóïï ëèçèíà â áåë- êå. ÌÅÒÎÄ 8 Âîññòàíîâëåíèå è àëêèëèðîâàíèå öèñòåè- íà/öèñòèíà ïðîèñõîäèò ïðè ïèðèäèëýòèëèðîâà- íèè â æèäêîé ôàçå. Èñõîäíûå ðàñòâîðû. Ãîòîâÿò è ôèëüòðóþò 3 ðàñòâîðà: 1 Ì ðàñòâîð òðèñ-ãèäðîõëîðèäà ñ ðÍ 8,5, ñîäåðæàùèé 0,004 Ì äèíàòðèÿýäåòàòà (èñõîäíûé ðàñòâîð À); 8 Ì ðàñòâîð ãóàíèäèíà ãèäðîõëîðèäà (èñõîäíûé ðàñòâîð Â); 10 % ðàñ- òâîð 2-ìåðêàïòîýòàíîëà (èñõîäíûé ðàñòâîð Ñ). Âîññòàíàâëèâàþùèé ðàñòâîð. Äëÿ ïîëó- ÷åíèÿ áóôåðíîãî ðàñòâîðà 6 Ì ðàñòâîðà ãóàíè- äèíà ãèäðîõëîðèäà â 0,25 Ì ðàñòâîðå òðèñ-ãèä- ðîõëîðèäà ñìåøèâàþò 1 îáúåì èñõîäíîãî ðàñ- òâîðà À è 3 îáúåìà èñõîäíîãî ðàñòâîðà Â. Ìåòîäèêà. Îêîëî 10 ìêã èñïûòóåìîãî îá- ðàçöà ðàñòâîðÿþò â 50 ìêë âîññòàíàâëèâàþùåãî ðàñòâîðà è ïðèáàâëÿþò îêîëî 2,5 ìêë èñõîäíîãî ðàñòâîðà Ñ. Âûäåðæèâàþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â çàùèùåííîì îò ñâåòà ìåñòå â àò- ìîñôåðå àçîòà èëè àðãîíà â òå÷åíèå 2 ÷. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèè ïèðèäèíýòèëèðîâàíèÿ ê ðàñòâîðó áåëêà ïðèáàâëÿþò îêîëî 2 ìêë 4-âè- íèëïèðèäèíà è âûäåðæèâàþò äîïîëíèòåëüíî 2 ÷ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â çàùèùåííîì îò ñâåòà ìåñòå. Îáåññîëèâàþò áåëîê/ïåïòèä ìå- òîäîì îáðàùåííî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ, ñîáèðàÿ áåë- êîâóþ/ïåïòèäíóþ ôðàêöèþ. Ïåðåä êèñëîòíûì ãèäðîëèçîì ñîáðàííûé îáðàçåö ìîæåò áûòü âû- ñóøåí ïðè ïîìîùè âàêóóìíîãî öåíòðèôóãèðî- âàíèÿ. ÌÅÒÎÄ 9 Âîññòàíîâëåíèå è àëêèëèðîâàíèå öèñòåè- íà/öèñòèíà ïðîèñõîäèò ïðè êàðáîêñèìåòèëèðî- âàíèè â æèäêîé ôàçå. Èñõîäíûå ðàñòâîðû. Ãîòîâÿò êàê óêàçàíî â Ìåòîäå 8. Ðàñòâîðäëÿ êàðáîêñèìåòèëèðîâàíèÿ. Ãî- òîâÿò ðàñòâîð 100 ã/ë éîäàöåòàìèäà â 96 % ñïèðòå. Áóôåðíûé ðàñòâîð. Èñïîëüçóþò âîññòàíàâ- ëèâàþùèé ðàñòâîð, ïðèãîòîâëåííûé êàê óêàçà- íî â Ìåòîäå 8. Ìåòîäèêà. Èñïûòóåìûé îáðàçåö ðàñòâîðÿ- þò â 50 ìêë áóôåðíîãî ðàñòâîðà è ïðèáàâëÿþò îêîëî 2,5 ìêë èñõîäíîãî ðàñòâîðà Ñ. Âûäåðæè- âàþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â çàùèùåí- íîì îò ñâåòà ìåñòå â àòìîñôåðå àçîòà èëè àðãîíà â òå÷åíèå 2 ÷. Ïðèáàâëÿþò ðàñòâîð äëÿ êàðáîê- ñèìåòèëèðîâàíèÿ â 1,5-êðàòíîì êîëè÷åñòâå îò îáùåãî òåîðåòè÷åñêîãî ñîäåðæàíèÿ òèîëîâ, è âûäåðæèâàþò äîïîëíèòåëüíî â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â çàùèùåííîì îò ñâåòà ìåñòå. Åñëè ñîäåðæàíèå òèîëîâ â áåëêå íåèçâåñòíî, ïðèáàâëÿþò 5 ìêë 0,1 Ì ðàñòâîðà éîäàöåòàìèäà íà êàæäûå 20 íìîëü èñïûòóåìîãî îáðàçöà áåëêà. Äëÿ ïðåêðàùåíèÿ ðåàêöèè ïðè- áàâëÿþò èçáûòîê 2-ìåðêàïòîýòàíîëà. Îáåññîëè- âàþò áåëîê/ïåïòèä ìåòîäîì îáðàùåííî-ôàçî- âîé ÂÝÆÕ, ñîáèðàÿ áåëêîâóþ/ïåïòèäíóþ ôðàê- öèþ. Ïåðåä êèñëîòíûì ãèäðîëèçîì ñîáðàííûé îáðàçåö ìîæåò áûòü âûñóøåí ïðè ïîìîùè âàêó- óìíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ.  ïðîöåññå êèñëîò- íîãî ãèäðîëèçà ïîëó÷åííûé S-êàðáîêñèàìèäî- ìåòèëöèñòåèí áóäåò ïðåâðàùàòüñÿ â S-êàðáîê- ñèìåòèëöèñòåèí. ÌÅÒÎÄ 10 Öèñòåèí/öèñòèí, ïðîðåàãèðîâàâøèé ñ äèòè- îãëèêîëåâîé êèñëîòîé èëè äèòèîäèïðîïèîíî- âîé êèñëîòîé, îáðàçóåò ñìåøàííûé äèñóëüôèä. Âûáîð äèòèîãëèêîëåâîé êèñëîòû èëè äèòèîäè- ïðîïèîíîâîé êèñëîòû çàâèñèò îò òðåáóåìîãî ðàçðåøåíèÿ ìåòîäèêè àìèíîêèñëîòíîãî àíàëè- çà. 131 Âîññòàíàâëèâàþùèé ðàñòâîð. Ðàñòâîð 10 ã/ë äèòèîãëèêîëåâîé êèñëîòû (èëè äèòèîäè- ïðîïèîíîâîé êèñëîòû) â 0,2 Ì ðàñòâîðå íàòðèÿ ãèäðîêñèäà. Ìåòîäèêà. Îêîëî 20 ìêã èñïûòóåìîãî îá- ðàçöà ïîìåùàþò â àìïóëó äëÿ ãèäðîëèçà è ïðè- áàâëÿþò 5 ìêë âîññòàíàâëèâàþùåãî ðàñòâîðà.